葉下珠提取物對(duì)DPPH和亞硝酸鹽的清除作用研究

李紅念， 戴衛(wèi)波， 梅全喜， 郭文賢

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東中山 528400）

葉下珠來(lái)源于大戟科植物葉下珠（Phyllanthus urinaria L.），干燥全草入藥，性微苦、甘，涼，有平肝清熱、利水解毒的功效。現(xiàn)代研究表明，葉下珠具有抗乙型肝炎病毒、保肝護(hù)肝、抗腫瘤、抗病原微生物、抗氧化、抗血栓等作用[1，2]。其所含的沒(méi)食子酸、柯里拉京、鞣花酸等多酚成分在抗乙型肝炎、肝保護(hù)等方面具有較好的藥理作用[3]，可能是該藥發(fā)揮肝保護(hù)作用的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，探討葉下珠提取物的制備工藝和生物活性具有重要的研究意義。本研究通過(guò)液液萃取的方法獲得總多酚得率更高的葉下珠提取物，操作簡(jiǎn)單方便，并對(duì)所制備的葉下珠提取物進(jìn)行體外抗氧化活性檢測(cè)，為簡(jiǎn)便高效地制備葉下珠總多酚工藝提供依據(jù)，并為葉下珠資源的合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1藥物葉下珠藥材，購(gòu)自廣東省梅州市藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院曾聰彥主任中藥師鑒定為大戟科植物葉下珠Phyllanthus urinaria L.干燥全草。

1.2試劑正丁醇（天津富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20170315）；福林酚試劑（美國(guó)Sigma-Aldrichi公司，批號(hào)：101891292）；沒(méi)食子酸對(duì)照樣品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUUST-17022801）；2，2-二苯基-1-苦肼基自由基（DPPH，上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：BFQNI-SL）；維生素C（美國(guó)Amresco公司，批號(hào)：2626C211）；無(wú)水乙醇（廣東西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)：1708011）；亞硝酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170109）；對(duì)氨基苯磺酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170921）；N-（1-萘基）乙二胺鹽酸鹽（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160503）。

1.3儀器JJ2000型精密電子天平（常熟雙杰測(cè)試儀器廠）；HS-4恒溫水浴鍋（太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；H1850型醫(yī)用離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；多功能打粉機(jī)；UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

2 方法

2.1葉下珠提取物的制備和含量測(cè)定

2.1.1 葉下珠提取物制備 將藥材用多功能打粉機(jī)粉碎成20目粗粉，然后用電子天平稱(chēng)取粗粉700 g。按照液料比8∶1（V/mL∶m/g）加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，水浴加熱，回流提取3次，每次2 h[4]。每次提取后過(guò)濾出提取液，全部提取完成后混合提取液，待完全冷卻后置4℃冰箱保存12 h。12 h后取出提取液，分離上清液，下層液體進(jìn)行離心4 000 r/min離心10 min。離心后，把2次上清液混勻，進(jìn)行濃縮蒸發(fā)，得到約1∶1（m/g∶V/mL）的濃提取液，留樣100 mL，置4℃冰箱保存待用。其余濃提取液用1∶1體積的正丁醇進(jìn)行萃取，萃取后倒出正丁醇部分，剩余液留樣待用。最后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干正丁醇萃取液，得提取物浸膏。

2.1.2 試液的制備 用電子天平精確稱(chēng)量沒(méi)食子酸對(duì)照品5.0 mg，蒸餾水溶解，于50 mL容量瓶定容，配成0.1 mg/mL母液。然后取5只10 mL容量瓶，用微量移液槍分別精確取上述母液1、2、3、4、5 mL于各容量瓶中，加蒸餾水定容。配成10、20、30、40、50 mg/L沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液備用[5]。精密稱(chēng)量正丁醇萃取物浸膏0.3 g，用蒸餾水溶解，配制成30 mg/L供試品溶液備用。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制定 取10 mL刻度試管，用微量移液槍分別精密取上述系列沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液1 mL于各試管中，加入0.5 mL的福林酚試劑，充分搖勻。反應(yīng)1 min后加7.5%Na2CO3溶液1.5 mL，混勻后蒸餾水定容。室溫下反應(yīng)2 h后，以未加試劑的溶液為對(duì)照，于波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定各濃度對(duì)照品溶液的吸光度。結(jié)果如表1所示。分別以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度和吸光度為橫、縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=0.009 6X-0.082 8，R2=0.995 3，見(jiàn)圖1。

表1 沒(méi)食子酸對(duì)照品吸光度Table 1 The absorbance of gallic acid reference samples

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Figure 1 The standard curve of gallic acid

