脈沖電磁場(chǎng)調(diào)控SREBP-1c及氧化應(yīng)激改善db/db小鼠肝脂肪變性研究*

劉 穎，李遠(yuǎn)轍，周聲毅，阮俊勇，羅二平，景 達(dá)，翟明明△

1.解放軍陸軍防化學(xué)院(北京 100113)；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系(西安 710032)

非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是目前我國(guó)第一大慢性肝病，已成為備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。NAFLD的早期癥狀為異常肝臟脂肪堆積，15%～20%的病人會(huì)進(jìn)展成為更嚴(yán)重的非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)。NASH表現(xiàn)為胰島素抵抗和氧化應(yīng)激等，導(dǎo)致肝細(xì)胞膨脹、凋亡和肝星狀細(xì)胞活化，增加了肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[2]。目前，NAFLD尚無(wú)公認(rèn)特效治療藥物,因此尋找針對(duì)NAFLD及相關(guān)肝脂肪代謝的有效治療手段具有重要臨床意義。

低頻脈沖電磁場(chǎng)(Pulsed electromagnetic fields，PEMF)作為一種安全的、非侵入式治療手段被FDA所批準(zhǔn)，其生物學(xué)效應(yīng)也被用于肝臟研究。Ottani等對(duì)肝部分切除術(shù)后大鼠施加PEMF，促進(jìn)了肝再生[3]。崔紅等對(duì)db/db小鼠施加PEMF刺激后，胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)得到明顯改善，并且減輕了肝脂肪變[4]。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PEMF改善肝臟脂肪變性及IR的積極效果，但具體機(jī)制尚不明確。

IR發(fā)生機(jī)制雖然尚未完全闡明，但目前的研究認(rèn)為氧化應(yīng)激是其誘因[5-6]。氧化應(yīng)激是由過(guò)度產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)引起的，主要是在線粒體氧化磷酸化過(guò)程中產(chǎn)生。作為營(yíng)養(yǎng)代謝的中心，肝臟富含線粒體，因此易受ROS攻擊[7]。通常血糖代謝由多種激素調(diào)節(jié)以保持動(dòng)態(tài)平衡，而肝臟是這些激素作用的主要目標(biāo)，在糖酵解和葡聚糖生成中起到主要作用。眾多激素中，只有胰島素可以降低血糖，一旦肝臟對(duì)胰島素產(chǎn)生抵抗，血糖控制將出現(xiàn)問(wèn)題，常伴隨肥胖、糖尿病等其它改變。大量研究表明，抗氧化手段可以有效改善IR的發(fā)生、發(fā)展。

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1 (Sterol regulatory element-binding proteins 1，SREBP-1)是調(diào)控脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在 NAFLD 患者肝組織中過(guò)度表達(dá)，引起肝臟脂肪堆積[8]。SREBP-1c作為核轉(zhuǎn)錄因子 SREBP-1的亞型，參與調(diào)控葡萄糖代謝、脂肪酸及脂質(zhì)合成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均發(fā)現(xiàn)，SREBP-1c在體內(nèi)異常過(guò)度表達(dá)，會(huì)誘導(dǎo)脂肪合成上調(diào)，導(dǎo)致肝臟等脂質(zhì)堆積。當(dāng)SREBP-1c 表達(dá)下調(diào)，可以改善肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝失衡[9]。然而，SREBP-1c是否介導(dǎo)PEMF改善NAFLD肝臟脂肪變性尚不明確。

本研究使用脈沖波形PEMF作用于NAFLD模型小鼠，以探究其改善db/db小鼠肝脂肪變性的潛在機(jī)制。

材料與方法

1 主要試劑 二奎琳甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司?？贵w均購(gòu)自Santa公司。胰島素ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。血糖試紙購(gòu)自Roche。甘油三酯(Triglyceride，TG)、丙二醛(Methane dicarboxylic aldehyde，MDA)、還原性谷胱甘肽(Reduced glutathione，GSH) /氧化型谷胱甘肽(Oxidized GSH，GSSG)定量試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。8只8周齡雌性C57BL/KsJ 小鼠(18.07 ± 1.54) g和16只8周齡雌性 C57L/6J db/db小鼠(29.73 ± 2.27) g購(gòu)自南京大學(xué)。動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)：12 h/12 h明暗交替，溫度調(diào)節(jié)(22±1)℃，自由攝食、水。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理：對(duì)照組由8只C57BL/KsJ小鼠組成；將16只 C57BL/6J db/db小鼠隨機(jī)平均分為NAFLD組及PEMF組。NAFLD組模型小鼠不加任何處理，PEMF組模型小鼠每天施加1 h刺激(PEMF頻率為15.38 Hz，場(chǎng)強(qiáng)為20 Gs，持續(xù)12 周)。

