MAPK 信號級聯(lián)通路參與Alternaria alternata對梨果表皮信號分子的識別與應(yīng)答

王調(diào)蘭，張苗，李永才，畢陽，張婷婷，鄭曉淵

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

Alternariaalternata是半知菌亞門絲孢綱絲孢目鏈格孢屬(Alternariasp.)的病原物真菌[1]，可引起蘋果、梨、柑橘等多種水果的采后腐爛，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2].前期研究發(fā)現(xiàn)由A.alternata引起的梨果黑斑病為典型的潛伏侵染性病害[3]，該菌孢子可在果實發(fā)育期粘附于果實表面，孢子萌發(fā)形成芽管，芽管伸長后其頂端膨大形成附著胞，部分附著胞進(jìn)一步分化形成侵染菌絲，通過皮孔或表皮傷口侵入果實，且果皮蠟質(zhì)及其疏水性對其侵染結(jié)構(gòu)分化具有誘導(dǎo)作用[4].表皮蠟質(zhì)的化學(xué)組分及物理疏水性作為識別的信號分子在病原物與宿主互作中具有重要作用[5-7].小麥葉片的總蠟提取物[5]可誘導(dǎo)Pucciniagraminis形成附著胞和侵染釘?shù)惹秩窘Y(jié)構(gòu)，大麥表皮蠟層的單體 C26醛[8]及鱷梨果實表皮蠟質(zhì)組分中 C24烷烴和長鏈醇[9]均分別強(qiáng)烈誘導(dǎo)了Blumeriagraminis和Colletotrichumgloeosporioide的附著胞形成，水稻葉片上表皮蠟質(zhì)中的重要組分初級醇是Magnaportheoryzae形成附著胞的識別信號，且M.oryzae的芽管能夠識別水稻葉片表面的高疏水性，從而分化形成附著胞，而在人工親水表面，分生孢子幾乎不產(chǎn)生附著胞[10].同時研究發(fā)現(xiàn)果實表皮蠟質(zhì)化學(xué)組分[11-12]及其物理特性(疏水性)[13]對A.alternata侵染結(jié)構(gòu)的形成以及侵入過程也具有一定促進(jìn)作用[4].果實發(fā)育后期產(chǎn)生的乙烯不僅對果實成熟和衰老過程起著重要的調(diào)控作用[14]，同時也發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)C.gloeosporioides侵染結(jié)構(gòu)的形成[15].但病原物如何響應(yīng)果皮信號進(jìn)而啟動侵染，其調(diào)控機(jī)理仍不清楚.

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK) 信號傳導(dǎo)途徑是真核生物(酵母、植物、哺乳動物)中普遍存在的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，參與調(diào)控細(xì)胞的生長分化、新陳代謝、發(fā)育凋亡、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、光合作用、不良環(huán)境的適應(yīng)、炎癥腫瘤的發(fā)生及病原物的侵染等多種生理過程[16].且對病原真菌生長、發(fā)育、致病性及其細(xì)胞響應(yīng)外界脅迫等方面具有重要的調(diào)控作用[17].目前研究認(rèn)為植物致病真菌能夠感知和響應(yīng)宿主表型特征、疏水性、硬度、表皮蠟質(zhì)、植物脂質(zhì)和植物激素等表面物化特征，隨后，激活病原物 G 蛋白， cAMP / 蛋白激酶 A 和 MAP 激酶等多種信號組分，以調(diào)節(jié)其侵染結(jié)構(gòu)分化和致病過程[18]，其中MAPK途徑起著重要的作用.MAPK是一類普遍存在于真核生物中的絲/蘇氨酸蛋白激酶，由三級酶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)(MAPKKK、MAPKK、MAPK)所構(gòu)成，它通過胞外刺激整合、放大和傳遞信號[17,19-21].真菌中普遍存在 Fus3 / Kss1 型， Hog1 型和 Slt2 型這3種MAPK途徑，其中 Hog1-MAPK 與哺乳動物中 P38-MAPK 具有同源性[22].張海峰[16]研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號途徑參與介導(dǎo)M.oryzae對水稻表面信號的識別及應(yīng)答，且對后期階段附著胞的形成和侵入過程具有重要的調(diào)控作用.同時還發(fā)現(xiàn)MAPK信號途徑中的相關(guān)激酶如M.oryzae的MAP激酶 (Pmk1)、Aspergillusoryzae的 MAP 激酶 (Mps1)[23]、Fusariumoxysporum的 MAP 激酶 (Fmk1 MAPK)[24]、Colletotrichumorbiculare的MAP激酶(CoMekk1)[25]參與了其響應(yīng)植物表皮信號進(jìn)而啟動孢子萌發(fā)、附著胞形成以及隨后的侵入過程.同時Kim等[26]研究發(fā)現(xiàn)C.gloeosporioidesMAPKK 缺失突變株 (ΔCgMEK1) 失去了形成附著胞的能力.迄今為止，許多研究已經(jīng)揭示了植物病原真菌中侵染結(jié)構(gòu)分化所涉及的發(fā)育過程和細(xì)胞信號傳導(dǎo)，但果蔬主要采后病原物A.alternata中MAPK信號級聯(lián)通路是否參與其對果實表皮信號分子的誘導(dǎo)和響應(yīng)過程未見報道.

