甲型流感病毒快速基因分型POCT方法的建立

王大剛，王雅杰，潘美晨，焦炳欣，郭 杰，王 爽，郭晶晶，徐 飛，吳吟妮

WHO估計全球每年有10億流行性感冒（流感）病例，其中重癥病例約300萬～500萬，流感相關(guān)呼吸道疾病死亡病例約29萬～65萬。流感病毒是具有高度頻繁變異特性的RNA病毒，容易對藥物產(chǎn)生耐藥并可跨種間傳播。國家流感中心報告近年我國冬春季流行的主要是甲型H1N1、H3N2和乙型流感病毒，流感大流行威脅著全球公共衛(wèi)生安全[1]。由于流感病毒各亞型之間存在交叉感染的風(fēng)險，在流感暴發(fā)流行期間，早期快速分型檢測便于及時隔離不同型別和亞型的流感患者，對防止流感傳播意義重大。

目前流感病毒的檢測方法主要有膠體金篩查流感抗原、免疫血清學(xué)檢測抗體以及RT-PCR和實時熒光定量PCR檢測核酸[2]?？乖鹾Y檢測盡管快速，但其敏感性低且不能區(qū)分亞型；血清學(xué)方法只能檢測IgM和IgG，且耗時較長；核酸檢測方法敏感性高，特異性強(qiáng)，可以區(qū)分亞型，但需要專業(yè)的實驗室和昂貴的儀器設(shè)備，操作復(fù)雜，專業(yè)性要求高，不能滿足基層單位篩查防控的需求[3-4]。ParaDNA核酸POCT檢測儀及其配套的HyBeacon熒光探針檢測技術(shù)是當(dāng)前POCT分子診斷的前沿代表，由于準(zhǔn)確度和靈敏度高、設(shè)計靈活、兼容性好、無交叉污染及支持現(xiàn)場快速檢測等特點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定、病原微生物檢測、食品衛(wèi)生安全以及藥物基因組學(xué)等領(lǐng)域[5-6]。本研究旨在建立一種基于HyBeacon-ParaDNA技術(shù)平臺對甲型流感病毒進(jìn)行快速基因分型的方法，以實現(xiàn)無需核酸提取，無需專業(yè)實驗室支持，直接對患者鼻咽拭子標(biāo)本開展現(xiàn)場快速檢測。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源 2018年12月—2019年3月留取的門診發(fā)熱患者甲型流感病毒抗原膠體金法初篩陽性的鼻咽拭子標(biāo)本50例。其中經(jīng)過實時熒光定量PCR檢測證實M基因和H1N1基因陽性的標(biāo)本48例，M基因陽性而H1N1基因陰性的2例。全部標(biāo)本于-80 ℃冰箱保存，檢測前恢復(fù)至室溫。

1.2 試劑與儀器 HyBeacon熒光探針、dNTP、Phire Hot Start II DNA聚合酶、 GoScript 反轉(zhuǎn)錄酶等試劑，生物標(biāo)本采集器和ParaDNA核酸POCT檢測儀均由北京英諾特生物技術(shù)有限公司提供。甲型/乙型流感病毒抗原檢測試劑盒（膠體金法）購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司。

1.3 引物和HyBeacon熒光探針設(shè)計 從Genbank下 載A/Beijing/501/2009（H1HA pdm09）、A/Guangdong/09/2005（H3HA）、A/WSN/33（H1HA non-pdm09）3種流感病毒株的HA基因序列，用比對工具ClustalOmega識別序列同源性區(qū)域，確定保守區(qū)用于引物和探針設(shè)計。使用NCBI的BLAST工具進(jìn)行序列比對驗證引物的特異性。按照引物設(shè)計原則，用Primer Explorer V5軟件進(jìn)行引物設(shè)計。采用FAM、CFO560、CFR610和Q670熒光素分別標(biāo)記HyBeacon探針，用于M基因、H3HA基因、H1HA non-pdm09/RNase P和H1HA pdm09的檢測。

1.4 多重PCR反應(yīng)體系的建立以及ParaDNA核酸POCT檢測儀的應(yīng)用 多重PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化流程主要包括：①探針設(shè)計，選取最佳的核苷酸錯配和染料標(biāo)記間距，熔解溫度（melting temperature, Tm）設(shè)計為58～62 ℃，避免二級結(jié)構(gòu)，能夠用FAM等多重染料標(biāo)記。②引物設(shè)計，設(shè)計多個引物對確定最佳組合，Tm值60～65 ℃，靶序列長度60～200 bp，避免二級結(jié)構(gòu)。③評估探針和引物的擴(kuò)增效率以及二聚體的形成。④選擇最佳引物對與探針，通過修改退火溫度和維持時間優(yōu)化熱循環(huán)方案，優(yōu)化檢測試劑配方（引物、探針、MgCl2、dNTPs、聚合酶等的濃度），將設(shè)計并優(yōu)化的引物與探針按不同濃度混合于35 μl的反應(yīng)體系中，優(yōu)化變性、退火、循環(huán)數(shù)等反應(yīng)條件。⑤用已知的模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，以驗證優(yōu)化后的反應(yīng)體系。將優(yōu)化好的反應(yīng)體系制成密封試劑盒應(yīng)用于ParaDNA核酸POCT檢測儀。

