Bacillus pumilus HN-10對(duì)Trichothecium roseum的拮抗作用及菌體結(jié)構(gòu)的影響

黃玉琴， 贠建民， 張紊瑋， 艾對(duì)元， 漆倩涯， 姚 博

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）作為一類弱寄生植物病原真菌，是重要的果蔬采后致病菌。會(huì)引起蘋果霉心病[1]、甜瓜粉霉病[2]和棉鈴紅粉病[3]。此外，也會(huì)引發(fā)芒果[4]、葡萄[5]、番茄[6]和堅(jiān)果[7]等果蔬采后腐爛，造成極大經(jīng)濟(jì)虧損。其還可產(chǎn)生具有生物毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)人畜的健康存在潛在的安全隱患[8-9]。目前由T.roseum引起的病害控制主要依賴人工合成的殺真菌劑[10]，長期大量使用會(huì)增加病原物的抗藥性，還會(huì)帶來環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留的問題[11]。近年來，開展拮抗微生物分離篩選及其活性物質(zhì)功能開發(fā)已成為研究熱點(diǎn)[12]，利用自然的生物資源防止病害已成為生物防治的重要趨勢(shì)，有益的拮抗菌也成為重要生防因子[13]。

芽孢桿菌屬（Bacillus）是重要的生防細(xì)菌。短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）近年來被陸續(xù)報(bào)道具有拮抗灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），腐霉菌（Pythiumspp）等病原真菌的能力[14-15]。Akhtar等[16]報(bào)道將短小芽孢桿菌作為生物菌肥用于鷹嘴豆根腐病獲得了很好的防治效果。崔云龍等[17]報(bào)道了短小芽孢桿菌D82對(duì)小麥根腐病菌有極強(qiáng)的拮抗作用。游春平等[18]分離的短小芽孢桿菌對(duì)稻瘟病菌有顯著的抑制作用。李靜等[19]報(bào)道短小芽孢桿菌對(duì)芒果炭疽病的抑制率達(dá)到94.28%。然而，有關(guān)短小芽孢桿菌對(duì)果蔬采后重要病原菌T.roseum的拮抗作用及其機(jī)理的研究還鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室從腐敗的馬鈴薯濕粉條中分離獲得了一株具有拮抗活性的菌株，經(jīng)生物學(xué)特性測(cè)定和16SrDNA序列分析鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilusHN-10）。為此，本試驗(yàn)中以該菌株作為拮抗菌，采用體外拮抗法檢測(cè)其對(duì)T.roseum菌絲體生長和孢子萌發(fā)的影響，結(jié)合甜瓜（Cucumis melo L）損傷接種試驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)病害控制效果，通過測(cè)定供試病原菌粉紅單端孢的生長曲線、電導(dǎo)率、吸光度（OD260，OD280）， 及 掃 描 電 鏡 （scanning electron microscope，SEM）觀察形態(tài)變化等為切入點(diǎn)，研究短小芽孢桿菌（B.pumilusHN-10）發(fā)酵液粗提物對(duì)T.roseum生長及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，旨在揭示其拮抗作用機(jī)理，以期為新的生防治劑開發(fā)及果蔬采后病害控制提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilusHN-10）從腐敗馬鈴薯濕粉條分離得到，經(jīng)生物學(xué)特性測(cè)定和16SrDNA序列分析鑒定；粉紅單端孢（Trichothecium roseum）由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；甜瓜（Cucumis melo L）于2016年7月采自甘肅省民勤縣農(nóng)場(chǎng)。

硫酸銨：分析純

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 15～20 g，pH 值自然，水 1000 mL，用于T.roseum菌種活化，培養(yǎng)，拮抗試驗(yàn)；PDA液體培養(yǎng)基用于T.roseum液體培養(yǎng)。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉 10 g，瓊脂 15～20 g，pH 值 7.0，蒸餾水 1000 mL，用于B.pumilusHN-10斜面及平板培養(yǎng)；LB液體培養(yǎng)基用于B.pumilusHN-10發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2 儀器

