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    煙草懸浮細(xì)胞在鎘脅迫下微絲形態(tài)與黏彈性變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

    2022-03-11 02:31:46劉藝璇周鐵安蘭雅琴潘煒?biāo)?/span>
    生態(tài)毒理學(xué)報(bào) 2022年6期
    關(guān)鍵詞:微絲煙草彈性

    劉藝璇,周鐵安,2,蘭雅琴,潘煒?biāo)?2,*

    1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128 2. 湖南省細(xì)胞力學(xué)與功能分析工程技術(shù)研究中心,湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),長(zhǎng)沙410128

    近年來(lái)隨著我國(guó)工業(yè)化、城鎮(zhèn)化的快速推進(jìn),以及大量化肥和農(nóng)藥的使用,加之污水灌溉、固體垃圾堆積及礦山開(kāi)采冶煉等多種原因,導(dǎo)致重金屬特別是鎘污染日趨嚴(yán)重。鎘(cadmium, Cd)是環(huán)境中常見(jiàn)的重金屬元素,卻并非植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的必需元素。相反,當(dāng)鎘累積到一定濃度時(shí),植物的生長(zhǎng)發(fā)育與生理活動(dòng)會(huì)受到不同程度的影響。鎘對(duì)植物毒害的表現(xiàn)形式多種多樣[1],游離鎘毒害使植物細(xì)胞骨架組裝紊亂[2],超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)異常[3],葉綠體膜系統(tǒng)崩潰及類(lèi)囊體結(jié)構(gòu)退化[4],組織完整性受損直至植株死亡[5]。水體中的鎘污染可導(dǎo)致水生植物氮代謝紊亂、氮素積累量下降[6];游離鎘可推動(dòng)水體中藻類(lèi)群落演替[7],使水體中浮游植物多樣性下降[8]。環(huán)境中的鎘還在水稻等植物中富集[9],通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體,嚴(yán)重影響人類(lèi)健康[10]。吸收入植物體內(nèi)游離鎘,易與酶活性中心或蛋白質(zhì)中的巰基結(jié)合,取代原本位于活性中心的其他二價(jià)金屬離子,使酶失去原有功能而失活變性,含有Zn、Mg和Fe的酶及光合磷酸化和呼吸電子傳遞鏈等生理活動(dòng)都將受到抑制和破壞[11]。

    植物的鎘逆境脅迫響應(yīng)是多個(gè)代謝酶系統(tǒng)共同參與的整體調(diào)控反應(yīng)[12]。鎘脅迫影響植物內(nèi)生激素平衡,光合能力受損[13];鎘脅迫煙草各項(xiàng)激素與膜質(zhì)過(guò)氧化系統(tǒng)呈現(xiàn)低濃度下合成上升而高濃度時(shí)下降的特征[14];過(guò)氧化酶系統(tǒng)對(duì)清除鎘毒害產(chǎn)生的活性氧具有重要作用[15];植株整體可借助自身結(jié)構(gòu)將所吸收的鎘鈍化并轉(zhuǎn)移,減少外環(huán)境中鎘毒害影響[16];小麥根系在鎘脅迫下會(huì)改變氨基酸分泌物以減輕鎘危害[17]。植物防御素類(lèi)似物蛋白調(diào)控基因CAL1可指導(dǎo)重金屬螯合物的合成,借此定向調(diào)控鎘在植株體中的積累過(guò)程[18]。細(xì)胞自噬過(guò)程中可能通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧應(yīng)答鎘脅迫[19]。植物的不同器官對(duì)鎘耐受程度有所區(qū)別,鎘在水稻不同部位累積為根>莖葉鞘>葉片[20]。鎘脅迫可能通過(guò)影響微管蛋白組裝而擾亂正常的染色體聚合與分配過(guò)程,并引發(fā)染色體畸變[21]。徐萍[22]發(fā)現(xiàn)在10-5mol·L-1鎘濃度下大蒜(AlliumsativumL.)根尖分裂間期微管會(huì)出現(xiàn)異常條紋、斷片和碎片化;分裂期微管會(huì)出現(xiàn)異常的微管凝結(jié)現(xiàn)象。目前對(duì)于植物吸收鎘機(jī)理的生物學(xué)研究大多集中在模式植物和常見(jiàn)農(nóng)作物,對(duì)植物懸浮細(xì)胞在重金屬脅迫下力學(xué)參數(shù)變化的研究目前報(bào)道較少,我們對(duì)砷脅迫[23]和鎘脅迫下植物懸浮細(xì)胞的整體黏彈性與應(yīng)力變化進(jìn)行了初步的探索。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 供試材料

    Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞:自行構(gòu)建的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記微絲[24](Lifeact-EGFP)的轉(zhuǎn)基因本氏煙草(Nicotianabenthamiana)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)Lifeact-EGFP煙草)。在含有100 mg·L-1潮霉素(上海生工)的1/2 MS培養(yǎng)基平板上播種Lifeact-EGFP煙草,待種子萌芽未出真葉時(shí),將萌芽轉(zhuǎn)移到BY-2培養(yǎng)基平板(MS+3.0 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1Sucrose+15 g·L-1Agar)上誘導(dǎo)愈傷組織,愈傷組織長(zhǎng)出后再傳代3~4次,挑取色澤淡黃、質(zhì)地松散的愈傷組織轉(zhuǎn)入BY-2細(xì)胞液體培養(yǎng)基(MS+3.0 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1Sucrose)中擴(kuò)增,每2周繼代一次,繼代時(shí)取少量細(xì)胞懸浮液鏡檢,直至得到離散程度較高的煙草懸浮細(xì)胞。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 鎘脅迫下煙草細(xì)胞微絲組裝程度變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

    配制含鎘BY-2液體培養(yǎng)基:將CdCl2·2.5H2O晶體(國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司,分析純)溶解于BY-2液體培養(yǎng)基中,配制10-2mol·L-1培養(yǎng)基母液,梯度稀釋至10-8mol·L-1。

    靜電黏附界面修飾:與動(dòng)物上皮細(xì)胞不同,植物懸浮細(xì)胞不具備貼壁效應(yīng),需要一個(gè)被修飾的界面使之形成基本同一的單層,以備后續(xù)觀察及監(jiān)測(cè)。聚二烯丙基二甲基氯化銨(poly dimethyl diallyl ammonium chloride, PDADMAC)是一種高分子強(qiáng)陽(yáng)性電解質(zhì),工業(yè)生產(chǎn)中常用于捕捉帶負(fù)電的物質(zhì),此處用于植物細(xì)胞的靜電黏附修飾[25]。ITO小池為實(shí)驗(yàn)室自制,底部為氧化銦錫(indium tin oxide, ITO)鍍層玻片(珠海凱為光電股份有限公司),小池最大容量1 000 μL,實(shí)驗(yàn)中所用最大容量為500 μL。將ITO小池置于超凈臺(tái)內(nèi),紫外線照射滅菌不少于30 min。向ITO小池中加入200 μL經(jīng)過(guò)濾滅菌的1%(V∶V)PDADMAC(Sigma-Aldrich,德國(guó))溶液,遮光修飾不少于30 min,然后吸去多余的1% PDADMAC溶液,在超凈工作臺(tái)內(nèi)以超純氮?dú)?長(zhǎng)沙鑫湘氣體分析儀器經(jīng)營(yíng)部)吹干,使ITO表面形成一層靜電修飾膜。完成后以小塊封板膜密封池口保持內(nèi)部潔凈無(wú)菌。

    在ITO玻底小池中黏附細(xì)胞:將Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞過(guò)篩,提取100~500目之間即短軸徑在25~165 μm的懸浮細(xì)胞為待黏附的細(xì)胞,適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞濃度至每毫升500~1 000個(gè)。吸取過(guò)篩后細(xì)胞懸液500 μL加入到已修飾的ITO小池內(nèi),小塊透明封板膜密封池口,靜置遮光黏附約30 min,使懸浮細(xì)胞被靜電吸引至ITO鍍層表面。

    脅迫實(shí)時(shí)觀察:將黏附細(xì)胞的ITO小池置于LumascopeTM720全自動(dòng)活細(xì)胞成像系統(tǒng)(Etaluma,美國(guó))的載物臺(tái)上,觀察細(xì)胞黏附情況,選取熒光信號(hào)鮮明、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞視野。從小池中替換實(shí)驗(yàn)組濃度的含鎘培養(yǎng)基250 μL,使小池中鎘離子濃度為所加入的含鎘培養(yǎng)基的1/2。迅速開(kāi)啟延時(shí)拍攝程序,設(shè)置總時(shí)長(zhǎng)5 h,間隔時(shí)長(zhǎng)1 min。進(jìn)行空白對(duì)照實(shí)時(shí)觀察時(shí),沿用上述操作,將加入的含鎘培養(yǎng)基更換為無(wú)鎘的BY-2液體培養(yǎng)基。

