實(shí)時(shí)熒光定量PCR與細(xì)胞培養(yǎng)法在流感病毒檢測(cè)中的比較

修 敏，任妍妍

流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染性疾病 。為進(jìn)一步了解流感病毒流行株構(gòu)成、基因特異性以及抗原性，避免流感大面積擴(kuò)散，各地均實(shí)施了有效的監(jiān)測(cè)[1-2]，國(guó)際上第一個(gè)實(shí)現(xiàn)全球監(jiān)測(cè)的疾病是流感，對(duì)有效控制和預(yù)防流感起到很大作用[3]。本研究針對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、細(xì)胞培養(yǎng)法在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用效果進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 研究樣本來(lái)源于阜新市衛(wèi)生健康服務(wù)中心2016年12月—2017年5月流感高峰季節(jié)接收的流感樣本726例，所選樣本均在24 h內(nèi)送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢查，對(duì)于無(wú)法在24 h內(nèi)送檢的樣本，應(yīng)置于-70 ℃的環(huán)境中保存。

1.2 儀器與試劑 本次研究中所用的儀器：Ⅱ級(jí)生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司，型號(hào)BSC-1500ⅡA2-X）；高速離心機(jī)（美國(guó)貝克曼Microfuge公司，型號(hào)18）；全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司，型號(hào)7500fast）；旋渦振蕩器（德國(guó)Heidolph公司）；全自動(dòng)核酸提取儀（德國(guó)GIAGEN公司，型號(hào)QIAcube）；核酸提取試劑盒（德國(guó)GIAGEN公司，型號(hào)RNeasy Mini Kit）；無(wú)核酸離心管；CIBIO公司DMEM培養(yǎng)液；甲型/乙型流感病毒核酸RNA檢測(cè)試劑盒（江蘇碩世生物科技有限公司）。

1.2.1 核酸提取 根據(jù)QIAcube全自動(dòng)核酸提取儀使用說(shuō)明書(shū)和配套R(shí)NA提取試劑盒的使用方法進(jìn)行試驗(yàn)[4]。

1.2.2 反應(yīng)的體系以及條件 采用甲型/乙型流感病毒核酸RNA檢測(cè)試劑盒。反應(yīng)體系包括：反應(yīng)液、反轉(zhuǎn)錄酶，所有反應(yīng)體系的配置情況均以試劑盒的說(shuō)明書(shū)為依據(jù)進(jìn)行。反應(yīng)條件：在50 ℃下進(jìn)行30 min，按照此順序進(jìn)行1個(gè)循環(huán)然后在95 ℃下進(jìn)行5 min，按照此順序進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，在95 ℃下進(jìn)行10 s，然后在55 ℃下進(jìn)行40 s，按照此順序進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，最后為熒光收集，在55 ℃的環(huán)境下進(jìn)行熒光檢測(cè)。

1.2.3 病毒細(xì)胞分離鑒定 根據(jù)《流行性感冒診療方案（2018 年版修訂版）》[5]對(duì)流感病毒實(shí)施鑒定和分離操作。將10 000 U/ml雙抗置入到樣本病毒采樣液，對(duì)細(xì)胞病理變化進(jìn)行觀(guān)察，通過(guò)紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)對(duì)病毒培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)滴度達(dá)到1∶16或者超過(guò)該比例的細(xì)胞培養(yǎng)液，利用紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)對(duì)相關(guān)亞型標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行檢測(cè)和鑒定[6-7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算相應(yīng)的陽(yáng)性率。以細(xì)胞培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法診斷流感的靈敏度和特異度。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)法以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法檢測(cè)流感病毒陽(yáng)性率 細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本89例，陽(yáng)性率12.26%，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法共檢測(cè)189例陽(yáng)性，陽(yáng)性率26.03%。細(xì)胞培養(yǎng)法A型H1、H3亞型以及B型陽(yáng)性檢測(cè)率分別是0.96%、4.82%和5.65%；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢出A型H1、H3亞型以及B型陽(yáng)性率分別是1.52%、10.33%和11.57%。見(jiàn)表1。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法檢測(cè)流感病毒陽(yáng)性結(jié)果[例(%)]Table 1 Positive results of influenza virus by cell culture and real-time fluorescence quantitative PCR[cases(%)]

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法的靈敏度和特異度 以細(xì)胞培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法靈敏度為91.01%（81/89），特異度為83.05%（529/637）。見(jiàn)表2。

表2 細(xì)胞培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法檢測(cè)流感病毒結(jié)果（例）Table 2 Results of influenza virus by cell culture and realtime fluorescence quantitative PCR(cases)

3 討 論

目前分離培養(yǎng)法、PCR檢測(cè)法都是檢測(cè)流感病毒的主要方法。細(xì)胞培養(yǎng)方法是目前檢測(cè)流感病毒的金標(biāo)準(zhǔn)，同樣也是檢測(cè)流感病毒的主要方法和基礎(chǔ)，但是其無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速診斷的目標(biāo)[9-10]。PCR檢測(cè)可以準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)流感病毒，而且是一種切實(shí)可行的方法，該方法具有較快的檢測(cè)速度，而且具有較高的靈敏度，無(wú)論樣品質(zhì)量高低均能夠進(jìn)行檢測(cè)[11]。

本研究共收集726例樣本，細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性89例，陽(yáng)性率為12.26%，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法陽(yáng)性189例，陽(yáng)性率為26.03%。細(xì)胞培養(yǎng)A型H1、H3亞型以及B型陽(yáng)性檢測(cè)率分別是0.96%、4.82%和5.65%；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)A型H1、H3亞型以及B型陽(yáng)性檢測(cè)率分別是1.52%、10.33%和11.57%。細(xì)胞培養(yǎng)法在樣本采集時(shí)間、樣本運(yùn)輸、樣本活病毒含量以及保存等方面均存在較高的要求。PCR法檢測(cè)標(biāo)本的病毒核酸，無(wú)論是病毒降解物還是病毒，都能夠檢出病毒RNA，所以在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，PCR陽(yáng)性檢出率要比培養(yǎng)法高[12-13]。建議將2種檢測(cè)方法結(jié)合在一起，以提高檢出率。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法具有靈敏度高、檢出速度快等特點(diǎn)，可被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、常規(guī)監(jiān)測(cè)以及流感疫情應(yīng)急檢測(cè)中。細(xì)胞培養(yǎng)法能夠取得病毒毒株，可用于研究耐藥性、基因特性以及抗原性等。