通過研究MAPK信號級聯(lián)途徑在A.alternata響應(yīng)梨表皮物理化學(xué)信號進(jìn)而啟動侵染中的調(diào)控作用，進(jìn)一步全面揭示果實表皮誘導(dǎo)病原物侵染的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑及調(diào)控機(jī)理，同時為果蔬采后病害的安全控制提供理論依據(jù).因此，本研究通過藥理學(xué)方法，用MAPK信號級聯(lián)通路抑制劑SB203580處理A.alternata孢子懸浮液，研究其對梨果黑斑病侵染的調(diào)控，結(jié)合體外試驗，分析A.alternata響應(yīng)不同疏水表面、蠟質(zhì)提取物和乙烯等信號分子的刺激后對其生長、侵染結(jié)構(gòu)及致病性的影響，以期更好地認(rèn)識和了解A.alternata的MAPK激酶通路在侵染植物過程中的相互關(guān)聯(lián)和作用.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試果實 早酥梨(Pyrusbretchneidericv.‘Zaosu’)于2018年7月購于甘肅省景泰縣條山農(nóng)場采摘無任何機(jī)械傷口及病蟲害的果實.采收后當(dāng)即進(jìn)行單果包裝，然后裝箱，并運(yùn)至冷庫貯藏(4 ℃，RH85%)以待試驗所用.

1.1.2 菌株與培養(yǎng)基 互隔交鏈孢(Alternariaalternata)分離于自然發(fā)病的腐爛病果，純化后在PDA(potato dextrose agar) 上保存待用.

PDA培養(yǎng)基[27]：馬鈴薯200 g、蔗糖15～20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL.

1.2 方法

1.2.1A.alternata的分離、純化 參照李永才[29]的方法進(jìn)行試驗.采集具有黑斑病的‘早酥梨’果實，并用75% 乙醇對其表面進(jìn)行消毒，無菌水沖洗后，切取病健交界處的組織，在無菌操作環(huán)境下移至PDA培養(yǎng)基上，然后置于28 ℃保溫箱中培養(yǎng)，待其長出分生孢子后再進(jìn)行分離、純化，并通過回接試驗確定其致病性.分離純化后的A.alternata在 PDA 培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆?

1.2.2 孢子懸浮液的配制 參照高春麗等[30]的方法并略作修改，無菌操作環(huán)境下，將少量無菌水倒入培養(yǎng)周期為5 d的A.alternata培養(yǎng)皿中，并加入少量0.01% Tween-80，用涂布器輕刮，將所得溶液通過4層紗布過濾到錐形瓶中(所需儀器已提前進(jìn)行高溫高壓滅菌)，無菌水稀釋之后，在混合器上振蕩15～20 s，用血球計數(shù)板計數(shù),光學(xué)顯微鏡鏡檢，配制成1×105個/mL的孢子懸浮液.