    基于圖像的熒光半定量分析:選取最具代表性的樣本,將脅迫實(shí)時(shí)觀察采集的圖像導(dǎo)入軟件ImageJ中。Image → Color → Split Channels將三色場(chǎng)分離,選取綠場(chǎng)灰度圖像;Image → Adjust → Threshold選擇Default計(jì)量模式,勾選Dark background識(shí)別暗底背景,設(shè)置量程為40~255;Analyze → Set Measurement,勾選Area、Mean gray value、Standard deviation、Limit to threshold這4項(xiàng);最后Analyze → Measure,測(cè)得該綠場(chǎng)圖像整體的平均灰度強(qiáng)度值(mean gray value, Mean)與熒光區(qū)域面積值(Area),并以公式:熒光強(qiáng)度總和(integrated density, IntDen) = 平均熒光強(qiáng)度(Mean)×熒光區(qū)域面積(Area)求得圖像的總體熒光強(qiáng)度值。每一脅迫觀察取樣31張,即每10 min一幀,取樣時(shí)長(zhǎng)5 h。數(shù)據(jù)處理:使用Origin2018制作基于圖像的熒光半定量數(shù)據(jù)變化圖。

    1.2.2 在QCM-922A多通道石英晶體微天平上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)鎘脅迫下煙草細(xì)胞黏彈性變化

    該法所用Teflon?模塊池為實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì),由Teflon?塊經(jīng)機(jī)床切削制造,規(guī)格適配所用ITO鍍層9 MHz AT切石英晶體傳感器芯片 (仁路晶體) (以下簡(jiǎn)稱(chēng)傳感器芯片)。完成組裝的傳感器芯片-Teflon測(cè)試池,設(shè)計(jì)最大容量250 μL,實(shí)驗(yàn)所用最大容量200 μL。測(cè)試池清潔消毒、黏附界面修飾方法同1.2.1。連通測(cè)試模塊與QCM-922A多通道石英晶體微天平(AMETEK Scientific Instruments Ltd.,美國(guó)),在QCM調(diào)制界面上調(diào)整所測(cè)傳感器芯片相關(guān)參數(shù),設(shè)置采樣時(shí)間為1 s,從空池開(kāi)始實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。待所示曲線平穩(wěn)后,向測(cè)試池加液口中加入BY-2液體培養(yǎng)基200 μL,繼續(xù)運(yùn)行不少于6~8 h,觀察所顯示的圖形;運(yùn)行至平穩(wěn)后,從池中替換100 μL細(xì)胞懸浮液,即向測(cè)試池中加入細(xì)胞3 000~5 000個(gè);繼續(xù)運(yùn)行4~6 h,使懸浮細(xì)胞完全黏附在傳感器芯片表面;待運(yùn)行至平穩(wěn),從小池中替換實(shí)驗(yàn)組濃度的含鎘培養(yǎng)基100 μL,使小池中鎘離子濃度為所加入的含鎘培養(yǎng)基的一半,繼續(xù)運(yùn)行不少于5 h,停機(jī)并保存數(shù)據(jù)。進(jìn)行空白對(duì)照組細(xì)胞黏彈性監(jiān)測(cè)時(shí),沿用上述操作,將替換的含鎘培養(yǎng)基變更為無(wú)鎘的BY-2液體培養(yǎng)基。

    收集在石英晶體微天平上所測(cè)定數(shù)據(jù),以公式CVI=ΔR/ΔF計(jì)算細(xì)胞黏彈性指數(shù)。式中:CVI即細(xì)胞黏彈性指數(shù)(cell viscoelastic index)[26],ΔR為扣除基礎(chǔ)的電阻變化值,ΔF為扣除基礎(chǔ)的頻率變化值。完成計(jì)算后,在Origin2018上繪制CVI隨時(shí)間變化圖。

