正交試驗(yàn)優(yōu)選鼻舒寧溫敏凝膠提取工藝

原 泉 李傳勛2 呂 佳* 周藝璇

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；2.大連醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，遼寧 大連 116044

過敏性鼻炎(lergic rhinitis，AR)屬中醫(yī)鼻鼽范疇，主要癥狀有鼻癢、鼻塞、打噴嚏、流鼻涕等，是一種常見的多發(fā)性鼻病[1]。過敏性鼻炎病因分為外因與內(nèi)因。外因多為氣候變化、環(huán)境污染、風(fēng)寒及火熱之邪內(nèi)侵[2]。內(nèi)因則多責(zé)之于肺脾腎三臟功能失調(diào)。過敏性鼻炎雖然不會(huì)給患者帶來(lái)嚴(yán)重的健康和生命安全威脅，但是卻會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)情緒失調(diào)、疲勞、食欲減退、注意力減退、睡眠紊亂以及學(xué)習(xí)障礙等問題，降低患者生活質(zhì)量，所以必須重視過敏性鼻炎的臨床治[3]。

鼻用溫敏凝膠(nasal thermosensitive in situ ge1)是指以溶液狀態(tài)制備和給藥，在用藥部位因溫度變化刺激而發(fā)生相轉(zhuǎn)變，形成凝膠化半固體的制劑，獨(dú)特的溶液—凝膠轉(zhuǎn)變性質(zhì)兼有制備簡(jiǎn)單、使用方便，可延長(zhǎng)藥物在鼻腔內(nèi)的滯留時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)[4]。泊洛沙姆(poloxamer)是目前研究較為深入的一類溫敏型高分子凝膠材料，具有良好的生物相容性[5]。此次實(shí)驗(yàn)根據(jù)鼻腔的生理特點(diǎn)，制備鼻舒寧溫敏型原位凝膠，以期延長(zhǎng)藥物在鼻黏膜上的滯留時(shí)間，從而提高藥物的生物利用度。

中醫(yī)外治法不但能夠有效控制過敏性鼻炎的癥狀，而且還可以有效降低復(fù)發(fā)率。鼻舒寧溫敏凝膠由麻黃、白芷、皂角等八味中藥組成，臨床上治療過敏性鼻炎有良好的療效。本試驗(yàn)以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿提取量為考察指標(biāo), 通過正交試驗(yàn), 優(yōu)選鼻舒寧凝膠提取工藝條件, 為該制劑的制備工藝研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-2010HT高效液相色譜儀(包括四元泵、VWD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，lab solution 化學(xué)工作站)，日本島津有限公司；AE240型十萬(wàn)分之一電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品(批號(hào)：171241-201809、171237-201510)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈色譜純，水為二次蒸餾水，其余所用試劑皆為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：月旭Welch ultimate XB-C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.02 mol/mL磷酸二氫鉀溶液(每100 mL加入0.28 mL三乙胺，磷酸調(diào)節(jié)pH值到3) (5∶95 )；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液制備：精密稱定鹽酸麻黃堿對(duì)照品0.01060 g，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。濃度為：0.1060 mg/mL。精密稱定鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品0.00692 g，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。濃度為：0.0692 mg/mL。

對(duì)照品溶液制備：精密量取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品溶液各5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。濃度分別為：鹽酸麻黃堿0.0530 mg/mL、鹽酸偽麻黃堿0.0346 mg/mL。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別精密吸取各試驗(yàn)項(xiàng)下提取液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 um微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液,作為供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 依次吸取“2.1.2”項(xiàng)下制備好的混合對(duì)照品溶液1、5、10、15、20 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄其各自的峰面積。以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，各自的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制曲線，求得回歸方程分別為：Y=2215237X+8658.343，r=0.999925；Y=2313705X-5101.35，r=0.999978。結(jié)果表明，在鹽酸麻黃堿在0.0530～1.0600 μg，鹽酸偽麻黃堿在0.0346～0.6920 μg的范圍內(nèi)進(jìn)樣，進(jìn)樣量與峰面積成良好的線性關(guān)系，如圖1所示。

2.1.5 含量測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各 10 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定峰面積,以外標(biāo)法計(jì)算含量。

2.2 提取工藝的考察

2.2.1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì) 方中麻黃為君藥，其中主要含有鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿[6-7]。采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，以方中君藥麻黃中所含鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿提取量為考察指標(biāo)，對(duì)影響提取效果的提取次數(shù)、提取時(shí)間、溶媒用量因素進(jìn)行考察，因素水平見表1。采用 L9(34)正交表安排試驗(yàn)。

表1 因素與水平表

水平A B C 提取次數(shù)/次 提取時(shí)間/h溶媒用量/倍 110.56,4,4 221.08,6,6 331.510,8,8

2.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 提取液的制備：分別取處方量的麻黃、白芷、川芎等藥材，按正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，進(jìn)行提取，濾過，即得正交試驗(yàn)提取液1～9號(hào)。按2.1.1項(xiàng)下色譜條件，分別測(cè)定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的含量，計(jì)算正交試驗(yàn)提取液1～9號(hào)中指標(biāo)成分的含量，記錄各份提取液體積。結(jié)果見表2、3。