1.2.3 蠟質(zhì)的提取 參照李永才[29]的方法，挑選大小一致、無機(jī)械傷口以及病蟲害的‘早酥梨’果實，表面清洗后自然晾干，在磁力攪拌器上放置1 000 mL燒杯，倒入600 mL 氯仿后將果實浸入，室溫下洗刷浸泡提取60 s.提取液經(jīng)8層紗布過濾，轉(zhuǎn)入事先稱好質(zhì)量的蒸餾瓶，用減壓蒸餾法除去溶劑(水溫 40 ℃).將所得蠟質(zhì)粗提物貯藏在4 ℃的冰箱中，用于后續(xù)試驗.

1.2.4 MAPK抑制劑的溶解 將SB203580按照一定濃度加入一定比例的無菌水，并放置于超聲儀中15 min，使其充分溶解(可稍加熱).

1.2.5 生長的觀察 抑制劑SB203580溶液按一定濃度加入裝有一定體積PDA的培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后滴加5 μL孢子懸浮液封存，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天測定培養(yǎng)皿中的菌落直徑，并觀察其菌落形態(tài)，直至長滿培養(yǎng)皿為止.

1.2.6 疏水性測定 Gelbond膜剪切成大小5 cm×2 cm 的長方形，分別將親水面和疏水一側(cè)朝上置于清洗干凈的載玻片上待測定.

用10 mL氯仿溶解提取的蘋果梨蠟質(zhì)0.1 g，配制成約0.1% 的蠟質(zhì)溶液，同時配制相同濃度的蜂蠟、石蠟溶液作為對照，分別吸取 20 、40 、60 、80和100 μL的果蠟、蜂蠟、石蠟滴于Gelbond 膜疏水面一側(cè)，用涂布器均勻涂開后放置于已清洗干凈的載玻片上12 h，待氯仿?lián)]發(fā)干凈后進(jìn)行測定.

使用接觸角測定儀(DSA 100,KRUSS Company,Germany)對上述處理好的樣品進(jìn)行測定，在樣品表面滴加5 μL的水滴用來測定接觸角的大小，每個樣品重復(fù)5次，一個處理重復(fù)3次.

1.2.7 體外試驗 將抑制劑SB203580溶液按10、20和30 μmol/L的濃度比例加入A.alternata孢子懸浮液(1×105個 /mL)中，吸取20 μL滴加于已清洗干凈的載玻片(將已剪切Gelbond膜的疏水面一側(cè)朝上放置于載玻片上提供疏水條件)形成處理組，對照組為A.alternata孢子懸浮液(1×105個 /mL)，再將載玻片放置在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng) 2、4、6和8 h 后，用乳酸酚棉蘭進(jìn)行染色2 min，然后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，計算孢子萌發(fā)率(%)，芽管長度(μm)以及附著胞形成率(%).每個處理重復(fù) 3 次.

1.2.7.1 疏水性對A.alternata侵染結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo) 將已剪切Gelbond膜的親水面、疏水面和在疏水面一側(cè)涂有20、100 μL 的果蠟溶液的 Gelbond 膜朝上置于已清洗干凈的載玻片上放置 12 h.對照組加入20 μLA.alternata孢子懸浮液，處理組將抑制劑SB203580(30 μmol/L)溶液加入A.alternata孢子懸浮液后，取20 μL滴加在樣品表面進(jìn)行培養(yǎng)，后續(xù)試驗方法同1.2.7.

1.2.7.2 蠟質(zhì)提取物對A.alternata侵染結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo) 用10 mL氯仿溶解提取的蘋果梨蠟質(zhì)、蜂蠟、石蠟各0.1 g，分別配制成約0.1%的蠟質(zhì)溶液，吸取40 μL的果蠟、 60 μL蜂蠟、20 μL石蠟滴于Gelbond膜疏水面一側(cè)，用涂布器均勻涂開后放置于已清洗干凈的載玻片上靜置12 h.對照組用20 μL的A.alternata孢子懸浮液，處理組吸取20 μL抑制劑SB203580 (30 μmol/L)處理過的A.alternata孢子懸浮液滴加在樣品表面，后續(xù)試驗方法同1.2.7.