PHS-3C型酸度計(jì)，上海佑科儀器公司產(chǎn)品；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái)，蘇凈安泰公司產(chǎn)品；THZ-98A型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器廠制造；FA1204B型電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器廠制造；YXJ-2離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；U-3010型紫外-可見分光光度計(jì)，Hitachi公司產(chǎn)品；DDS-11A型電導(dǎo)率儀，上海分析儀器廠制造；HITACHI S-4800-I型掃描電鏡，日本Hitachi公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵液蛋白粗提物的制備 在無菌條件下將斜面保存的短小芽孢桿菌 （B.pumilusHN-10）轉(zhuǎn)接到平板上，培養(yǎng)24 h后，將其單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3代種子液后將其按5%接種體積分?jǐn)?shù)接種到發(fā)酵瓶中，置 37℃，180 r/min的振蕩器中振蕩培養(yǎng) 3 d，10000 r/min離心20 min，上清液加固體硫酸銨至70%飽和度，置4℃下過夜。然后用高速冷凍離心機(jī)在10000 r/min、4℃下離心20 min。所得沉淀溶解于 50 mmol/L 的 Tris-Hcl（pH 6.8）緩沖液中，之后利用截留相對(duì)分子質(zhì)量為12000~14000之間的透析袋進(jìn)行脫鹽。透析48 h后，用0.22 μm微孔濾膜過濾，得到的液體為發(fā)酵液蛋白質(zhì)粗提物，置4℃儲(chǔ)存，待用。

1.3.2T.roseum孢子懸浮液制備 參照Bi等[20]方法。在28℃培養(yǎng)7 d的T.roseum平皿中，加入含0.05 g/dL Tween80的無菌水，刮下孢子轉(zhuǎn)入三角瓶，雙層紗布過濾后旋渦振蕩。用血球計(jì)數(shù)板數(shù)出孢子懸液的濃度，稀釋至1×108個(gè)孢子/mL的孢子懸液，備用。

1.3.3 抑菌效果的測(cè)定 采用牛津杯法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，取已滅菌的牛津杯置于涂有T.roseum孢子懸液的PDA平板上，吸取經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾的發(fā)酵液0.3 mL滴加于牛津杯中，每個(gè)平板放4個(gè)牛津杯，加等量無菌蒸餾水（CK1）和無菌LB液體培養(yǎng)基（CK2）做為空白對(duì)照，培養(yǎng)7 d，觀察抑菌情況。

1.3.4 不同體積稀釋度發(fā)酵液對(duì)T.roseum孢子萌發(fā)的影響 參照Li等[21]方法，在1 g/dL的水瓊脂平板上，用5 mm的打孔器打孔，然后用無菌的鑷子將水瓊脂餅夾到滅菌的載玻片上，每個(gè)載玻片上放置3個(gè)，在每個(gè)瓊脂餅上滴加用0.22 μm濾膜過濾的10 μL 的不同體積比 （發(fā)酵原液按 1∶1，1∶2，1∶3，1∶4（體積比）稀釋）的發(fā)酵液，以同體積的無菌水做對(duì)照，每個(gè)瓊脂餅分別加入10 μL的孢子懸浮液，28℃培養(yǎng)15 h，觀察孢子萌發(fā)情況，每個(gè)瓊脂餅觀察200個(gè)孢子，芽管長度達(dá)到孢子直徑的一半時(shí)認(rèn)為萌發(fā)。

