不同性別MTHFR基因多態(tài)性協(xié)同葉酸水平差異對血清同型半胱氨酸的影響研究

舒 放，王海峰，薛飛肖，寧 可，史珊珊，呂海港

1.西安市第三醫(yī)院檢驗科(西安 710018)；2.西安市紅會醫(yī)院麻醉科(西安 710054)

始于1976年的眾多流行病學(xué)研究表明，高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia，HHcy)是心血管疾病(Cardiovascular diseases，CVDs)的獨(dú)立危險因素[1]。同型半胱氨酸(Hcy)是氨基酸半胱氨酸的異種，其代謝作用有兩種途徑：再甲基化和轉(zhuǎn)硫作用。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是再甲基化循環(huán)中的關(guān)鍵調(diào)控酶[2]，在Hcy代謝過程中起到重要作用。人MTHFR催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原(5,10-MTHF)為5-亞甲基四氫葉酸(5-MTHF)，5-MTHF是同型半胱氨酸甲基化成蛋氨酸中起重要作用的因子。人類MTHFR基因位于染色體1p36.3，全長1980bp，MTHFR基因第4外顯子上的第677位核苷酸(C677T，rs1801133)的胞嘧啶(C)替代胸腺嘧啶(T)是一個常見的MTHFR基因多態(tài)性[3]，由此存在三種基因型：MTHFR C677C(野生型)、MTHFR C677T(雜合突變型)、MTHFR T677T(純合突變型)，突變使得再甲基化循環(huán)障礙，從而導(dǎo)致Hcy在體內(nèi)蓄積，血清Hcy水平升高[4]。有研究表明， 血清Hcy水平易受B族維生素(葉酸、維生素B12和維生素B6)調(diào)節(jié)[5]。葉酸缺乏亦會提高Hcy水平和高同型半胱氨酸血癥的發(fā)病率[6-7]。此外，補(bǔ)充葉酸有助于降低高Hcy濃度的毒性并受到MTHFR基因型調(diào)控[8-9]。本文著重探討葉酸缺乏合并Hcy代謝基因多態(tài)性對血清Hcy水平的影響以及性別因素的差異性。

材料及方法

1 標(biāo)本采集 篩選西安市第三醫(yī)院2017年2-7月間住院病人病例共88例，其中男性39例，女性49例，年齡18～85歲，均來自健康管理中心。收集病例年齡、性別、血壓、等數(shù)據(jù)。血清學(xué)檢測排除溶血、嚴(yán)重脂血、黃疸等影響因素。

2 血清學(xué)檢測 早8:00-9:00間采集靜脈血4ml，3000r/min離心15min，分離血清，4℃可保存3d，長期保存需-20℃凍存。Beckman AU5800全自動生化分析儀檢測血清葡萄糖(Glu)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、Hcy，以上檢測項目需離心后2 h內(nèi)檢測； Unicel DXI 800化學(xué)發(fā)光分析儀檢測血清葉酸(Fol)。樣本檢測當(dāng)日儀器均運(yùn)行正常，質(zhì)控在控，CV<5%。

3 MTHFR基因多態(tài)性檢測

3.1 全血基因組DNA提取試劑盒分離全血中的基因組DNA。

3.2 每人分做兩個反應(yīng)體系，分別含有C677T基因突變型特異引物及野生型特異引物。每個反應(yīng)體系包括29μl擴(kuò)增液、1μl反應(yīng)液(含Taq DNA酶、UNG酶)、3μl待測基因組DNA、17μl ddH2O補(bǔ)至總體積50μl。

3.3 等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Allele Specific PCR,AS-PCR)。Roche cobas?480全自動熒光定量PCR分析儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。擴(kuò)增程序為50℃ 2min；95℃ 5min；94℃ 30s、60℃ 30s、65℃ 1min(26Cycles)；65℃ 10min；4℃ Hold。

3.4 將兩管擴(kuò)增產(chǎn)物分別滴在檢測卡對應(yīng)的樣品墊處，2～5min根據(jù)在線檢測線(T線)是否出現(xiàn)條帶判讀C677T位點(diǎn)的基因型。C/C為野生型，C/T為雜合突變型； T/T為純合突變型。

4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SSPS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，t檢驗分析不同性別基本臨床參數(shù)(Glu、TG、BP、Hcy、Fol)差異性及MTHFR基因多態(tài)性分布差異；不同性別MTHFR基因多態(tài)性合并血清葉酸不同水平時血清Hcy水平差異性。

結(jié) 果

1 不同性別基本臨床參數(shù)的比較 見表1?；緟?shù)如血壓、Glu、TG、TC在不同性別間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，F(xiàn)ol水平在不同性別間有統(tǒng)計學(xué)差異性(P<0.05)，女性Fol高于男性。

2 不同性別MTHFR基因多態(tài)性分布 見圖1。 C/C野生型占14.8%，C/T雜合突變型占47.7%；T/T純合突變型占37.5%，不同性別間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

3 MTHFR C677T基因多態(tài)性Hcy、Fol水平比較 見表2。三種MTHFR基因多態(tài)性樣本組間血清Hcy水平比較有統(tǒng)計學(xué)差異。

4 不同性別MTHFR基因多態(tài)性合并葉酸缺乏者血清Hcy水平比較 見表3。不同性別葉酸缺乏組間血清Hcy水平比較，有統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 不同性別基本臨床參數(shù)