表2 L9(34)試驗(yàn)安排與結(jié)果

表3 方差分析

由方差分析可知，以鹽酸麻黃堿、偽麻黃堿總含量為指標(biāo)時(shí)，提取次數(shù)(A)和提取時(shí)間(B)有顯著性差異。由直觀分析可知，提取次數(shù)(A)和提取時(shí)間(B)的2、3水平優(yōu)于1而且兩者差異小，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，確定最優(yōu)提取工藝為A2B3C2,即加8、6倍量的水回流提取2次，每次1.5 h，麻黃堿、偽麻黃堿總轉(zhuǎn)移率高于80%。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 取同批復(fù)方藥材3份，分別按照最優(yōu)提取工藝進(jìn)行試驗(yàn)，制得的樣品測(cè)定鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量。結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn) (n=3)

2.3 陰性供試品溶液的制備 取處方中除麻黃外的其余藥味，按優(yōu)選出的提取工藝提取，得到提取液，同供試品溶液的制備方法處理，制得陰性供試品溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并分別記錄色譜圖，結(jié)果顯示陰性供試品對(duì)該實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾，如圖2、圖3、圖4所示。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下分別在0、2、6、8、12、24 h依次進(jìn)樣10 μL，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD分別為0.50%、0.76%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，RSD分別為0.27%、0.24%，表明儀器有良好的精密度。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，每份5 mL，按供試品溶液制備方法制備樣品，并依法測(cè)定計(jì)算含量及RSD，結(jié)果鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的RSD分別為0.71%、1.15%(n=6)。表明該法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品2.5 mL，共6份，至10 mL量瓶中，依次加入鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液(0.0530 mg/mL)3 mL和鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品溶液(0.0346 mg/mL)3 mL，按供試品制備方法制樣，按“2.1.1”項(xiàng)下進(jìn)樣進(jìn)行分析，計(jì)算回收率，結(jié)果得鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的平均回收率分別為101.94%和102.12%，RSD分別為1.31%和2.37%。

3 討論

3.1 測(cè)定目標(biāo)成分的選擇 麻黃為方中君藥，麻黃中鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿的含量最高，研究表明，鹽酸偽麻黃堿可選擇性地收縮上呼吸道毛細(xì)血管，消除鼻咽部黏膜充血、腫脹、減輕鼻塞等癥狀。對(duì)麻黃等藥材的提取工藝中，往往只局限于以麻黃堿含量為指標(biāo)進(jìn)行工藝的優(yōu)選，具有一定的局限性; 本實(shí)驗(yàn)增加了偽麻黃堿的含量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量之和為指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取工藝。

3.2 方法考察 采用紫外分光光度法對(duì)其進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定210 nm處有最大吸收波長(zhǎng)。查閱文獻(xiàn)[8-10]，確定HPLC法的液相條件為乙腈-0.02 mol/mL磷酸二氫鉀溶液，該方法能夠縮短鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的出峰時(shí)間。并考慮使用三乙胺防止峰拖尾。在紫外波長(zhǎng)范圍內(nèi)，磷酸的紫外吸收干擾比乙酸弱。在低吸收波長(zhǎng)處，乙酸在220 nm左右有吸收，會(huì)干擾吸收峰，故選用磷酸調(diào)節(jié)PH值，優(yōu)化峰型。

3.3 柱溫考察 分別考察柱溫為25 ℃、30 ℃、35 ℃等間隔的不同溫度對(duì)鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同溫度對(duì)兩者的系統(tǒng)適應(yīng)性考察參數(shù)及保留時(shí)間無(wú)明顯影響，故柱溫最終為30℃。

3.4 流速考察 分別選擇流速為0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min等流速對(duì)鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜行為的影響，結(jié)果顯示不同流速對(duì)兩者的系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)和保留時(shí)間無(wú)明顯影響，故流速最終為1.0 mL/min。

3.5 提取參數(shù)的確定 因鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿均具有揮發(fā)性，故回流提取的溫度不宜過高。因此不將溫度梯度作為正交試驗(yàn)的考察因素。前期試驗(yàn)及文獻(xiàn)[11-13]查閱確定了提取的次數(shù)、時(shí)間、溶媒量水平。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，液相條件小的變動(dòng)對(duì)指標(biāo)成分的峰型，分離度，保留時(shí)間均影響較小，此色譜條件可靠，可用于日常含量測(cè)定。采用正交設(shè)計(jì)的方法優(yōu)化出最佳的提取工藝為加8、6倍量的水提取2次，每次提取1.5 h，且驗(yàn)證試驗(yàn)證明回流方法的提取率大于80%。