1.3.5 不同體積稀釋度發(fā)酵液對(duì)T.roseum菌絲生長的影響 參照Liu等[22]方法，將滅菌后的PDA培養(yǎng)基冷卻至溫度60℃，加入不同體積稀釋度用0.22 μm 濾膜過濾（發(fā)酵原液按 1∶1，1∶2，1∶3，1∶4（體積比）稀釋）的發(fā)酵液2 mL，充分溶解，均勻平鋪于培養(yǎng)皿，以加入等量無菌水的PDA平板為對(duì)照。將培養(yǎng)7 d的T.roseum平板，打孔器打取菌餅接于培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，每個(gè)濃度重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3.6 不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵液對(duì)甜瓜損傷接種后對(duì)病斑直徑的測(cè)定 孢子懸浮液創(chuàng)傷接種 參照Bi等[20]方法。選取外觀大小均一，無損傷和病蟲害的甜瓜，2 g/dL的次氯酸鈉浸泡2 min，自來水沖洗室溫晾干，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精對(duì)甜瓜表面消毒，用無菌打孔器在果實(shí)上刺5 mm×3 mm的傷口4個(gè)，接入0.22 μm濾膜過濾的10 μL不同稀釋度的發(fā)酵液，20 min后，接入10 μL孢子懸液，保鮮袋包裝，室溫條件下貯藏15 d，十字交叉法測(cè)病斑直徑。每個(gè)處理3個(gè)甜瓜，3次重復(fù)，加同體積無菌水作為對(duì)照。

菌絲塊創(chuàng)傷接種。參照章戰(zhàn)華[23]的方法，略加修改。用打孔器在甜瓜上刺5 mm×4 mm的傷口3個(gè)，接入0.22 μm濾膜過濾的20 μL不同稀釋度的發(fā)酵液，20 min后，將培養(yǎng)了7 d的T.roseum菌苔用5 mm的打孔器打下菌絲邊緣的菌碟，接種到刺傷后的傷口上，以接入同體積的無菌水作為對(duì)照。

1.3.7 發(fā)酵液蛋白粗提物處理后T.roseum生長曲線的測(cè)定 將PDA液體培養(yǎng)基加入發(fā)酵瓶中，滅菌冷卻后按10%的加液體積分?jǐn)?shù)加入1×108個(gè)孢子/mL的菌懸液和0.22 μm濾膜過濾的發(fā)酵液蛋白粗提物，對(duì)照接等量的無菌蒸餾水，之后在28℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。每隔12 h時(shí)分別取樣50 mL，8000 r/min 離心 30 min，收集菌絲體，105 ℃烘干至恒重，稱其質(zhì)量，每組重復(fù)3次，取平均值繪制生長曲線。

1.3.8 發(fā)酵液粗提物處理后T.roseum菌液電導(dǎo)率的測(cè)定 參照王鑫等[24]的方法，并稍加修改。將1×108個(gè)孢子/mL的菌懸液按10%接種體積分?jǐn)?shù)接種于PDA液體培養(yǎng)基，后按10%的加液體積分?jǐn)?shù)加入0.22 μm濾膜過濾的發(fā)酵液粗提物，對(duì)照加等量的無菌去離子水，在28℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔4 h取菌懸液5 mL，8000 r/min離心20 min，將上清液用去離子水稀釋20倍，將電導(dǎo)電極浸入到待測(cè)溶液中，緩慢攪拌，待測(cè)量值穩(wěn)定后讀數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.9 發(fā)酵液粗提物處理后T.roseum核酸和蛋白質(zhì)滲出量的測(cè)定 參照Paul等[25]的方法稍作修改。將孢子濃度為1×108個(gè)孢子/mL的懸液和0.22 μm濾膜過濾的發(fā)酵液粗提物分別按10%接入體積分?jǐn)?shù)加入PDA液體培養(yǎng)基，無菌去離子水作為對(duì)照。在28℃、180 r/min搖床中震蕩培養(yǎng)，每隔4 h取菌液6 mL，6000 r/min離心20 min所得的上清液在260 nm和280 nm處測(cè)定吸光值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.10 發(fā)酵液粗提物處理對(duì)T.roseum菌體表面形態(tài)的觀察 為進(jìn)一步確定抑菌機(jī)理是否為破壞該菌體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，采用掃描電子顯微鏡觀察孢子及菌體形態(tài)。參照Li等[26]方法，并稍加修改。在PDA液體培養(yǎng)基中，按10%的加液體積分?jǐn)?shù)分別加入0.22 μm濾膜過濾的發(fā)酵液粗提物和孢子懸浮液（1×108個(gè)孢子/mL），無菌水處理作為對(duì)照。在28℃，180 r/min搖床培養(yǎng) 4、12、20 h后，4℃條件下用體積分?jǐn)?shù)為2 g/dL戊二醛固定2 h，PBS溶液洗3次，每次10 min；再浸泡在1 g/dL鋨酸溶液中，4℃下2 h左右。用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、95%和100%的梯度乙醇各脫水10 min。醋酸異戊酯置換20 min，干燥，真空鍍金。在掃描電鏡下觀察，并采集照片。