2.1.4 供試品的測(cè)定 用移液槍分別取上述供試品溶液1 mL于10 mL刻度試管中，再加入0.5 mL的福林酚試劑，充分搖勻。1 min后，加入7.5%Na2CO3溶液1 mL，混勻后蒸餾水定容。室溫下反應(yīng)2 h，在波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度[6]。

2.2清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)

2.2.1 試劑的配制 供試品溶液制備：電子天平精確稱(chēng)取葉下珠提取物浸膏10 mg，用蒸餾水溶解，于100 mL容量瓶中用蒸餾水定容，得0.1 mg/mL供試品溶液。維生素C溶液的配制：電子天平精確稱(chēng)取維生素C對(duì)照品粉末20 mg，用蒸餾水溶解，于200 mL容量瓶中用蒸餾水定容，得0.1 mg/mL溶液。DPPH試劑的配制：電子天平精確稱(chēng)取DPPH粉末20 mg，用無(wú)水乙醇溶解配制成2 mg/mL DPPH試劑[7]。

2.2.2 清除DPPH自由基的測(cè)定 取8只試管，分別加入上述DPPH試劑4 mL，然后按順序加入葉下 珠 供 試 品 溶 液 0、 0.4、 0.8、 1.2、 1.6、 2.0、2.4、2.8 mL配成系列濃度溶液。以4 mL無(wú)水乙醇加等量的蒸餾水作對(duì)照，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度[8]。維生素C對(duì)照品采取同種方法測(cè)定吸光度，維生素C對(duì)照品溶液加入量為0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1 mL。清除率=（D0-Di）/D0×100%，D0為未加入樣品溶液的吸光度，Di為加入各劑量樣品溶液后的吸光度。

2.3清除亞硝酸鹽實(shí)驗(yàn)

2.3.1 試劑的配制 配制0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取對(duì)氨基苯磺酸0.4 g，以20%鹽酸溶解，于100 mL容量瓶定容，混勻即得，避光保存，待用。配制0.2%N-（1-萘基）乙二胺鹽酸鹽溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取N-（1-萘基）乙二胺鹽酸鹽0.2 g，蒸餾水溶解，于100 mL容量瓶定容，混勻即得，避光保存，待用。配制20 mg/L亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液：精確稱(chēng)取亞硝酸鈉2 mg，蒸餾水溶解定容至100 mL，保存待用。

2.3.2 清除亞硝酸鹽的測(cè)定[9]取8只試管，分別精密移取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL，加入2.0 mL pH 3.0的檸檬酸鈉鹽酸緩沖液、1.0 mL 20 μg/mL亞硝酸鈉溶液，混勻后，加入2.0 mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻；并于5 min后加入1.0 mL 0.2%N-（1-萘基）乙二胺鹽酸鹽，用蒸餾水定容，搖勻，靜置15 min，在波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定吸光度。平行3次，計(jì)算清除率。維生素C對(duì)照品采取同種方法測(cè)定吸光度，維生素C對(duì)照品溶液加入量為0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1 mL。清除率=（D0-Di）/D0×100%，D0為未加入樣品溶液的吸光度，Di為加入各劑量樣品溶液后的吸光度。

3 結(jié)果

3.1 提取物制備及總多酚含量測(cè)定結(jié)果 乙醇提取、正丁醇萃取后蒸發(fā)得浸膏約40.10 g，各供試樣品的濃度、該濃度下的吸光度以及根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出的含量如表2。以正丁醇萃取的最終產(chǎn)物中葉下珠總多酚類(lèi)占51.60%。

表2 供試品樣品總多酚含量測(cè)定結(jié)果Table 2 The results for determination of the content of total polyphenols from test samples

3.2清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取維生素C作為參照物，研究不同濃度的葉下珠提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力，測(cè)定出吸光度后，根據(jù)清除率公式計(jì)算出各濃度下的清除率，結(jié)果如表3、4所示，清除率曲線(xiàn)如圖2所示。由圖2可知，葉下珠提取物抗氧化活性比維生素C略低。在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0～0.3 mg/mL），葉下珠提取物和維生素C均對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度增加而增大，當(dāng)濃度增大至0.2 mg/mL以后，隨溶液濃度增加清除率變化較小。采用SPSS 22.0軟件計(jì)算出葉下珠供試品的IC50為0.089 mg/mL，維生素C對(duì)照品的IC50為0.076 mg/mL。1 mg葉下珠提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力相當(dāng)于0.85 mg維生素C。