    1.2.3 鎘脅迫下5 h內(nèi)煙草懸浮細(xì)胞過(guò)氧化氫酶(CAT)活力測(cè)定

    準(zhǔn)備樣品:將煙草懸浮細(xì)胞經(jīng)100目過(guò)篩,抽樣以血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)并估算細(xì)胞濃度。將過(guò)篩的懸浮細(xì)胞等體積分裝至10 mL小離心管中,每管6 mL。

    脅迫處理:1 000 r·min-1離心10 min使細(xì)胞沉淀在底部,將管中一半體積(3 mL)的培養(yǎng)基上清替換為含鎘離子BY-2液體培養(yǎng)基,使管中鎘離子濃度為所加入的含鎘培養(yǎng)基的一半,重懸細(xì)胞并開(kāi)始計(jì)時(shí);在開(kāi)始計(jì)時(shí)后第1、2、3、4和5小時(shí)以去尖移液器吸取細(xì)胞懸浮液1 mL轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中,4 000 r·min-1離心棄去含鎘培養(yǎng)基后,等體積pH 7.4的PBS(北京索萊寶科技有限公司)溶液重懸細(xì)胞,迅速浸入液氮中速凍10 min。

    測(cè)試取樣:將速凍的樣品在4 ℃環(huán)境中解凍后搖勻,3 000 r·min-1離心15 min,取上清為樣品,按過(guò)氧化酶微量樣品試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)操作制樣,用酶標(biāo)儀(Multiskan skyhigh全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技有限公司)測(cè)定。

    數(shù)值統(tǒng)計(jì):計(jì)算酶活力時(shí),根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)所述原理公式,根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需將組織濃度改為細(xì)胞濃度,定義酶活力單位為單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)細(xì)胞分解相應(yīng)底物量(U·cell-1),公式如下:

    每樣本重復(fù)3次以校正偏差,完成計(jì)算后在Origin2018上繪制酶活力隨時(shí)間變化圖。

    2 結(jié)果(Results)

    2.1 鎘脅迫下煙草細(xì)胞微絲組裝程度變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

    如圖1和圖4所示,Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞在10-4~10-7mol·L-1鎘離子脅迫下,細(xì)胞具有的平均熒光強(qiáng)度、熒光區(qū)域面積與熒光強(qiáng)度總和均在脅迫觀察早期就開(kāi)始下降;熒光信號(hào)的上述3個(gè)參數(shù)在10-4mol·L-1組別下降最快;在10-4~10-6mol·L-1組別,脅迫處理所用鎘離子濃度越大,細(xì)胞熒光信號(hào)下降的速度越快;在10-7mol·L-1組別,細(xì)胞熒光信號(hào)在脅迫開(kāi)始早期下降得很快,但在后期下降速度很慢,并且直到觀察結(jié)束時(shí),細(xì)胞內(nèi)還有殘余的熒光信號(hào)。在10-8mol·L-1組別中,細(xì)胞具有的平均熒光強(qiáng)度、熒光區(qū)域面積與熒光強(qiáng)度總和在脅迫觀察早期呈現(xiàn)上升,熒光強(qiáng)度總和高于脅迫觀察開(kāi)始時(shí)的值,并在高于初始值的范圍內(nèi)保持近1 h,而后緩慢下降(圖2和圖4(e))。Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞在無(wú)鎘離子脅迫時(shí),微絲熒光強(qiáng)度緩慢下降(圖3和圖4(f))。

    圖1 Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞在10-4~10-7 mol·L-1鎘離子脅迫下的熒光實(shí)時(shí)觀察圖像注: (a) 10-4 mol·L-1,(b) 10-5 mol·L-1,(c) 10-6 mol·L-1,(d) 10-7 mol·L-1;從左至右分別為0 s、10 min、1 h和2 h時(shí)的細(xì)胞熒光強(qiáng)度實(shí)時(shí)變化,標(biāo)尺為100 μm。Fig. 1 Real-time fluorescence images of Lifeact-EGFP tobacco suspension cells observed under the stress of 10-4~10-7 mol·L-1 cadmium ionNote: (a) 10-4 mol·L-1, (b) 10-5 mol·L-1, (c) 10-6 mol·L-1, (d) 10-7 mol·L-1; from left to right are the real-time changes of cells’ fluorescence intensity at 0 s, 10 min, 1 h and 2 h; bar is 100 μm.