1.4 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)

采用Excel2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)，以上測(cè)定均為3組平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差方式表示。SPSS19.0對(duì)各測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.pumilus HN-10發(fā)酵液對(duì)T.roseum的抑制效果

由圖1看出，無菌蒸餾水（CK1）和無菌的LB液體培養(yǎng)基（CK2）為空白對(duì)照的牛津杯周圍長滿了T.roseum菌絲體，而加注B.pumilusHN-10發(fā)酵液的牛津杯周圍沒有菌絲體生長，說明B.pumilusHN-10發(fā)酵液對(duì)T.roseum菌體生長具有顯著的抑菌效果，且該抗菌活性物質(zhì)為胞外產(chǎn)物。同時(shí)證明發(fā)酵液的抑菌活性與LB培養(yǎng)基的成分無關(guān)。

圖1 B.pumilus HN-10發(fā)酵液對(duì)T.roseum的抑制效果Fig.1 AntibacterialeffectofB.pumilusHN-10 fermentation fluid on T.roseum

2.2 不同體積稀釋度發(fā)酵液對(duì)T.roseum孢子萌發(fā)的影響

由圖2可知，不同體積稀釋度的發(fā)酵液均能有效抑制孢子萌發(fā)，但不同的稀釋度之間存在著顯著效果差異，發(fā)酵液稀釋倍數(shù)越小，抑制效果越好。發(fā)酵液處理幾乎完全抑制了孢子萌發(fā)，且孢子萌發(fā)率僅為對(duì)照的3.29%。

圖2 不同體積稀釋度發(fā)酵液對(duì)T.roseum孢子萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of the different concentration fermentation fluid on spore germination of T.roseum

2.3 不同濃度發(fā)酵液對(duì)T.roseum菌絲生長的影響

由圖3可知，發(fā)酵液處理可顯著抑制T.roseum的菌落直徑的擴(kuò)展，并呈現(xiàn)出濃度效應(yīng)。不同稀釋度的發(fā)酵液抑制的效果有差異，但值得注意的是，整個(gè)培養(yǎng)階段發(fā)酵原液的抑菌效果最好，幾乎完全抑制了菌落直徑的擴(kuò)展，其菌落直徑僅為對(duì)照的49.21%。

圖3 不同體積稀釋度發(fā)酵液對(duì)T.roseum菌絲生長的影響Fig.3 Effects of the different concentration fermentation fluid on mycelial growth of T.roseum

2.4 不同體積稀釋度發(fā)酵液對(duì)甜瓜損傷接種后病斑直徑的影響

由圖4可知，不同稀釋度的發(fā)酵液對(duì)甜瓜的致病效果存在著差異。無論是懸液接種還是菌絲塊接種，發(fā)酵原液對(duì)病原菌的抑制效果最好，病斑幾乎沒有擴(kuò)展，其腐爛病斑直徑控制率分別為92.74%和89.50%；比較孢子懸浮液創(chuàng)傷接種和菌絲塊創(chuàng)傷接種可以發(fā)現(xiàn)，菌絲塊創(chuàng)傷接種所致甜瓜病斑面積，比孢子懸浮液創(chuàng)傷接種病斑直徑要大，由此可以推測(cè)發(fā)酵液對(duì)T.roseum孢子萌發(fā)的抑制作用要大于對(duì)菌絲生長的影響。