3.3亞硝酸鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果葉下珠提取物及維生素C對(duì)亞硝酸鹽清除作用結(jié)果見(jiàn)表5、6，清除率曲線(xiàn)如圖3所示。在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0～0.3 mg/mL），葉下珠提取物和維生素C對(duì)亞硝酸鈉的清除率均隨濃度增加而增大，當(dāng)濃度增大至0.2mg/mL以后，隨溶液濃度增加清除率變化不大。用SPSS 22.0軟件計(jì)算出葉下珠供試品的IC50為0.093 mg/mL，維生素C對(duì)照品的IC50為0.076 mg/mL。1 mg葉下珠提取物對(duì)亞硝酸鹽的清除能力相當(dāng)于0.82 mg維生素C。

表3 葉下珠提取物溶液樣品清除DPPH自由基結(jié)果Table 3 The results for the solutions of sample Herba Phyllanthi Urinariae extracts in scavenging DPPH free radical

表4 維生素C對(duì)照樣品清除DPPH自由基結(jié)果Table 4 The results for vitamin C control samples in scavenging DPPH free radical

圖2 DPPH自由基清除率曲線(xiàn)Figure 2 The curve of scavenging rate for DPPH free radical

表5 葉下珠提取物溶液樣品清除亞硝酸鹽結(jié)果Table 5 The results for the solutions of sample Herba Phyllanthi Urinariae extracts in scavenging nitrite

表6 維生素C對(duì)照樣品清除亞硝酸鹽結(jié)果Table 6 The results for vitamin C control samples in scavenging nitrite

圖3 亞硝酸鹽清除率曲線(xiàn)Figure 3 The curve of scavenging rate for nitrite

4 討論

本研究以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為提取劑，液料比8∶1（V/mL∶m/g）回流提取3次，每次2 h，提取液用正丁醇萃取來(lái)制備葉下珠提取物。Folin-Ciocaileu比色法是目前常用的測(cè)定多酚含量的方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)該方法測(cè)定制備的葉下珠提取物浸膏中多酚含量達(dá)51.60%。與目前文獻(xiàn)資料對(duì)比，本次實(shí)驗(yàn)提取結(jié)果較好，提取率較高，達(dá)到了最佳提取工藝的水平，且測(cè)定方法準(zhǔn)確，操作相對(duì)簡(jiǎn)單。

維生素C是公認(rèn)的強(qiáng)抗氧化活性藥物，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定一系列相似濃度下維生素C溶液和葉下珠提取物溶液對(duì)DPPH自由基和亞硝酸鹽的清除能力，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，在同一坐標(biāo)系中作出清除率曲線(xiàn)。通過(guò)曲線(xiàn)比較可知，低濃度時(shí)，抗氧化活性隨質(zhì)量濃度增加而增高，當(dāng)濃度增大至0.2 mg/mL以后，隨溶液質(zhì)量濃度增大清除率變化較小，葉下珠提取物抗氧化活性比維生素C略低，1 mg葉下珠提取物抗氧化能力相當(dāng)于0.82～0.85 mg維生素C。

亞硝酸鹽主要指亞硝酸鈉，是常用的一種食品添加劑，被限量使用于食品加工及生產(chǎn)中。體內(nèi)高含量的亞硝酸鹽能使人體血液中低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，引起組織缺氧，呼吸中樞麻痹。食物中的亞硝酸鹽與胺類(lèi)化合物在酸性條件下極易形成亞硝胺，而亞硝胺是一類(lèi)具有顯著致癌性的化學(xué)物質(zhì)。大量醫(yī)學(xué)研究證明胃癌、食道癌、肝癌等癌癥發(fā)病率與亞硝酸鹽攝入量密切相關(guān)[10]。本研究結(jié)果表明，葉下珠提取物有較強(qiáng)的清除亞硝酸鹽能力。據(jù)此，我們推測(cè)其對(duì)亞硝酸鹽的清除作用可能對(duì)于葉下珠的抗腫瘤作用有一定的貢獻(xiàn)，亦可能是其抗腫瘤作用的機(jī)制之一，對(duì)此，有待下一步深入研究。

綜上所述，采用液液萃取的方法可有效得到葉下珠提取物，操作簡(jiǎn)單方便，總多酚得率較高。葉下珠提取物對(duì)DPPH自由基和亞硝酸鹽有較強(qiáng)的清除作用。本研究結(jié)果可為深入研究葉下珠抗氧化及抗腫瘤作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為葉下珠資源開(kāi)發(fā)應(yīng)用于臨床提供參考，且提示葉下珠具有被開(kāi)發(fā)成為抗氧化抗癌新藥的潛力。