基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的“蒼術(shù)-黃柏”藥對治療痛風(fēng)作用機制研究Δ

張思旋，林 茜，吳嘉瑞，孟子琦，張景媛，黃星月

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488)

蒼術(shù)苦溫、燥濕，黃柏苦寒、清熱燥濕，兩藥合用則清熱燥濕之力較強，為治療濕熱諸癥的常用藥對[1]，源于《丹溪心法》的二妙散[2]。蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodeslancea(Thunb.)DC.或北蒼術(shù)Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖；功能為燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目；用于濕阻中焦、脘腹脹滿、泄瀉、水腫、腳氣痿蹙、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)寒感冒、夜盲及眼目昏澀。黃柏為蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮；功能為清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡；用于濕熱瀉痢、黃疸尿赤、帶下陰癢、熱淋澀痛、腳氣痿蹙、骨蒸勞熱、盜汗、遺精、瘡瘍腫毒、濕疹濕瘡、陰虛火旺及盜汗骨蒸[3-4]。

痛風(fēng)在中醫(yī)理論中屬“痹病”范疇，元代朱丹溪提出“痛風(fēng)者，四肢百節(jié)走通，方書謂之白虎歷節(jié)風(fēng)證是也”。西醫(yī)理論中，痛風(fēng)是因體內(nèi)嘌呤類物質(zhì)代謝障礙或腎臟尿酸排泄減少致血尿酸濃度持續(xù)增高形成尿酸鹽結(jié)晶并沉積至軟組織所誘發(fā)的一系列炎癥反應(yīng)，當(dāng)血清中尿酸濃度升高至超飽和狀態(tài)時則由細(xì)胞外液沉積于關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)周圍組織及器官，其臨床特點為高尿酸血癥、反復(fù)發(fā)作的痛風(fēng)性急性關(guān)節(jié)炎、間質(zhì)性腎炎和痛風(fēng)石形成，嚴(yán)重者伴有關(guān)節(jié)畸形或尿酸性尿路結(jié)石。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎常為該綜合征的首發(fā)表現(xiàn)，早期以單關(guān)節(jié)復(fù)發(fā)急性炎癥為特征，進一步惡化出現(xiàn)多關(guān)節(jié)炎的頻繁或持續(xù)發(fā)作，長期將引起關(guān)節(jié)畸形、腎結(jié)石和腎衰竭等疾病[5-6]。

歷代至現(xiàn)今的諸多醫(yī)家使用蒼術(shù)、黃柏配伍并進行加減以治療痹癥，并有文獻研究采用數(shù)據(jù)挖掘的方法得出蒼術(shù)、黃柏配伍有明顯的抗痛風(fēng)作用的結(jié)論[4]。隨著現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展，“蒼術(shù)-黃柏”藥對治療痛風(fēng)的作用機制研究已初步進入分子生物學(xué)水平，但應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在系統(tǒng)層面對其治療痛風(fēng)的作用機制的研究依然較少。不同于化學(xué)藥的藥理特征通常為單一成分及靶點[7]，中藥具有多組分、多靶標(biāo)和多途徑協(xié)同作用的特點，因此，很難闡釋清楚其物質(zhì)基礎(chǔ)及作用原理，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)為中藥的研究提供了全新的視角。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在現(xiàn)代藥理學(xué)研究基礎(chǔ)上提出的藥物設(shè)計與開發(fā)的新方法和新策略，其以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，從系統(tǒng)層次分析以了解疾病的發(fā)病機制，從整體水平觀察“藥物-靶點-疾病”復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，進而指導(dǎo)新藥研發(fā)及藥理作用研究[8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)把之前“一個靶點，一種成分”的藥物研究模式轉(zhuǎn)變?yōu)椤岸喟悬c，多成分”的新模式，從而能夠更好地揭示中藥多成分、多靶點之間的復(fù)雜關(guān)系；因中藥復(fù)雜的作用機制，使對其發(fā)揮作用的機制的深入研究遇到巨大阻礙，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為復(fù)雜中藥系統(tǒng)的研究提供了新的思路和切入點[9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究策略具有的整體性和系統(tǒng)性與中醫(yī)藥的辨證論治原則、整體觀念不謀而合，可用于發(fā)現(xiàn)復(fù)雜中藥中的活性成分，進而識別靶標(biāo)和預(yù)測適應(yīng)證[8,10]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測、分析“蒼術(shù)-黃柏”藥對治療痛風(fēng)的分子作用機制，希望為深入開展“蒼術(shù)-黃柏”藥對治療痛風(fēng)的基礎(chǔ)實驗研究及臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 “蒼術(shù)-黃柏”藥對活性成分及對應(yīng)靶點的收集