圖4 不同體積稀釋度發(fā)酵液對(duì)甜瓜懸液和菌塊接種的抑制效果Fig.4 Antibacterial effect of the different concentration fermentation fluid on melon of suspension and mycelia plugs inoculation

2.5B.pumilus HN-10發(fā)酵液蛋白粗提物對(duì)T.roseum生長曲線的影響

為進(jìn)一步考察B.pumilusHN-10發(fā)酵液的抑菌效果及機(jī)理，本試驗(yàn)進(jìn)行了發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的粗提，開展了液體培養(yǎng)條件下發(fā)酵液蛋白粗提物對(duì)T.roseum生長曲線的影響。結(jié)果如下：

典型微生物生長曲線粗分為4個(gè)時(shí)期：遲緩期、對(duì)數(shù)生長期、穩(wěn)定期及衰退期。微生物生長曲線反映了微生物各個(gè)生長階段的群體生長狀況及規(guī)律，能反映菌體生物量的變化[27]。因此，可以通過測(cè)定菌體生物量來判斷抑菌效果。由圖5可知，對(duì)照組的T.roseum生長良好，具有典型的生長曲線特征，在72 h已開始進(jìn)入穩(wěn)定期，108 h時(shí)達(dá)到最大生物量為0.408 g。而處理組生長曲線位于對(duì)照組下方，生長曲線呈現(xiàn)為平緩的波浪狀，且發(fā)酵液粗提物在對(duì)數(shù)期即表現(xiàn)出顯著抑菌作用。處理組，在整個(gè)生長周期T.roseum的生長受到抑制，導(dǎo)致對(duì)數(shù)增長期斜率平緩、穩(wěn)定期最大生物量明顯減小，呈不典型生長特征，且最大生物量僅為0.082 g。結(jié)果說明發(fā)酵液粗提物能夠明顯抑制T.roseum的生長繁殖。

圖5 發(fā)酵液粗提物對(duì)T.roseum生長曲線的影響Fig.5 Effect of fermentation fluid crude extract on growth curve of T.roseum

2.6 B.pumilus HN-10發(fā)酵液粗提物對(duì)T.roseum菌液電導(dǎo)率的影響

電導(dǎo)率是衡量溶液中離子強(qiáng)度高低的一個(gè)特征參數(shù)，其值與離子組分濃度密切相關(guān)[28]。菌體的保護(hù)屏障是細(xì)胞膜，當(dāng)遇到強(qiáng)抑菌劑時(shí)會(huì)使細(xì)胞膜遭到破壞，菌體的保護(hù)屏障被打破，其內(nèi)部的電解質(zhì)外泄至溶液中，從而使電導(dǎo)率上升，因此菌液電導(dǎo)率的變化可以反映細(xì)胞膜通透性的變化[29]。由圖6可知，處理組的電導(dǎo)率明顯高于對(duì)照組，且整體上呈上升趨勢(shì)，可以推測(cè)發(fā)酵液粗提物中的抗菌活性成分對(duì)T.roseum的生長抑制作用可能是通過破壞其細(xì)胞膜，使細(xì)胞的通透性增加，內(nèi)容物滲出而達(dá)到抗菌的目的，也可能是菌體在生長過程中產(chǎn)生的代謝物質(zhì)使電導(dǎo)率發(fā)生變化。

圖6 發(fā)酵液粗提物對(duì)T.roseum電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effect of fermentation fluid crude extract on the conductivity of T.roseum