注：本組不同性別比較，*P值<0.05

表2 MTHFR基因多態(tài)性合并血清葉酸不同水平時血清Hcy水平比較

注：Fol測定值≥5.9nmol/L入Fol不缺乏組，<5.9nmol/L入Fol缺乏組；與Fol缺乏組比較，*P<0.05

表3 不同性別MTHFR 基因多態(tài)性合并葉酸缺乏者Hcy水平比較

注：與本組不同性別比較，*P<0.05

圖1 不同性別MTHFR基因多態(tài)性分布

討 論

HHcy可能導(dǎo)致動脈粥樣硬化這一觀點(diǎn)最初是1969年由Mc Cully在一項對兒童蛋氨酸代謝障礙的研究中首次提出[10]。此后，幾十年來，許多研究試圖揭示Hcy對CVDs的致病機(jī)理以及探討這種相關(guān)性是否適用于不同人群[11-13]，目前絕大多數(shù)的研究都證實了這一觀點(diǎn)。而另一些研究觀點(diǎn)認(rèn)為Hcy可能是CVDs的標(biāo)志物而不是誘因[14]。此外，其他一些臨床及流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)異常HCY也可能在糖尿病、內(nèi)皮功能障礙、先天性缺陷和認(rèn)知障礙的過程中發(fā)揮作用[15-16]。MTHFR 677基因多態(tài)性還同復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent pregnancy loss，RPL)密切相關(guān)，其中基因位點(diǎn)C→T突變可造成孕婦血同型半胱氨酸水平上升，造成胎兒發(fā)育障礙，引起流產(chǎn)風(fēng)險上升[17]。

MTHFR是調(diào)節(jié)Hcy代謝的關(guān)鍵酶，其中677基因位點(diǎn)突變造成MTHFR的一個基因多態(tài)性(SNP rs1801131)。從人外周血細(xì)胞中提取基因組DNA的方法，通過對等位基因MTHRF C677T基因突變位點(diǎn)的引物設(shè)計及標(biāo)記，利用等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Allele Specific PCR,AS-PCR)方法擴(kuò)增獲得特定的擴(kuò)增片段，標(biāo)記有地高辛分子的PCR產(chǎn)物在與所構(gòu)建的基因分型檢測體系中納米金磁微粒表面抗地高辛單抗相互作用，通過側(cè)向流層析技術(shù)實現(xiàn)MRHFR C677T基因多態(tài)性的檢測。相應(yīng)的中國人群MTHFR 677純合突變率高達(dá)29%，雜合突變高達(dá)44%，正常MTHFR 677CC基因型(野生型)僅占27%。無論是雜合突變(677CT)或純合突變(677CC)都造成酶活性的減低，從而影響Hcy代謝，造成體內(nèi)堆積。血漿Hcy水平受遺傳和環(huán)境因素的影響。而在這些因素中，血清葉酸是同型半胱氨酸升高最強(qiáng)的獨(dú)立因素。臨床研究顯示，葉酸口服可有效治療高同型半胱氨酸血癥[18]。故葉酸的缺乏被認(rèn)為是心血管疾病的一個危險因素。除此之外，米蔓麗等[19]研究指出，可對RPL患者同時進(jìn)行MTHFR基因多態(tài)性和空腹同型半胱氨酸篩查，以對其流產(chǎn)風(fēng)險進(jìn)行評估，并及早采取干預(yù)措施。

本研究中，受試者年齡、收縮壓、舒張壓、Glu、TG、TC等連續(xù)變量均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。血清Hcy水平高于15μmol/L被定義為HHcy[20]，血清葉酸水平低于5.9 nmol/L作為葉酸缺乏判斷標(biāo)準(zhǔn)。與女性相比，男性表現(xiàn)出較高的收縮壓、舒張壓及血清Hcy水平(P<0.05)，較低的血清葉酸水平(P<0.05)。與MTHFR 677CC 及 MTHFR 677CT攜帶者相比，MTHFR 677TT基因型的患者有較高的血清Hcy水平(P<0.05)。不同性別MTHFR基因C677T多態(tài)性聯(lián)合葉酸缺乏對Hcy水平的影響主要體現(xiàn)在T677T型別，由于這種純合突變本身更易造成葉酸代謝障礙，從而導(dǎo)致Hcy水平升高。結(jié)合性別因素，男性較女性葉酸水平整體偏低，葉酸水平及MTHFR 677基因型二者共同影響下造成男性MTHFR基因純合突變者其血清Hcy水平與女性比存在顯著性差異。而在MTHFR基因多態(tài)性C677C和C677T兩型受檢者的血清Hcy無明顯性別差異性，原因除了該兩種基因型決定了葉酸代謝水平應(yīng)比T677T型高外，環(huán)境因素和飲食因素可能在葉酸攝取及Hcy水平方面也起到一定作用，弱化了該兩種基因型的血清Hcy在性別間的差異性。

綜上所述，MTHFR 677三種基因型中純合突變(TT)型者更易造成血清Hcy代謝障礙，此類型的基因型個體合并葉酸缺乏者其血清Hcy升高。故MTHFR T677T型尤其是男性更應(yīng)注重葉酸的攝取及補(bǔ)充，降低HHCY的風(fēng)險概率。