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)收集了來自于《中華人民共和國藥典：一部》(2015年版)中499種草藥的組分?jǐn)?shù)據(jù)，涵蓋13 144個分子以及29 384個化合物，所述分子數(shù)據(jù)均由研究組成員經(jīng)過數(shù)年的手動驗證添加，是世界上最大的非商業(yè)中藥分子數(shù)據(jù)庫之一[11]。TCMSP主要包含分子數(shù)據(jù)集、靶點識別系統(tǒng)、分子與靶點間相互作用網(wǎng)絡(luò)、靶點與相關(guān)疾病間相互作用網(wǎng)絡(luò)信息以及口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、類藥性(drug-likeness，DL)、小腸上皮通透性和溶解度等信息。選取蒼術(shù)、黃柏中含有的活性成分為對象進行研究，通過TCMSP查找并導(dǎo)出用于篩選活性成分的相應(yīng)數(shù)據(jù)。經(jīng)過設(shè)置OB≥30%、DL≥0.18，篩選出共30個活性成分。再將其依次輸入TCMSP，查找相應(yīng)的靶點，共得到220個潛在靶點。

1.2 “蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

Cytoscape 3.6.1(http：//www.cytoscape.org/)是一款開源的生物信息分析軟件，用于構(gòu)建由蛋白質(zhì)、基因和藥物等相互作用構(gòu)成的分子交互網(wǎng)絡(luò)，實現(xiàn)可視化瀏覽和分析[12]。將“蒼術(shù)-黃柏”藥對的化合物和相關(guān)靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1，從而構(gòu)建“活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.3 痛風(fēng)相關(guān)的靶標(biāo)蛋白質(zhì)的收集

治療靶點數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD)(http：//bidd.nus.edu.sg/BIDDDatabases/TTD/TTD.asp)是一個提供已知或正在探索的可用作治療的蛋白質(zhì)靶點和核苷酸靶點的信息，以及與之相對應(yīng)的靶疾病、靶通路和相應(yīng)的藥物/配體信息的數(shù)據(jù)庫[13]。以“Gout”為關(guān)鍵詞進行捜索，收集與痛風(fēng)相關(guān)的蛋白，由于該數(shù)據(jù)庫得到的靶點較少，因此合并遺傳關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(genetic association database，GAD)(https：//geneticassociationdb.nih.gov/)，得到與痛風(fēng)相關(guān)的靶點信息。

1.4 痛風(fēng)相關(guān)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

STRING 10.5數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org)是一個儲存已知的和預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫，包含蛋白質(zhì)間直接的和間接的相互作用，其對每個蛋白質(zhì)相互作用信息都進行打分，分值越高說明蛋白質(zhì)的相互作用置信度越高[14]。將TTD、GAD中收集到的與痛風(fēng)相關(guān)的所有蛋白質(zhì)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫并導(dǎo)出分值>0.7的高置信度蛋白相互作用數(shù)據(jù)，用Cytoscape 3.6.1構(gòu)建與痛風(fēng)有關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)合并