1.2.7.3 乙烯利 將乙烯利用無菌水溶解成濃度為 1 、10 和100 μmol/L 的溶液，按一定比例加入A.alternata孢子懸浮液中，觀察其侵染結(jié)構(gòu)的形成(乙烯利溶液現(xiàn)配現(xiàn)用).

用無菌水將乙烯利溶解后按一定濃度比例加入抑制劑SB203580(30 μmol/L)處理過的孢子懸浮液中，對照組不加抑制劑，然后吸取20 μL滴加于Gelbond膜疏水面一側(cè)，后續(xù)試驗方法同1.2.7.

1.2.8 體內(nèi)試驗 樣品的處理挑選大小、形狀基本一致、無傷病的早酥梨果實浸泡于 2% 次氯酸鈉溶液中，3 min后取出用清水沖洗，在室溫下自然晾干.抑制劑SB203580處理對‘早酥梨’損傷接種后病斑直徑的測定參照Montesinos-Herrero等[31]的損傷接種方法并略作修改.自然晾干后，用75%乙醇擦拭果實的赤道部位，接著用已滅菌的接種釘(直徑 3 mm)均勻打孔(每個果實3個孔，深3 mm)， 2 h后吸取20 μL經(jīng)抑制劑處理過的A.alternata孢子懸浮液，接入孔內(nèi)，室溫下晾干后，裝入市售PE保鮮袋( 25 cm×40 cm，厚度 0.02 mm)中，在室溫((25±2)℃，RH 45%～55%)下貯藏，接種后每隔 1 d觀察并測定果實表面的病斑直徑.每個處理用果實 9 個，3 次重復(fù).

1.3 數(shù)據(jù)處理

全部試驗數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2010計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，用SPSS 20.0軟件對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan’s多重比較差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 MAPK抑制劑對A.alternata生長及侵染結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 MAPK抑制劑對A.alternata侵染結(jié)構(gòu)分化的影響 MAPK抑制劑SB203580處理對A.alternata孢子萌發(fā)、附著胞形成和芽管伸長均具有一定的抑制作用(圖1)，除了芽管長度外(圖1-C)，其抑制作用均存在濃度依賴性(圖1-A～B)，處理后8 h，10、20、30 μmol/L抑制劑處理對其孢子萌發(fā)的抑制率僅為1.35%、3.04%和4.05%(P<0.05).SB203580顯著地抑制了A.alternata附著胞的形成，培養(yǎng)8 h后，30 μmol/L SB203580處理A.alternata后附著胞形成率比對照組顯著降低了64.24%(P<0.05)(圖1-B).同時發(fā)現(xiàn)抑制劑對A.alternata芽管的伸長也具有抑制作用(圖1-C).

2.1.2 MAPK抑制劑對A.alternata生長的影響 隨著培養(yǎng)時間的延長，A.alternata菌落直徑逐漸增大，但MAPK抑制劑SB203580處理與對照組相比其菌落形態(tài)和菌落直徑均不存在顯著性差異(P<0.05)(圖2-A～B).

豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE).小寫字母代表顯著性差異(P<0.05).Bars indicate standard error (±SE).Lower case letters represent significant differences (P<0.05).圖1 不同濃度MAPK抑制劑SB203580對A.alternata孢子萌發(fā)率(A)、附著胞形成率(B) 和芽管長度(C)的影響Figure 1 Effects of different concentration MAPK in hibitor SB203580 on spore germination (A),apperssorium formation (B) and germ tube length (C) of A.alternata.

豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE).小寫字母代表顯著性差異(P<0.05).Bars indicate standard error (±SE).Lower case letters represent significant differences (P<0.05).圖2 MAPK抑制劑處理對A.alternata菌落生長(A)和菌落形態(tài)(B)的影響Figure 2 The effect of MAPK inhibitor treatment on mycelium growth (A) and morphology (B) of A.alternata