3.2 胰島素抵抗評(píng)價(jià)：小鼠禁食過(guò)夜后，取尾尖靜脈血檢測(cè)空腹血糖。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死前用乙醚麻醉，摘眼球取全血，并在37℃靜置2 h后進(jìn)行570 g離心10 min，取上清。按照胰島素ELISA試劑盒說(shuō)明對(duì)血清胰島素含量進(jìn)行測(cè)定。按照公式：

計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型的胰島素抵抗指數(shù)。

3.3 油紅O染色：10 μm冰凍肝臟切片在20℃進(jìn)行油紅O染色10 min，經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗后置于Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察脂質(zhì)堆積。

3.4 甘油三酯測(cè)定：按照說(shuō)明書(shū)，取100 mg肝組織樣本在0.9 ml無(wú)水乙醇中進(jìn)行冰浴勻漿，然后570 g離心10 min，取上清，進(jìn)行甘油三酯檢測(cè)。

3.5 抗氧化酶活性檢測(cè)：按照說(shuō)明書(shū)，取100 mg肝組織樣本在0.9 ml 生理鹽水(0.9%)中進(jìn)行冰浴勻漿570 g離心10 min后取上清檢測(cè)MDA。GSH/GSSG的檢測(cè)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)中操作。

3.6 蛋白印跡：肝臟組織樣本使用RIPA裂解液在冰上進(jìn)行裂解30 min，然后進(jìn)行20000 g離心，取上清，使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量。蛋白樣品加入上樣緩沖液后，95℃加熱5 min進(jìn)行變性處理，然后按照常規(guī)SDS-PAGE方法進(jìn)行檢測(cè)。蛋白條帶采用Quantity One軟件進(jìn)行定量。β-actin作為內(nèi)參蛋白。

結(jié) 果

1 PEMF改善模型小鼠的胰島素抵抗 對(duì)照組小鼠空腹血糖為(4.10±0.18)mmol/L，血清胰島素為(10.80±1.08)mIU/L，HOMA-IR為2.13±0.22；NAFLD組db/db小鼠空腹血糖為(30.22±1.18)mmol/L，血清胰島素為(6.90±0.30)mIU/L，HOMA-IR為(6.97±0.32)；經(jīng)PEMF干預(yù)后，db/db鼠空腹血糖為(22.9±2.18)mmol/L，空腹血清胰島素(3.53±0.65)mIU/L，HOMA-IR(4.01±0.54)。PEMF組較NAFLD組胰島素抵抗明顯改善(圖1)。

2 PEMF緩解模型小鼠肝氧化應(yīng)激 與NAFLD組相比，PEMF組MDA及GSSG水平顯著下降，而GSH與GSH-Px水平明顯上升(圖2)。

3 PEMF減少肝脂質(zhì)堆積 油紅O染色在40倍鏡下觀察結(jié)果顯示，PEMF組脂滴數(shù)量和大小均顯著降低(圖3 A)。PEMF組SREBP-1c的蛋白表達(dá)量較NAFLD組減少約35%左右(圖3 B)。除此之外，肝臟TG含量PEMF組降低至(4.49±0.86) mmol/gprot，而NAFLD組含量為(7.60±0.21) mmol/gprot(圖3C)。

圖1 PEMF改善NAFLD模型小鼠的胰島素抵抗(與對(duì)照組相比，*P<0.05；與NAFLD組相比，#P<0.05)

圖2 PEMF改善NAFLD模型小鼠的氧化還原穩(wěn)態(tài)(與對(duì)照組相比，*P<0.05；與NAFLD組相比，#P<0.05)

圖3 PEMF改善NAFLD模型小鼠肝脂質(zhì)堆積[A：冰凍切片油紅O染色 (×40)；B：SREBP-1c蛋白表達(dá)；C：肝臟三酰甘油含量]

討 論

當(dāng)前我國(guó)肥胖和代謝綜合征患病率增長(zhǎng)迅速，NAFLD的患病率已超過(guò)西方國(guó)家，成為我國(guó)肝、代謝領(lǐng)域的新挑戰(zhàn)，對(duì)全民健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[10]。2型糖尿病并發(fā)NAFLD存在著顯著的胰島素抵抗[11]。因此迫切需要尋找到有效的、公認(rèn)的治療方法，用以預(yù)防和治療NAFLD。PEMF作為安全、非侵入式物理手段已經(jīng)被廣泛用在臨床治療骨愈合等疾病[12]?；赑EMF的積極生物學(xué)效應(yīng)，本研究驗(yàn)證了PEMF改善db/db小鼠肝脂肪變性的作用，并對(duì)潛在分子機(jī)制進(jìn)行了探究。