利用Cytoscape 3.6.1中Merge功能，將“蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)與痛風(fēng)的PPI網(wǎng)絡(luò)合并，確定兩者是否存在交集，存在交集的蛋白質(zhì)很有可能是“蒼術(shù)-黃柏”藥對的活性成分治療痛風(fēng)的潛在作用靶點。通過Cytoscape 3.6.1構(gòu)建“蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)分析“蒼術(shù)-黃柏”藥對治療痛風(fēng)的潛在作用靶點。

1.6 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

為了說明“蒼術(shù)-黃柏”藥對治療痛風(fēng)的潛在作用靶點在信號通路中的作用，采用David v6.8數(shù)據(jù)庫(https：//davidd.ncifcrf.gov/home.jsp)[15]，對與痛風(fēng)相關(guān)的“蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進行基于KEGG的生物通路富集分析，并利用OmicShare對通路進行可視化。為了說明中藥化合物的靶點蛋白在基因功能中的作用，采用David v6.8數(shù)據(jù)庫，對與痛風(fēng)相關(guān)的“蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進行GO功能富集分析。

2 結(jié)果

2.1 “蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)

“蒼術(shù)-黃柏”藥對中含有的30個活性成分基本信息見表1，其中4個來自蒼術(shù)，26個來自黃柏?！盎钚猿煞?預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)總共包括250個節(jié)點，組成547條“活性成分-預(yù)測靶點”聯(lián)系，見圖1；圖中，三角形表示蒼術(shù)的活性成分，菱形表示只有蒼術(shù)對應(yīng)的預(yù)測靶點，六邊形表示黃柏的活性成分，圓形表示只有黃柏對應(yīng)的預(yù)測靶點，八邊形表示蒼術(shù)和黃柏共同對應(yīng)的預(yù)測靶點。

表1 “蒼術(shù)-黃柏”藥對30個活性成分基本信息Tab 1 General information of 30 active ingredients of “Atractylodis Rhizoma-Phellodendri Chinensis Cortex”

圖1 “蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig 1 Active ingredients-predicted target network of “Atractylodis Rhizoma-Phellodendri Chinensis Cortex”

2.2 痛風(fēng)相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)

TTD中檢索到17個與痛風(fēng)相關(guān)的蛋白，GAD中檢索到67個與痛風(fēng)相關(guān)的蛋白，兩者有部分重合，刪除重復(fù)部分后共有52個與痛風(fēng)相關(guān)的蛋白。檢索PPI數(shù)據(jù)，隨后構(gòu)建與痛風(fēng)相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)，其中包含140個與痛風(fēng)相關(guān)的蛋白和1 452條與痛風(fēng)相關(guān)的PPI關(guān)系，見圖2。

圖2 與痛風(fēng)相關(guān)的 PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Gout-related PPI network

圖3 與痛風(fēng)相關(guān)的“蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Active ingredients-potential target network of “Atractylodis Rhizoma-Phellodendri Chinensis Cortex” in the treatment of gout

2.3 與痛風(fēng)相關(guān)的“蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)

將“蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)和與痛風(fēng)相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，用Merge功能兩者合并，得到“蒼術(shù)-黃柏”藥對中活性成分治療痛風(fēng)的潛在靶點，并構(gòu)建與痛風(fēng)相關(guān)的“蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖3。圖中共包括39個節(jié)點(23個圓形的化合物節(jié)點、17個八邊形的靶點節(jié)點)和55條邊。17個靶點分別為前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1，PTGS1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)、核受體輔激活蛋白1(nuclear receptor coactivator 1，NCOA1)、醇醛酮還原酶家族1(aldo-keto reductases 1 B1，AKR1B1)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、黃嘌呤脫氫酶(xanthine dehydrogenase，XDH)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素1α(interleukin 1 α，IL-1α)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、磷酸化IKB alpha抗體(NFKBIA)、糖皮質(zhì)激素受體基因(NR3C1)、三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G超家族成員2抗體(ABCG2)、蛋白激酶(AKT1)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸-3-激酶催化亞基γ亞型(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma isoform，PIK3CG)、雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)。運用Cytoscape中的Network Analysis-Analyze Network，對與痛風(fēng)相關(guān)的“蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)進行分析，得到網(wǎng)絡(luò)中潛在靶點的度值，靶點的度值表示“蒼術(shù)-黃柏”藥對活性成分可能作用于該靶點的個數(shù)；度值越大，“蒼術(shù)-黃柏”藥對活性成分通過該靶點發(fā)揮作用的可能性就越大。本研究中，有4個靶點的度值大于平均度值(4.17)，意味著其很可能是“蒼術(shù)-黃柏”藥對活性成分發(fā)揮作用的潛在靶點。