2.2 MAPK信號通路在果實表皮物理化學(xué)信號誘導(dǎo)A.alternata侵染結(jié)構(gòu)形成中的作用

2.2.1 在疏水性誘導(dǎo)侵染結(jié)構(gòu)形成中的作用 隨著果蠟提取物涂膜量的增加，表面疏水性即接觸角增大(表1).由圖 3 可知，與親水表面相比，高接觸角的疏水表面顯著地誘導(dǎo)A.alternata孢子萌發(fā)和附著胞的形成，培養(yǎng)2 h時，果蠟涂膜高疏水面(100.23°、108.33°)已有附著胞形成.培養(yǎng)4 h時，高疏水性表面(108.33°±0.55°)A.alternata附著胞形成率較Gelbond 親水膜(31°±0.07°)和Gelbond疏水膜(74.63°±1.24°)分別提高14.4和2.5倍(圖3-A).MAPK抑制劑SB203580處理期間，均能抑制A.alternata孢子萌發(fā)和附著胞形成，尤其顯著地抑制了A.alternata附著胞形成，延遲了果蠟涂膜表面附著胞的形成時間，SB203580處理后2 h均不形成附著胞，8 h時，對疏水性表面附著胞形成的抑制率分別為41.01%、24.99%和22.85%(P<0.05) (圖3-B).

表1 疏水性的測定

豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE).大寫字母代表對照與處理間顯著性差異,小寫字母代表不同處理間顯著性差異(P<0.05).Bars indicate standard error (±SE).Capital letters represent significant differences between controls and treatments,and lowercase letters represent significant differences between treatments.圖3 MAPK抑制劑對梨果蠟質(zhì)疏水性誘導(dǎo)A.alternata 孢子萌發(fā)率(A)和附著胞形成率(B)的影響Figure 3 Effect of MAPK inhibitor on spore germination (A) and apperssorium formation (B) of A.alternata induced by hydrophobicity of pear fruit wax

2.2.2 在果皮蠟質(zhì)誘導(dǎo)A.alternata侵染結(jié)構(gòu)形成中的作用 同一疏水條件下(101.05°)，以蜂蠟和石蠟為對照，果蠟?zāi)軌蝻@著誘導(dǎo)A.alternata孢子萌發(fā)(圖 4-A)和附著胞的形成(圖 4-B)，且能提前附著胞的形成時間，培養(yǎng)2 h時果蠟涂膜表面誘導(dǎo)形成了附著胞，4 h后，果蠟涂膜表面的附著胞形成率分別是蜂蠟和石蠟涂膜表面的1.2和2.5倍.MAPK抑制劑SB203580處理后對不同蠟質(zhì)膜表面的A.alternata孢子萌發(fā)和附著胞形成均具有一定的抑制作用，尤其抑制了附著胞的形成，2 h時果蠟涂膜表面不形成附著胞，培養(yǎng)4 h時，抑制劑對果蠟誘導(dǎo)表面A.alternata孢子萌發(fā)(圖 4-A)和附著胞形成(圖 4-B)的抑制率分別達(dá)到13.79% 和56.76% (P<0.05).

2.2.3 在乙烯利誘導(dǎo)A.alternata侵染結(jié)構(gòu)形成中的作用 低濃度的外源乙烯(1 μmol/L)對A.alternata孢子萌發(fā)和附著胞形成具有促進(jìn)作用，而高濃度具有抑制作用(表2).外源乙烯(1 μmol/L)處理后2 h時A.alternata孢子萌發(fā)率比對照提高了 19.24%(P<0.05)，培育至6 h時附著胞形成率比對照提高了31.71%(P<0.05).由圖5可知，MAPK抑制劑SB203580處理后顯著抑制了外源乙烯誘導(dǎo)的A.alternata孢子萌發(fā)(圖 5-A)和附著胞形成(圖 5-B)，培育2 h時，與對照組(1 μmol/L 外源乙烯)相比，其抑制率分別為17.01%和57.14%(P<0.05)，其對附著胞的抑制作用更強(qiáng)，培養(yǎng)6h時，其對孢子萌發(fā)的抑制率僅為2.77%，而對附著胞的抑制率為20.47%(P<0.05).

豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE).大寫字母代表對照與處理間顯著性差異,小寫字母代表不同處理間顯著性差異(P<0.05).Bars indicate standard error (±SE).Capital letters represent significant differences between controls and treatments,and lowercase letters represent significant differences between treatments.圖4 MAPK抑制劑對梨果蠟質(zhì)(F)、石蠟(P)和蜂蠟(B)誘導(dǎo)A.alternata孢子萌發(fā)率(A)和附著胞形成率(B)的影響Figure 4 Effects of MAPK inhibitors on spore germination (A) and apperssorium formation (B) of A.alternata induced by pear fruit wax(F),paraffin (P) and beeswax (B)

表2 乙烯利對A.alternata侵染結(jié)構(gòu)的影響

小寫字母代表不同蠟質(zhì)間顯著性差異(P<0.05).

Lower case letters represent significant differences between different waxes (P<0.05).

豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE).* 代表不同蠟質(zhì)間顯著性差異(P<0.05).Bars indicate standard error (±SE).* represents a significant difference between different waxes (P<0.05).圖5 MAPK抑制劑處理對乙烯利誘導(dǎo)A.alternata孢子萌發(fā)(A)和附著胞形成(B)的影響 Figure 5 The effect of MAPK inhibitor treatment on ethephon-induced A.alternata spore germination (A) and apperssorium formation rate (B)

2.3 MAPK參與A.alternata致病性的調(diào)控

由圖6可以看出，接種A.alternata后隨著貯藏時間的延長，對照和處理組果實病斑直徑逐漸增大.經(jīng)抑制劑處理后的第3天和第6天時，對其病斑直徑的抑制率分別為35.74%和63.78%(P<0.05).

豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE).*代表不同蠟質(zhì)間顯著性差異(P<0.05).Bars indicate standard error (±SE).*represents a significant difference between different waxes (P<0.05).圖6 MAPK抑制劑A.alternata處理后對果實的病斑直徑(A)和病斑形態(tài)(B)的影響Figure 6 The effect of MAPK inhibitor A.alternata on the lesion diameter (A) and lesion morphology (B) of the fruit

3 討論

宿主表面物化信號如表皮蠟質(zhì)、疏水性、植物激素等[18]對A.alternata侵入過程以及侵染結(jié)構(gòu)的形成均具有一定的調(diào)控作用[4].本研究結(jié)果表明，不同蠟質(zhì)對A.alternata侵染結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)作用不同，較蜂蠟和石蠟涂膜而言，果蠟?zāi)つ軌蝻@著地誘導(dǎo)A.alternata孢子萌發(fā)和附著胞形成，且能提前附著胞的形成時間，培養(yǎng)4 h后，其表面附著胞形成率分別是蜂蠟和石蠟的1.2倍和2.5倍(圖4-A)，這與Liu等[10]的研究結(jié)果一致，與石蠟和蜂蠟相比，果蠟更易誘導(dǎo)A.alternata孢子萌發(fā)和附著胞形成，與此同時，近期研究發(fā)現(xiàn)植物表皮蠟質(zhì)對病原物侵染結(jié)構(gòu)分化的誘導(dǎo)還存在組分特異性，如大麥表皮蠟層的化學(xué)成分C26醛和水稻表皮蠟的伯醇強(qiáng)烈誘導(dǎo)了B.graminis和Magnaporthegrisea附著胞的形成[8,10].不僅蠟質(zhì)組分能誘導(dǎo)病原物侵染結(jié)構(gòu)的分化，其疏水性也具有誘導(dǎo)作用[10]，高疏水性的表面能夠誘導(dǎo)真菌附著胞的產(chǎn)生[10,32]，試驗中發(fā)現(xiàn)梨果蠟質(zhì)提取物涂膜增加了Gelbond膜的接觸角(表面疏水性)(表1)，高接觸角的疏水表面顯著地誘導(dǎo)A.alternata孢子萌發(fā)和附著胞的形成，且培育2 h時，果蠟涂膜的高疏水面 (100.23°和108.33°) 已有附著胞形成(圖3-B)，唐瑛[4]在研究早酥梨蠟質(zhì)對A.alternata侵染調(diào)控中也得到了相同結(jié)果.有研究表明 10～100 μL/L 外源乙烯利處理可促進(jìn)B.cinere、P.expansum孢子萌發(fā)[33]，而在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度的外源乙烯(1 μmol/L)對A.alternata孢子萌發(fā)和附著胞形成具有促進(jìn)作用，高濃度(10、50、100 μmol/L)反而起抑制作用(表2)，表明果實成熟中產(chǎn)生的乙烯對采后病原物侵染具有一定的刺激作用，且不同病原物對外源乙烯的敏感性存在差異.

