一種死宰豬肉鑒別診斷方法的建立

馬貴達(dá),張若曦,顧文源,李 翀,劉天駒,張建虹,董維亞,石玉祥,袁 芳,劉 博,韓慶安,王 斌

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,河北 邯鄲056001;2.河北省動物疫病預(yù)防控制中心,河北 石家莊050011;3.河北省動物衛(wèi)生監(jiān)督所,河北 石家莊050051;4.衡水市動物疫病預(yù)防控制中心,河北 衡水053000)

死宰豬肉是指法律法規(guī)規(guī)定的,患有對人體有害的傳染性疾病、寄生蟲病和中毒性疾病的生豬,非經(jīng)屠宰死亡的生豬以及經(jīng)檢疫檢驗(yàn)不合格、不能食用的豬肉及其肉類產(chǎn)品[1]。目前,死宰豬肉進(jìn)入市場的情況時(shí)有發(fā)生,嚴(yán)重危害了人民群眾的身體健康[2]。我國現(xiàn)行的市場肉品檢驗(yàn)中主要以感官檢查和實(shí)驗(yàn)室檢測為鑒別手段[3]。感官檢查方法包括視檢、嗅檢和觸檢[4]。實(shí)驗(yàn)室檢測主要有pH值測定法、過氧化物酶反應(yīng)法、硫酸銅蛋白沉淀法、細(xì)菌內(nèi)毒素氧化呈色法等定性的檢測方法[5-8]。這些方法往往存在較大的經(jīng)驗(yàn)性和主觀性,無法提供準(zhǔn)確的圖譜和定量化數(shù)據(jù),缺乏充分科學(xué)的依據(jù)和數(shù)據(jù)[10]。因此,需要建立一種有數(shù)據(jù)支撐、檢測結(jié)果準(zhǔn)確的死宰豬肉鑒別診斷方法。

過氧化物酶(Peroxidase,POD)是評價(jià)豬肉健康與否的重要指標(biāo)[5,7]。在新鮮健康的畜禽肉中含有POD,但慢性死亡的畜禽以及當(dāng)畜禽處于病理狀態(tài)或?yàn)l死狀態(tài)時(shí)肉中的POD 顯著減少,甚至完全消失[11]。此外,在臨床屠宰中,死宰畜禽常出現(xiàn)放血不及時(shí),使血液墜積于胴體的血管,皮下以及肌肉組織中,導(dǎo)致血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)殘留現(xiàn)象[7]。因此,本試驗(yàn)以豬肉中的POD 和Hb 為研究靶標(biāo),建立一種新型的死宰肉和屠宰肉鑒別診斷方法,為肉品檢驗(yàn)提供科學(xué)的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 分別于5 頭屠宰豬胴體的6 個(gè)不同部位(A.通脊肉;B.五花肉;C.前臀尖;D.前腿肉;E.后臀尖;F.后腿肉)采集待檢肉樣30 份;屠宰豬肉樣品來自河北省某屠宰加工企業(yè);分別于6 頭死宰豬胴體的六個(gè)不同部位采集待檢肉樣36 份,死宰豬肉樣品來自石家莊某動物無害化處理廠。每份肉樣采集約50 g,置于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與設(shè)備 PBS 緩沖液(0.01 mol/L,pH 值7.2~7.4),購自北京索萊寶科技有限公司;磷酸二氫鈉、硫酸,均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;過氧化脲,購自上海安耐吉化學(xué)有限公司;3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB),購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司;辣根過氧化物酶,購自Sigma 中國有限公司;豬血紅蛋白ELISA 檢測試劑盒,購自無錫市東林科技發(fā)展有限責(zé)任公司(Develop 公司)。

高速組織搗碎機(jī)(金壇市精達(dá)儀器制造有限公司,型號JJ-2);紫外分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司,型號755B);酶標(biāo)儀(安圖實(shí)驗(yàn)儀器鄭州有限公司,型號PHOMO);隔水恒溫箱(上海智城分析儀器制造有限公司,型號ZXGP-A2270)。

1.3 肉浸液的制備 手剪法:將待檢測肉樣去除筋腱和脂肪,取5~10 g 肉樣均勻剪碎后加入10 倍肉樣量的PBS 至小燒杯中,用玻璃棒攪拌均勻,浸泡一定時(shí)間后,分別取4 mL 肉浸液以3 000 r/min 離心5 min 后取上清液2 mL 以備檢測。

機(jī)攪法:將待檢測肉樣去除筋腱和脂肪,取5~10 g 肉樣和10 倍肉樣量的PBS 至高速組織搗碎機(jī)以最大轉(zhuǎn)速16 000 r/min 機(jī)攪30 s 至機(jī)攪完全,隨后轉(zhuǎn)移至小燒杯中,用玻璃棒攪拌均勻,浸泡一定時(shí)間后,分別取4 mL 肉浸液以3 000 r/min 離心5 min 后取上清液2 mL 以備檢測。