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用DAVID平臺進行GO功能富集分析，對與痛風(fēng)相關(guān)的“蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)中涉及的17個蛋白在基因功能中的作用進行研究。根據(jù)P值確定了149個GO條目(P<0.001，根據(jù)P值列出前27個，見圖4)；其中，生物過程相關(guān)的條目最多，有105個，主要涉及有機物質(zhì)反應(yīng)、基因表達過程的調(diào)節(jié)、分子功能及活性的調(diào)控、級聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞壞死以及凋亡的調(diào)控等方面；分子功能相關(guān)的條目35個，主要涉及分子及受體活性、酶結(jié)合、受體結(jié)合及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面；細(xì)胞組成相關(guān)的條目9個，主要涉及細(xì)胞組分、細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞器等方面。再利用DAVID平臺的KEGG通路富集分析功能，對與痛風(fēng)相關(guān)的“蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)中涉及的17個蛋白在信號通路中的作用進行研究，得到59條信號通路，根據(jù)P<0.001篩選出23條(見圖5)；包括“TNF signaling pathway”(TNF信號通路)、“Osteoclast differentiation”(破骨細(xì)胞分化)、“Non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)”[非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)]、“Influenza A”(甲型流感)、“Chagas disease(American trypanosomiasis)”[南美錐蟲病(美洲錐蟲病)]、“Toll-like receptor signaling pathway”(Toll樣受體信號通路)、“Insulin resistance”(胰島素抵抗)、“Measles”(麻疹)、“Leishmaniasis”(利什曼病)、“Graft-versus-host disease”(移植物抗宿主病)、“Hepatitis C”(丙型肝炎)、“Legionellosis”(軍團病)、“NOD-like receptor signaling pathway”(NOD樣受體信號通路)、“Regulation of lipolysis in adipocytes”(調(diào)節(jié)細(xì)胞脂肪分解)、“Hepatitis B”(乙型肝炎)、“Apoptosis”(細(xì)胞凋亡)、“Inflammatory bowel disease(IBD)”[炎癥性腸病(IBD)]、“Adipocytokine signaling pathway”(脂肪細(xì)胞因子信號通路)、“Tuberculosis”(結(jié)核)、“Pertussis”(百日咳)、“Small cell lung cancer”(小細(xì)胞肺癌)、“Hematopoietic cell lineage”(造血細(xì)胞譜系)、“NF-kappa B signaling pathway”(核轉(zhuǎn)錄因子κB信號通路)。

圖4 17個潛在作用靶點的GO功能富集分析(P<0.001)Fig 4 GO function enrichment analysis of 17 potential targets(P<0.001)

圖5 17 個潛在作用靶點的KEGG通路富集分析(P<0.001)Fig 5 KEGG pathway enrichment analysis of 17 potential targets(P<0.001)