病原真菌通過感知和響應(yīng)來自宿主表面的物理化學(xué)信號進(jìn)而啟動其侵染的過程.研究表明MAPK級聯(lián)信號傳導(dǎo)途徑對病原真菌響應(yīng)外界刺激后的生長、孢子形態(tài)、細(xì)胞壁完整性和致病毒力因子的表達(dá)具有不同程度的調(diào)節(jié)作用[17,34-35].在釀酒酵母S.cerevisiae[36]和C.lagenarium[37-38]中Fus3 /Kss1-MAPK 級聯(lián)信號途徑和相關(guān)激酶參(Cmk1、Maf1)與其附著胞分化和致病性密切相關(guān).Alternariaspp.中Hog1-MAPK型途徑涉及滲透和氧化應(yīng)激，并且參與附著胞形成和致病性的調(diào)控過程[39].本研究發(fā)現(xiàn)用MAPK抑制劑SB203580作用于A.alternata孢子懸浮液后，對蠟質(zhì)疏水性、化學(xué)組分及外源乙烯誘導(dǎo)條件下的孢子萌發(fā)、附著胞形成和芽管伸長均具有一定的抑制作用，除了芽管長度外(圖1-C)，其抑制作用均存在濃度依賴性(圖1-A～B).Wu 等[40]發(fā)現(xiàn)將 Vasla mali 突變株ΔVmPmk1在PDA上培養(yǎng)2 d后，發(fā)現(xiàn)與野生型相比ΔVmPmk1菌株徑向生長速率降低了約33%，而本研究用MAPK抑制劑SB203580溶液處理A.alternata后培養(yǎng)7 d，發(fā)現(xiàn)對其菌落生長和形態(tài)并無顯著地影響，這表明不同菌株對抑制劑的敏感性存在差異.Lin 等[39]在對柑橘褐斑病菌(A.alternata)研究中發(fā)現(xiàn)，ΔAaHOG1菌株的致病力降低，S.cerevisiae的ΔMPSl菌株附著胞形成率顯著減少且致病性減弱[41]，我們研究發(fā)現(xiàn)將MAPK抑制劑SB203580處理過的A.alternata孢子懸浮液損傷接種于梨果體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)第6天時，其病斑直徑比同期對照組顯著降低了63.78%(圖6)，說明MAPK參與并調(diào)控A.alternata致病性.同時發(fā)現(xiàn)M.oryzae的ΔPMKI突變株仍能識別疏水信號且參與調(diào)控該病菌附著胞的形成[16]；C.lagenarium的ΔCmk1突變株的分生孢子不能萌發(fā)[37]，ΔMaf1突變株不形成附著胞且產(chǎn)生較長的胚芽管結(jié)構(gòu)[38]，這些結(jié)論表明MAPK級聯(lián)途徑對不同致病菌生長、侵染結(jié)構(gòu)分化及致病性的調(diào)控存在差異，但其具體調(diào)控機(jī)理尚待闡明.

4 結(jié)論

MAPK信號級聯(lián)通路的抑制劑SB203580處理顯著地抑制了梨果蠟質(zhì)疏水性、化學(xué)組分和外源乙烯等信號誘導(dǎo)A.alternata孢子萌發(fā)、芽管伸長及附著胞形成，同時也減弱了A.alternata在梨果上的致病力.說明MAPK信號級聯(lián)通路可通過調(diào)控A.alternata侵染結(jié)構(gòu)的形成從而影響其對梨果皮物理化學(xué)信號的識別和應(yīng)答，因此推測MAPK信號通路對A.alternata感知或響應(yīng)梨果皮物化信號進(jìn)而啟動侵染具有重要的調(diào)控作用.