1.5 檢測下限和特異性分析 為評價反應(yīng)體系的檢測下限，采用合成的已知拷貝數(shù)的甲型流感病毒RNA 為模板，按 5000 copies/μl、500 copies/μl、50 copies/μl、5 copies/μl不同濃度稀釋后進(jìn)行擴(kuò)增。用7種常見的呼吸道病原微生物（柯薩奇病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原體、肺炎支原體、乙型流感病毒）和已知的流感病毒株A/Beijing/501/2009（H1HA pdm09）、A/Guangdong/09/2005（H3HA）、A/WSN/33（H1HA non-pdm09）檢測試劑盒的特異性。

1.6 臨床樣本驗證 用生物取樣器直接刮取保存的臨床鼻咽拭子樣本，插入paraDNA多重反應(yīng)試劑盒中并密封，啟動paraDNA核酸POCT檢測儀進(jìn)行檢測。并用50例甲型流感病毒抗原陽性標(biāo)本的ParaDNA核酸POCT檢測結(jié)果與實時熒光定量PCR核酸檢測結(jié)果對比，初步評價試劑盒對甲型流感病毒抗原初篩陽性標(biāo)本檢測的靈敏度和特異度。

2 結(jié) 果

2.1 引物和HyBeacon熒光探針序列 針對檢測甲型流感病毒的通用M基因和特異的HA基因序列進(jìn)行引物和HyBeacon熒光探針設(shè)計，同時設(shè)計人RNase P基因的引物和探針用于內(nèi)部對照。合成的引物和探針序列見表1。

2.2 ParaDNA核酸POCT檢測儀多重反應(yīng)體系的成分和反應(yīng)條件 將各種引物和探針混合于單管反應(yīng)液中，經(jīng)過不斷優(yōu)化后建立單管多重PCR反應(yīng)體系，加入凝膠后形成半固體狀態(tài)并制作成密封試劑盒，用于ParaDNA核酸POCT檢測儀。單管試劑總反應(yīng)體積為35.000 μl。其主要成分如下：GoScript 緩 沖 液 7.000 μl，MgCl21.750 μl，LGC stock dNTP 混合物 1.120 μl，DFP 2.800 μl，Phire Hot Start II DNA 聚 合 酶 2.800 μl，GoScript酶 0.875 μl，RNasin Plus 0.875 μl，引物和探針混合物10.780 μl，瓊脂糖凝膠7.000 μl。反應(yīng)條件如下：50 ℃ 反轉(zhuǎn)錄5 min，95 ℃變性1 min，擴(kuò)增階段為94 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，50 個循環(huán)。然后進(jìn)行熔解曲線分析，98 ℃ 1 min，20℃ 5 s，之后溫度每升高0.5 ℃采集1次熒光信號，直至90 ℃。檢測完畢后儀器自動報告結(jié)果，并降溫。ParaDNA核酸POCT檢測儀各熒光通道檢測基因及對應(yīng)結(jié)果見表2。

2.3 反應(yīng)體系的檢測下限和特異性 不同濃度梯度的病毒RNA擴(kuò)增結(jié)果證實其檢測下限可達(dá)到50 copies/μl。該反應(yīng)體系對7種常見的呼吸道病原微生物無交叉反應(yīng)，且能對3種流感病毒株 A/Beijing/501/2009（H1HA pdm09）、A/Guangdong/09/2005（H3HA）、A/WSN/33（H1HA non-pdm09）實現(xiàn)特異性擴(kuò)增，見圖1。

表1 甲型流感病毒基因分型引物和HyBeacon熒光探針Table 1 Primers and HyBeacon fluorescent probes for influenza A virus genotyping

表2 ParaDNA檢測儀各熒光通道檢測基因陽性結(jié)果判讀Table 2 Fluorescence channels and gene positive results interpretation of ParaDNA instrument