2.5 藥物-化合物-靶點-通路圖的構(gòu)建

圖6 藥物-化合物-靶點-通路圖Fig 6 Drug-compound-target-pathway network

基于上述信息，構(gòu)建藥物-化合物-靶點-通路圖，以全面闡述“蒼術(shù)-黃柏”藥對治療痛風(fēng)的作用機制，見圖6；圖中，三角形節(jié)點分別代表蒼術(shù)和黃柏，菱形節(jié)點代表蒼術(shù)的活性成分，八邊形節(jié)點代表黃柏的活性成分，正方形節(jié)點代表蒼術(shù)與黃柏活性成分共同對應(yīng)的靶點，圓形節(jié)點代表黃柏獨有的靶點，六邊形節(jié)點代表蒼術(shù)獨有的靶點，箭頭形節(jié)點代表所有靶點參與的通路。

3 討論

不同國家及地區(qū)的痛風(fēng)患病率不同[16]。在我國，痛風(fēng)呈現(xiàn)出高患病率、低治療率以及高并發(fā)癥發(fā)生率的特點[17-20]。

蒼術(shù)、黃柏為治療濕熱諸癥的常用藥對?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，蒼術(shù)中主要含有倍半萜類、烯炔類、三萜及甾體類、芳香苷類等化學(xué)成分；與其對應(yīng)的藥理活性研究結(jié)果表明，上述成分在保肝、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、中樞抑制及促進胃腸道蠕動、抗?jié)兒鸵种莆杆岱置诘确矫婢哂幸欢ㄗ饔肹21-22]。黃柏在降血糖、抗菌、抗腫瘤[23]以及自身免疫調(diào)節(jié)[24]等方面具有顯著作用。蒼術(shù)、黃柏配伍使用組成《丹溪心法》二妙散，該方藥僅2味，但功效卓著，作用神妙，為治濕熱痿證的妙藥，故名“二妙散”。二妙散的現(xiàn)代藥理作用主要有抗菌、鎮(zhèn)靜、降血糖、解毒、利膽和對胃腸的影響等[25]。蒼術(shù)所含的揮發(fā)油有祛風(fēng)健胃作用[26]；蒼術(shù)揮發(fā)油中的成分具有降血壓、利尿、促進胃排空和抗炎等作用。黃柏具有降血糖、降血壓、抗菌、抗炎、解熱、抗腫瘤、抗?jié)?、抗氧化、抗痛風(fēng)、前列腺滲透和抗病毒等藥理作用，并對腸管和免疫系統(tǒng)均有影響[27]?，F(xiàn)代研究結(jié)果表明，蒼術(shù)、黃柏配伍后可對二者單用的功效進行補充，同時不同配伍比例的抗炎作用具有差異[28-29]。