2018年更新的《非酒精性脂肪性肝病防治指南》中指出，治療NAFLD的首要目標(biāo)為減肥和改善胰島素抵抗。NAFLD與胰島素抵抗密切相關(guān)，伴隨有過(guò)量的游離脂肪酸在肝臟轉(zhuǎn)換為T(mén)G儲(chǔ)存，導(dǎo)致脂肪變性[10]。本研究對(duì)模型小鼠施加外源性物理刺激后，模型小鼠的空腹血清胰島素水平、HOMA-IR指標(biāo)均顯著降低，驗(yàn)證了PEMF對(duì)胰島素抵抗的積極作用。目前已有體外實(shí)驗(yàn)證明過(guò)氧化氫會(huì)誘發(fā)3T3-L1細(xì)胞IR[13]。Zucker大鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明了這點(diǎn)[14]。人體研究表明高脂飲食會(huì)增加線粒體過(guò)氧化氫生成和IR[6，15]。當(dāng)對(duì)嚙齒動(dòng)物采用線粒體靶向抗氧化劑干預(yù)或過(guò)度表達(dá)過(guò)氧化氫酶時(shí)，能有效改善高脂飲食引起的IR[15]。氧化應(yīng)激目前被認(rèn)為是NAFLD發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素，活性氧的產(chǎn)量增加導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。為了探究PEMF改善模型小鼠IR是否與氧化應(yīng)激相關(guān)聯(lián)，本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與NAFLD組相比較，PEMF組的MDA下調(diào)，而GSH與GSH-Px水平明顯上升，GSSG水平顯著下降。MDA是氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，肝臟MDA形成與過(guò)氧化脂質(zhì)常被作為肝組織損傷和氧化損傷的生物標(biāo)志。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化作用的產(chǎn)物，最終能被降解，進(jìn)而改變細(xì)胞和細(xì)胞膜的生物功能，其下調(diào)表明氧化應(yīng)激減弱。此外，脂質(zhì)在肝臟堆積經(jīng)常加速M(fèi)DA的釋放，這就導(dǎo)致核線粒體DNA的損傷以及活性氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。GSH是一種重要的非酶的抗氧化劑，上調(diào)起到避免氧化應(yīng)激損傷的作用；GSH-Px是一種廣泛分布在體內(nèi)的重要酶，可代謝毒性過(guò)氧化物，如過(guò)氧化氫和脂質(zhì)水解過(guò)氧化物，進(jìn)入非毒性的羥基化合物中，利用GSH作為一種共同底物合成GSSG，以保護(hù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，防止過(guò)氧化物的干擾和損傷?？傊?，PEMF通過(guò)上調(diào)GSH-Px表達(dá)提高總抗氧化酶的活性，通過(guò)上調(diào)GSH表達(dá)提高抗氧化能力，進(jìn)而弱化了db/db小鼠肝臟的氧化應(yīng)激，MDA的下調(diào)印證了PEMF保護(hù)肝臟避免氧化應(yīng)激損傷。

SREBP-1c是肝臟內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪新生的重要的轉(zhuǎn)錄因子，它專門(mén)調(diào)控脂肪酸生物合成途徑中多種關(guān)鍵酶的表達(dá)。SREBP-1c在db/db小鼠體內(nèi)表達(dá)水平升高，經(jīng)組織學(xué)確診為NAFLD的患者體內(nèi)也同樣表達(dá)水平升高。已有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)大鼠的胰島素分泌受到破壞，SREBP-1c水平降低，注射胰島素后，SREBP-1c表達(dá)上調(diào)。SREBP-1c介導(dǎo)胰島素對(duì)脂質(zhì)合成的調(diào)控，在新脂質(zhì)合成中具有重要作用[16]。而在轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟過(guò)表達(dá)SREBP-1c會(huì)誘發(fā)脂肪肝，增加TG含量，脂質(zhì)過(guò)量合成堆積。Guo等的研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練通過(guò)顯著下調(diào)SREBP-1c表達(dá)來(lái)改善脂肪肝[17]。本研究的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)：PEMF組較NAFLD組下調(diào)SREBP-1c蛋白表達(dá)，并且肝臟TG含量顯著降低，肝臟脂滴數(shù)量和大小均得到了顯著改善。預(yù)示PEMF通過(guò)下調(diào)SREBP-1c表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)TG的合成，減少肝臟內(nèi)新脂質(zhì)的合成，改善肝臟的脂質(zhì)合成堆積。

綜上所述，本研究的結(jié)果預(yù)示PEMF可能通過(guò)提高db/db小鼠肝臟的抗氧化能力，改善胰島素抵抗，從而降低了血清胰島素含量，進(jìn)而下調(diào)SREBP-1c表達(dá)，調(diào)節(jié)肝臟TG和脂質(zhì)的合成，緩解肝脂肪變性。