1.4 過氧化物酶檢測 比色皿內(nèi)按順序加入磷酸二氫鈉緩沖液(15.6 g/L,pH 值4.5)2 mL、過氧化脲溶液(9.4 g/L)0.2 mL、樣品肉浸液0.2 mL、3,3′,5,5′-四 甲 基 聯(lián) 苯 胺 溶 液(TMB)(0.65 g/L)0.2 mL,室溫下反應(yīng)1 min,加入0.1 mL 硫酸溶液(2 mol/L)終止反應(yīng),在紫外分光光度計(jì)上測樣品OD450nm值。

將辣根過氧化物酶溶液(10 mg/L)作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋1 000 倍,再進(jìn)行倍比稀釋,利用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和檢測OD450nm值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并換算被檢樣品的濃度。

1.5 血紅蛋白ELISA 檢測 參照無錫市東林科技發(fā)展有限公司豬血紅蛋白ELISA 檢測試劑盒說明書,對經(jīng)過前處理后的屠宰豬和死宰豬肉浸液進(jìn)行血紅蛋白ELISA 檢測,利用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和檢測OD450nm值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并換算被檢樣品的濃度。

2 結(jié)果

2.1 POD 檢測結(jié)果 在先前報(bào)道的POD 檢測方法中,肉樣的研磨處理方式和肉浸液的浸泡時(shí)間各有不同[5,8-10,12]。為確定前處理方式,對手剪和機(jī)攪兩種方法進(jìn)行對比,結(jié)果顯示(見中插彩版圖1),手剪法處理的肉樣POD 檢測OD450nm值在0.2~0.8之間,機(jī)攪法處理的肉樣檢測結(jié)果在0.2~1.2 之間;經(jīng)機(jī)攪法處理后的肉浸液,屠宰豬POD 檢測OD450nm值較死宰豬更高,其中死宰豬和屠宰豬前臀尖(C)經(jīng)機(jī)攪法處理后,POD 的檢測結(jié)果明顯區(qū)分,而死宰豬和屠宰豬通脊肉(A)、后臀尖(E)和后腿肉(F)經(jīng)機(jī)攪法處理后,POD 的檢測結(jié)果差異更加顯著,表明與手剪法對比,機(jī)攪法肉樣的研磨程度更加均一,死宰豬肉和屠宰豬肉POD 的檢測結(jié)果差異更加明顯。表明機(jī)攪法更適用于POD檢測。

以機(jī)攪法為肉樣前處理方式,設(shè)立5 個(gè)不同的浸泡時(shí)間點(diǎn)(10 min、30 min、60 min、90 min 和120 min)進(jìn)行比較,結(jié)果顯示(見中插彩版圖2),死宰豬與屠宰豬通脊肉(A)、五花肉(B)、后臀尖(E)、后腿肉(F)的POD 濃度無法區(qū)分;屠宰豬前臀尖(C)、前腿肉(D)的POD 濃度顯著較高。

2.2 血紅蛋白ELISA 檢測結(jié)果 栗邵文等研究中指出臨床檢測中為了避免死宰豬肉漏檢現(xiàn)象,POD檢測必須輔以感官檢測、微生物檢驗(yàn)和其他理化檢驗(yàn)方法進(jìn)行綜合判斷[12]。在臨床屠宰中,死宰畜禽常出現(xiàn)放血不完全現(xiàn)象,導(dǎo)致胴體內(nèi)Hb 殘留較多[7],所以肌肉中的Hb 含量可作為鑒別死宰肉的潛在檢測靶標(biāo)[16]。經(jīng)前處理后的肉樣,在不同時(shí)間(10 min、30 min、60 min、90 min 和120 min)浸泡后進(jìn)行血紅蛋白ELISA 檢測及結(jié)果分析比對,結(jié)果顯示,死宰豬肉Hb 濃度分布區(qū)間顯著高于屠宰豬肉,但是,死宰豬后腿肉(F)與屠宰豬前臀尖(C)、前腿肉(D)的Hb 濃度分布區(qū)間重合,難以區(qū)分。結(jié)果表明,血紅蛋白ELISA 檢測可部分鑒別死宰肉和屠宰肉,但是不能完全鑒別(見中插彩版圖3)。

2.3 以POD 和Hb 雙靶標(biāo)檢測方法的建立 由于血紅蛋白的空間結(jié)構(gòu)與辣根過氧化物酶(HRP)相似,且具備有生物酶的特性進(jìn)而被作為一種過氧化物酶廣泛適用[14]。因此推測將兩個(gè)不同靶標(biāo)轉(zhuǎn)化為定量檢測肉品中具有過氧化物酶活性物質(zhì)的血紅蛋白含量,分析血紅蛋白殘留的相對比例,可能能夠區(qū)分死宰肉與屠宰肉[15]。