本研究先構(gòu)建“蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)，再構(gòu)建與痛風(fēng)相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)，然后將二者進行重合篩選，構(gòu)建與痛風(fēng)相關(guān)的“蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)分析“蒼術(shù)-黃柏”藥對治療痛風(fēng)的作用機制。與痛風(fēng)相關(guān)的“蒼術(shù)-黃柏”藥對“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)中度值大于均值的關(guān)鍵靶點有4個，分別為ESR1、PTGS1、PTGS2和PIK3CG，推測“蒼術(shù)-黃柏”藥對的有效成分可能通過這些靶點發(fā)揮作用。(1)ESR1是雌激素受體的2種主要類型之一，在不同程度的器官系統(tǒng)的生理發(fā)育和功能中發(fā)揮一定作用，包括生殖系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)[30]。在骨骼系統(tǒng)中，ESR1的表達適中，但可以確定其生理功能為維護骨骼的完整性[31-32]。這可能是因為雌激素刺激ESR1而觸發(fā)釋放生長因子，如表皮生長因子、胰島素樣生長因子1等，進而調(diào)節(jié)骨開發(fā)和維護[31-33]。此外，有研究結(jié)果表明，該靶點與風(fēng)濕病有明顯的關(guān)聯(lián)[34]，推測痛風(fēng)也與該靶點有關(guān)。因此，推斷“蒼術(shù)-黃柏”藥對治療痛風(fēng)的作用機制可能與調(diào)控ESR1的表達有關(guān)。(2)前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS)是生物體內(nèi)前列腺素(prostaglandin，PG)合成起始步驟的限速酶[35]。PG是一類重要的炎性介質(zhì)，在各種急慢性炎癥中發(fā)揮著重要作用[36]。PTGS存在2種同功酶，即組成型(PTGS1)和誘導(dǎo)型(PTGS2)[37]，兩者在表達水平、基因調(diào)控和分子特性上都有極顯著的區(qū)別。國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為PTGS1為管家酶，在全身器官均有表達；而PTGS2是經(jīng)刺激迅速產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶，正常情況下僅見于腎和大腦的部分區(qū)域[38]。PTGS1參與機體正常生理過程和保護功能，如維持胃腸勃膜完整性、調(diào)節(jié)血小板功能和腎血流[35]；其作用為調(diào)節(jié)血管生成過程中的內(nèi)皮細(xì)胞，并參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)和維持組織穩(wěn)態(tài)。PTGS2是腫瘤、惡性腫瘤和炎癥形成的促進劑[39]；在組織損傷或炎癥情況下，可在一系列胞內(nèi)和胞外促炎因子[如白細(xì)胞介素-1(IL-1)、生長因子及TNF等]刺激下迅速表達，催化合成的PG參與炎癥反應(yīng)[35，38]。在臨床應(yīng)用中，已經(jīng)開發(fā)出選擇性非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAID)，其為一類不含有甾體結(jié)構(gòu)的抗炎藥，用于解熱、鎮(zhèn)痛及消炎，是治療急性痛風(fēng)的有效藥物；相較于傳統(tǒng)非選擇性NSAID，其胃腸道毒性、肝腎損傷的不良反應(yīng)發(fā)生概率降低，但療效與非選擇性NSAID相當(dāng)。其作用機制是抑制PTGS，尤其是PTGS2的活性而發(fā)揮抗炎作用，但因其同時會抑制部分PTGS1而出現(xiàn)一定的胃腸道等不良反應(yīng)[40]。對于ESR1、PTGS1及PTGS2與痛風(fēng)的形成機制已有一定研究，但對于PIK3CG與痛風(fēng)形成的機制還有待進一步研究。而上述4個靶點在蒼術(shù)、黃柏配伍治療痛風(fēng)相關(guān)研究中的報道很少，大部分集中在治療惡性腫瘤、冠心病等方面，偶有炎癥反應(yīng)方面的報道。痛風(fēng)為以炎癥反應(yīng)為主的疾病，以上研究可以初步證明上述4個靶點與痛風(fēng)的形成與治療有關(guān)，有待進一步驗證。