    圖2 Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞在10-8 mol·L-1鎘離子脅迫下不同時(shí)間的熒光實(shí)時(shí)觀察圖像注:標(biāo)尺為100 μm。Fig. 2 Real-time fluorescence images of Lifeact-EGFP tobacco suspension cells observed under the stress of 10-8 mol·L-1 cadmium ion at different timeNote: Bar is 100 μm.

    圖3 Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞在無(wú)鎘離子脅迫下不同時(shí)間的熒光實(shí)時(shí)觀察圖像注:標(biāo)尺為100 μm。Fig. 3 Real-time fluorescence images of Lifeact-EGFP tobacco suspension cells in the absence of cadmium ion (blank control) at different timeNote: Bar is 100 μm.

    圖4 Lifeact-EGFP煙草懸浮細(xì)胞在不同濃度鎘離子脅迫下0~5 h的熒光強(qiáng)度總和(IntDen)實(shí)時(shí)變化注:(a) 10-4 mol·L-1;(b) 10-5 mol·L-1;(c) 10-6 mol·L-1;(d) 10-7 mol·L-1;(e) 10-8 mol·L-1;(f) 空白對(duì)照。Fig. 4 Real-time changes of the total fluorescence intensity (IntDen) of Lifeact-EGFP tobacco suspension cells under the stress of different concentrations of cadmium ion for 0~5 hNote: (a) 10-4 mol·L-1; (b) 10-5 mol·L-1; (c) 10-6 mol·L-1; (d) 10-7 mol·L-1; (e) 10-8 mol·L-1; (f) blank control.

    2.2 QCM-922A多通道石英晶體微天平上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)鎘脅迫下煙草細(xì)胞黏彈性變化

    PDADMAC靜電修飾方法將煙草懸浮細(xì)胞黏附在傳感器芯片表面,通過(guò)QCM技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同濃度鎘離子脅迫下煙草懸浮細(xì)胞的黏彈性變化。結(jié)果顯示,煙草懸浮細(xì)胞在10-4~10-7mol·L-1鎘離子濃度范圍脅迫下,細(xì)胞黏彈性在監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)早期短暫上升,總體趨勢(shì)下降的變化(圖5(a)~(d));在10-8mol·L-1鎘離子脅迫下,細(xì)胞黏彈性在監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)先降后升的變化(圖5(e));在無(wú)鎘離子的空白對(duì)照中,在更換培養(yǎng)基早期細(xì)胞黏彈性下降,后期保持不變(圖5(f))。

    圖5 煙草懸浮細(xì)胞在不同濃度鎘離子脅迫下5 h內(nèi)細(xì)胞黏彈性指數(shù)(CVI)變化注:(a)10-4 mol·L-1;(b)10-5 mol·L-1;(c)10-6 mol·L-1;(d)10-7 mol·L-1;(e)10-8 mol·L-1;(f)空白對(duì)照。Fig. 5 Changes of cell viscoelasticity index (CVI) of tobacco suspension cells under the stress of different concentrations of cadmium ion within 5 hNote: (a) 10-4 mol·L-1; (b) 10-5 mol·L-1; (c) 10-6 mol·L-1; (d) 10-7 mol·L-1; (e) 10-8 mol·L-1; (f) blank control.

    2.3 鎘脅迫下5 h內(nèi)煙草懸浮細(xì)胞過(guò)氧化氫酶活力測(cè)定

    如圖6所示,所有實(shí)驗(yàn)組別CAT酶活力均高于空白對(duì)照,并呈現(xiàn)出先升后降的整體變化趨勢(shì)。其中10-8mol·L-1組別的酶活力波動(dòng)程度最小。

    圖6 過(guò)氧化氫酶(CAT)在不同濃度梯度鎘離子脅迫下5 h內(nèi)酶活力變化Fig. 6 Catalase (CAT) activity changes within 5 h under different concentration gradient of cadmium ion stress

    3 討論(Discussion)

    懸浮細(xì)胞本身具有分化程度低、代謝較旺盛、與相鄰細(xì)胞粘連程度低等特點(diǎn),這使得我們能夠從細(xì)胞層次探索鎘逆境脅迫過(guò)程中植物細(xì)胞生理效應(yīng)的變化。通過(guò)綠色熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞微絲,本研究首先監(jiān)測(cè)了不同濃度鎘離子脅迫下細(xì)胞微絲形態(tài)的變化。采用本課題組建立的植物細(xì)胞力學(xué)方法[23, 25-26],本研究探索了鎘逆境脅迫對(duì)煙草懸浮細(xì)胞黏彈性指數(shù)的影響。我們認(rèn)為鎘脅迫下植物細(xì)胞黏彈性變化的主要影響因素包括細(xì)胞壁的侵蝕與交聯(lián)程度變化、細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的崩解、細(xì)胞骨架的聚合和解聚等3個(gè)方面。