為驗(yàn)證我們的推測,將檢測肉浸液中Hb 濃度與POD 濃度之比定義為R 值,并進(jìn)行比對,結(jié)果顯示,機(jī)攪后不同浸泡時(shí)間的死宰豬和屠宰豬肉浸液的R 值分布區(qū)間有明顯區(qū)分,即死宰豬肉R 值明顯高于屠宰豬,且不同部位均可明顯區(qū)分(見中插彩版圖4)。

R 值在300~400 可作為區(qū)分死宰豬與屠宰豬的有效隔離區(qū)間,此區(qū)間設(shè)立為區(qū)分閾值,建立鑒別診斷方法。 即設(shè)定R ≤300 為屠宰豬肉,R≥400 為死宰豬肉,300

表1 不同浸泡時(shí)間下死宰豬肉和屠宰豬肉R 值的符合率

3 討論

針對前人研究中檢測時(shí)存在肉樣處理方法和檢測條件不一致的問題,檢測結(jié)果難以標(biāo)準(zhǔn)化衡量的現(xiàn)象[5,8-9,12]。本試驗(yàn)中對肉樣的處理方式以及浸泡時(shí)間進(jìn)行了綜合對比,發(fā)現(xiàn)機(jī)攪法肉樣的研磨程度更具均一性,可有效減小操作誤差,保證結(jié)果的客觀準(zhǔn)確性。

POD 是鑒別肉品健康與否的重要指標(biāo)[5,7]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)以單一的POD 濃度為檢測指標(biāo)時(shí),不能有效區(qū)分死宰豬和屠宰豬肉。推測是由于急性死亡的畜禽體內(nèi)POD 消耗較少,在利用POD 檢測鑒別死宰肉時(shí)會存在漏檢的可能性[12];或者由于死宰豬肉中血液墜積的原因,使死宰豬肉中POD 的濃度受Hb 殘留的干擾而升高,導(dǎo)致檢測結(jié)果存在偏差[14-15]。因此,在臨床上為了避免漏檢,需要結(jié)合其他方法進(jìn)行輔助檢測[12]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以單一的Hb 濃度為檢測指標(biāo)時(shí),死宰豬肉和屠宰豬肉中Hb濃度分布區(qū)間可以在一定程度區(qū)分,然而誤差范圍較大,這也可能是因?yàn)椴蓸硬课缓屯涝浊斑\(yùn)動程度不同而造成的[16]。

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,為了確定一種可以排除血紅蛋白干擾的死宰肉鑒別診斷方法,本研究嘗試雙靶標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn),將肉浸液中Hb 濃度與POD 濃度之比設(shè)立R 值,利用R 值的閾值可以有效避免肌肉中Hb 對POD 檢測時(shí)干擾而影響對死宰豬肉的鑒別[14-15]。相較于單一的檢測靶標(biāo),死宰豬和屠宰豬R 值在各浸泡時(shí)間下均有明顯區(qū)分。此外,在各浸泡時(shí)間條件下,POD 濃度和Hb 濃度以及R 值的差異并不顯著。因此,R 值檢測法的設(shè)立,可以作為一種有數(shù)據(jù)支撐、檢測結(jié)果準(zhǔn)確的新型鑒別死宰豬肉方法,為肉品檢驗(yàn)提供科學(xué)的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),機(jī)攪法處理肉樣且肉浸液浸泡10 min 可作為樣品的最佳前處理方式;通過對豬肉中的Hb 殘留濃度和POD 濃度雙靶標(biāo)濃度之比R值的研究,建立了一種有數(shù)據(jù)支撐、檢測結(jié)果準(zhǔn)確的新型死宰豬肉鑒別診斷方法,且鑒別準(zhǔn)確率可達(dá)95.5%。

圖1 不同處理方式POD 檢測結(jié)果對比

圖2 不同浸泡時(shí)間POD 濃度對比

圖3 血紅蛋白ELISA 檢測結(jié)果對比

圖4 不同浸泡時(shí)間R 值的對比分析

本方法的建立,不僅為食品安全監(jiān)督部門和肉品檢驗(yàn)工作者解決了死宰豬肉鑒別手段缺乏的問題,還為肉品檢測試紙條和試劑盒的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ);此外,本方法也可結(jié)合熒光生物傳感器、免疫納米磁分離技術(shù)和微流控芯片技術(shù)等,研制病死豬肉快速檢測設(shè)備?？傊?本方法的建立可以有效避免死宰肉的漏檢現(xiàn)象,從而保證動物性食品安全和消費(fèi)者的身體健康。