KEGG通路富集分析中，篩選得到23條信號通路，其中包括TNF信號通路、破骨細(xì)胞分化、NAFLD、甲型流感、南美錐蟲病(美洲錐蟲病)、Toll樣受體信號通路、胰島素抵抗、麻疹、利什曼病、移植物抗宿主病、丙型肝炎、軍團病、NOD樣受體信號通路、調(diào)節(jié)細(xì)胞脂肪分解、乙型肝炎、細(xì)胞凋亡、IBD、脂肪細(xì)胞因子信號通路、結(jié)核、百日咳、小細(xì)胞肺癌、造血細(xì)胞譜系及NF-κB信號通路。(1)破骨細(xì)胞為多核巨細(xì)胞，來自于單核-巨噬細(xì)胞譜系的造血祖細(xì)胞，僅存在于骨中。成骨細(xì)胞通過與破骨細(xì)胞祖細(xì)胞的細(xì)胞間接觸，參與破骨形成。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜成纖維細(xì)胞和活化的T淋巴細(xì)胞表達破骨細(xì)胞分化因子/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)，最近有研究結(jié)果表明，RANKL能夠闡明造骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨吸收的精確機制，這似乎也會引發(fā)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的骨破壞[41]。由此推測，破骨細(xì)胞分化通路和NF-κB信號通路的共同調(diào)節(jié)與同為風(fēng)濕性疾病的痛風(fēng)的形成有關(guān)。(2)血液尿酸濃度升高，綜合患者體質(zhì)等原因，尿酸會沉積在關(guān)節(jié)處。一旦沉積，其可促進與炎癥相關(guān)的級聯(lián)反應(yīng)，并最終導(dǎo)致痛風(fēng)發(fā)作[42]。TNF-α為體內(nèi)與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子，其產(chǎn)生途徑與多種蛋白產(chǎn)生的級聯(lián)效應(yīng)有關(guān)[43]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)是跨膜受體，其細(xì)胞外的N端有一個富含重復(fù)亮氨酸(leucine rich repeat，LRR)的結(jié)構(gòu)區(qū)域[44]，細(xì)胞內(nèi)的C端被稱為Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域(toll-IL-1 receptor domain，TIR)，而LRR與配體的結(jié)合與TLR二聚體有關(guān)。TIR區(qū)域介導(dǎo)TLR與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)原件之間的相互作用。活化后的TLR通過TIR與髓樣分化分子88結(jié)合形成復(fù)合物，之后結(jié)合并活化IL-1受體相關(guān)激酶(IL-1R-associated kinase，IRAK)；隨后結(jié)合TNF受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)[45]，活化轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1(TGF β-activated kinase 1，TAK1)，進而激活NF-κB，啟動前炎性IL-1β的表達，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而產(chǎn)生TNF-α等細(xì)胞炎性因子[46-48]；且激活的NF-κB能夠轉(zhuǎn)運到核內(nèi)與PTGS2基因啟動子區(qū)的NF-κB結(jié)合位點相結(jié)合，并調(diào)節(jié)PTGS2基因的表達[49]。由此，可以推測TNF信號通路、NF-κB信號通路和Toll樣受體信號通路的共同調(diào)節(jié)與痛風(fēng)的形成相關(guān)。(3)NAFLD是一種組織學(xué)改變與酒精性脂肪肝相類似的臨床病理綜合征[50]。多數(shù)研究者認(rèn)為，其發(fā)病機制與肥胖、高脂血癥及胰島素抵抗等相關(guān)[51-52]。但目前廣泛認(rèn)可的仍是“二次打擊”學(xué)說，即一系列的細(xì)胞毒素事件后的炎癥反應(yīng)。第一次打擊(脂類在肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集)引發(fā)一系列的第二次打擊(細(xì)胞毒素事件)，導(dǎo)致肝臟的炎癥反應(yīng)。NAFLD的發(fā)生與發(fā)展主要包括胰島素、瘦素抵抗，游離自由基的大量產(chǎn)生，內(nèi)臟脂肪的過多堆積和肝臟組織的炎癥反應(yīng)等[53]。由此推測，NAFLD與痛風(fēng)的炎癥反應(yīng)形成相關(guān)。以上是研究過程中體現(xiàn)出的與痛風(fēng)的形成機制相關(guān)度較高的幾條體內(nèi)信號通路的現(xiàn)代研究，推測“蒼術(shù)-黃柏”藥對活性成分可能通過作用于這些信號通路中的關(guān)鍵因子達到治療痛風(fēng)的目的。整體上，“蒼術(shù)-黃柏”藥對活性成分調(diào)控信號通路治療痛風(fēng)的相關(guān)研究報道十分有限，有待進一步深入研究。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對“蒼術(shù)-黃柏”藥對治療痛風(fēng)的多成分、多靶點和多途徑的復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系進行研究。研究結(jié)果初步預(yù)測了“蒼術(shù)-黃柏”藥對治療痛風(fēng)的分子機制，為進一步深入探討或?qū)嶒烌炞C其治療原理及分子作用機制提供了先導(dǎo)信息和基礎(chǔ)，也為研究成分更為復(fù)雜的中藥復(fù)方的作用機制提供了借鑒。