    細(xì)胞壁是重金屬離子跨膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的第一道屏障結(jié)構(gòu)。一方面,細(xì)胞壁對(duì)重金屬離子的固定、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程起著重要的作用。另一方面,環(huán)境中的鎘離子在細(xì)胞壁兩側(cè)化學(xué)勢(shì)差的推動(dòng)下,可從外至內(nèi)逐漸侵蝕破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[27],使細(xì)胞壁逐漸解體。細(xì)胞壁外側(cè)受侵蝕同時(shí),胞內(nèi)過(guò)氧化物累積促使酚類(lèi)化合物和糖蛋白作用促進(jìn)細(xì)胞壁交聯(lián)[28];而在后期過(guò)氧化物積累形成的羥自由基[29]將切割細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中糖鍵,促進(jìn)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的解體。目前由于實(shí)驗(yàn)條件的限制,本研究無(wú)法區(qū)分細(xì)胞壁黏彈性與細(xì)胞膜黏彈性變化。本文也從細(xì)胞力學(xué)角度首次發(fā)現(xiàn)了在10-4~10-7mol·L-1鎘離子濃度范圍脅迫下,細(xì)胞黏彈性短暫上升(細(xì)胞變硬)的現(xiàn)象。

    在鎘侵蝕細(xì)胞壁同時(shí),極少量的鎘離子通過(guò)細(xì)胞膜上鈣離子通道[30]進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),擾亂細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白信號(hào)通路調(diào)控[31]的一系列原有生理活動(dòng),細(xì)胞內(nèi)生理反應(yīng)活動(dòng)失控。游離鎘可誘發(fā)細(xì)胞膜電位去極化與超極化[32]。細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)將從線粒體等高代謝率部位開(kāi)始大量累積膜質(zhì)過(guò)氧化物等自由基[33],伴隨著細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)系統(tǒng)上膜脂過(guò)氧化物的大量累積[34],原有生物膜磷脂雙分子結(jié)構(gòu)破壞并擴(kuò)散為整個(gè)細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的解體[35]。細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的崩解是本研究監(jiān)測(cè)到的CVI后續(xù)降低(細(xì)胞變軟)重要影響因素。

    鎘逆境脅迫對(duì)細(xì)胞內(nèi)微絲骨架的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的影響呈現(xiàn)多態(tài)性。本研究觀測(cè)到了微絲骨架在鎘脅迫下普遍的解聚和在極低濃度鎘離子(10-8mol·L-1)脅迫下的早期聚合現(xiàn)象(圖1和圖2)。一種可能的解釋是極微量的胞內(nèi)游離二價(jià)鎘取代原有鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)信號(hào)通路,不可逆地促進(jìn)肌動(dòng)蛋白單體合成[36]。然而在本文所涉整個(gè)鎘逆境脅迫中,細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)肌動(dòng)蛋白合成與微絲組裝的因素,其效力遠(yuǎn)低于破壞細(xì)胞肌動(dòng)蛋白合成與微絲組裝的各種因素。在鎘離子脅迫下,胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白單體結(jié)構(gòu)異常及變性[37];細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)塌陷解體使與膜結(jié)構(gòu)相連的微絲結(jié)構(gòu)與膜系統(tǒng)一同解體[38],表現(xiàn)為所觀測(cè)到的微絲標(biāo)記熒光信號(hào)的不斷下降(圖1和圖4)。

    本文從細(xì)胞力學(xué)角度為植物重金屬逆境脅迫生理生化的研究提供了新的視角。目前對(duì)植物細(xì)胞黏彈性監(jiān)測(cè)的研究方法尚不完備,無(wú)法全面地解釋鎘逆境下植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的詳細(xì)動(dòng)態(tài)響應(yīng)過(guò)程與生物力學(xué)參數(shù)變化,如需詳細(xì)探索重金屬脅迫對(duì)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響機(jī)制,尚待細(xì)胞力敏傳感技術(shù)、高分辨率成像工具與細(xì)胞內(nèi)示蹤技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。

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