圖1 3種甲型流感病毒的熔解曲線分析Figure 1 Analysis of 3 influenza A viruses by melting curve

2.4 臨床樣本檢測結(jié)果 用生物取樣器直接采集50例甲型流感病毒抗原膠體金法陽性患者的鼻咽拭子標(biāo)本，啟動ParaDNA核酸POCT檢測儀進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，檢出48例為H1HA pdm09，2例 為 H3HA。48例 H1HA pdm09樣本經(jīng)實時熒光定量PCR驗證均為H1N1陽性，2例H3HA樣本經(jīng)實時熒光定量PCR驗證為H1N1陰性，因此，該快速分型檢測方法的靈敏度和特異度均為100%，見表3。2例H1N1陰性標(biāo)本ParaDNA報告結(jié)果為H3HA，顯示出可以同時分型的優(yōu)勢。檢測結(jié)果如圖2所示。

表3 2種方法甲型流感病毒H1N1檢測結(jié)果（例）Table 3 The detection result of influenza A virus H1N1 by 2 methods(cases)

圖2 ParaDNA儀器檢測甲型流感病毒亞型的熔解曲線Figure 2 The melting curves of influenza A virus subtypes detected by ParaDNA instrument

3 討 論

HyBeacon熒光探針是一種新型熒光探針，不需要淬滅劑，借助DNA堿基固有的熒光淬滅特性，HyBeacon探針上熒光染料的發(fā)光可被與熒光素相鄰的核苷酸抑制。當(dāng)HyBeacon探針與互補(bǔ)DNA靶序列雜交時，熒光強(qiáng)度顯著升高。PCR反應(yīng)擴(kuò)增后，可通過熔解曲線分析鑒定目標(biāo)基因。探針雜交的穩(wěn)定性和Tm取決于HyBeacon與目標(biāo)序列的同源性。將反應(yīng)溫度升高到HyBeacon的Tm以上，探針/靶基因雙鏈解鏈，熒光發(fā)射強(qiáng)度降低。通過針對熔解峰Tm值的分析，可以檢測并區(qū)分低至單個核苷酸序列的不同。諸多研究表明，HyBeacon探針不僅能基于熔解曲線分析的方法實現(xiàn)單條探針分析，檢測多個序列變異位點(diǎn)，而且能夠耐受針對唾液、血液等樣品的直接PCR擴(kuò)增檢測（無需DNA提?。araDNA核酸POCT檢測儀是基于HyBeacon探針技術(shù)的可移動熒光PCR儀器平臺，支持現(xiàn)場快速檢測，目前ParaDNA-HyBeacon平臺已有商品化試劑盒用于法醫(yī)學(xué)、病原微生物檢測和食品衛(wèi)生安全和藥物基因組等領(lǐng)域。

基于該系統(tǒng)簡便、快速、準(zhǔn)確以及便攜式一體化的特點(diǎn)，特別是其可針對臨床樣本直接進(jìn)行檢測的優(yōu)點(diǎn)，英諾特生物技術(shù)公司設(shè)計并開發(fā)了甲型流感病毒快速分型檢測試劑盒，并在本實驗室進(jìn)行了驗證。本實驗室利用ParaDNA-HyBeacon平臺對50例甲型流感病毒抗原膠體金法陽性的鼻咽拭子標(biāo)本進(jìn)行了分型檢測，其中48例檢測結(jié)果為H1HA pdm09型，2例檢測結(jié)果為H3HA型。48例H1HA pdm09陽性標(biāo)本經(jīng)核酸提取后實時熒光定量PCR證實為甲型H1N1，與快速分型檢測結(jié)果基本一致，說明其特異性較好。與實驗室常用的實時熒光定量PCR相比，該方法的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在：①單管多重反應(yīng)體系，可同時對H3HA、H1HA non-pdm09和H1HA pdm09進(jìn)行分型。②取樣器與試劑盒為一次性、密閉性設(shè)計，無須配置試劑，不用擔(dān)心核酸污染。③無須核酸提取，可直接對鼻咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測。④無需專業(yè)實驗室和專業(yè)PCR操作人員，操作簡單，可實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。⑤檢測速度快，從標(biāo)本采集到自動報告結(jié)果僅需1.5 h。然而，該檢測方法仍須進(jìn)一步改進(jìn)，因本研究僅檢測了甲型流感病毒抗原陽性的標(biāo)本，未對甲型流感病毒抗原陰性而核酸檢測陽性的標(biāo)本進(jìn)行分析，后續(xù)將進(jìn)行大樣本量的檢測，以評價該方法檢測臨床樣本的靈敏度和特異度，目前該多重PCR體系核酸檢測的下限可達(dá)到50 copies/μl，還須進(jìn)一步優(yōu)化。

綜上，基于ParaDNA-HyBeacon技術(shù)平臺建立的甲型流感病毒快速基因分型的方法，可用于現(xiàn)場分型檢測，對于流感的診治和防控具有重要的應(yīng)用價值。