2.7 B.pumilus HN-10發(fā)酵液粗提物對(duì)T.roseum核酸和蛋白質(zhì)滲出量的影響

細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏是細(xì)胞膜破損的重要指標(biāo)之一。蛋白質(zhì)，核酸及其衍生物是細(xì)胞的重要生命物質(zhì)，正常細(xì)胞的蛋白質(zhì)及核酸物質(zhì)不會(huì)泄漏到細(xì)胞外。了解胞內(nèi)蛋白質(zhì)與核酸的泄漏情況，可以間接反映細(xì)胞膜的破損程度[30]。由圖7可知，隨著處理時(shí)間的增加，處理和對(duì)照組的OD260值、OD280值都不斷增大，但處理組的值總是大于對(duì)照組，說明細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸都有泄漏發(fā)生，另外還可以看出處理后0～20 h，吸光值大幅度增加，說明發(fā)酵液粗提物處理前期對(duì)物質(zhì)泄漏的影響最大。其變化趨勢(shì)和電導(dǎo)率的變化趨勢(shì)相吻合，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了電導(dǎo)率的增加是由于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸泄漏增加。電導(dǎo)率、OD260值和OD280值的變化都不完全呈直線狀態(tài)，這表明發(fā)酵液粗提物對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響是比較復(fù)雜的。

2.8 B.pumilus HN-10發(fā)酵液粗提物對(duì)菌體表面形態(tài)變化的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)酵液粗提物對(duì)T.roseum孢子及菌絲體結(jié)構(gòu)的破壞作用。本試驗(yàn)采用掃描電鏡觀察了不同時(shí)期孢子萌發(fā)的形態(tài)變化。由圖8可知，處理顯著改變了菌體表面形態(tài)，處理時(shí)間越長，形態(tài)的改變也就越明顯。無菌蒸餾水對(duì)照組在4 h時(shí)孢子表面形狀完整，體態(tài)飽滿；在12 h時(shí)孢子有萌發(fā)跡象，芽管開始凸出，孢子體表完整。在20 h時(shí)絕大多數(shù)孢子都已長出菌絲，且菌絲分布均勻，形態(tài)規(guī)則。而粗提物處理組，孢子皺縮，表面粗糙，體表凹陷明顯（圖 4（d）-（f）），處理 4 h 時(shí)孢子形態(tài)與對(duì)照相比變化不大，隨時(shí)間的延長，在12 h時(shí)，孢子的皺縮程度顯著增強(qiáng)，聚集粘連。在20 h時(shí)，孢子表面極具褶皺，明顯抑制了孢子萌發(fā)過程芽管的形成。

圖7 發(fā)酵液粗提物對(duì)T.roseum內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)泄露的影響Fig.7 Effects of fermentation fluid crude extract on permeation of nucleic acid and protein of T.roseum

本研究在對(duì)短小芽孢桿菌 （Bacillus pumilusHN-10）發(fā)酵液處理粉紅單端孢（Trichothecium roseum）后其生理生化指標(biāo)，如電導(dǎo)率，胞內(nèi)蛋白和核酸滲出量等的測(cè)定基礎(chǔ)上，采用掃描電鏡圖像分析方法，從T.roseum孢子萌發(fā)形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征方面開展進(jìn)一步考察，二者間相互映襯，互為補(bǔ)充，可為進(jìn)一步推測(cè)B.pumilusHN-10發(fā)酵液對(duì)T.roseum的抑菌機(jī)理提供證據(jù)。掃描電鏡觀察到B.pumilusHN-10菌株發(fā)酵液處理使T.roseum菌體形態(tài)發(fā)生了明顯變化，孢子萌發(fā)受到抑制，菌體細(xì)胞壁表面出現(xiàn)凹陷變形，細(xì)胞膜的平滑形態(tài)變得褶皺。據(jù)此，我們推測(cè)其抑菌機(jī)理可能是發(fā)酵液粗提物破壞了菌體細(xì)胞壁，膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜的表面積增大并使細(xì)胞膜的磷脂雙分子層變得更為疏松細(xì)胞通透性增大，致使細(xì)胞內(nèi)溶物滲出，細(xì)胞代謝發(fā)生紊亂，菌體的生長繁殖受到阻礙抑制，進(jìn)而發(fā)揮抑菌作用。這一結(jié)果與吳海霞[31]用掃描電鏡觀察銀杏種仁抑菌蛋白作用Klebsiella.peneumoniae菌后使其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，以及秦楠[32]通過掃描電鏡觀察的方法研究解淀粉芽孢桿菌HRH317抗菌蛋白對(duì)禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）得出的實(shí)驗(yàn)效果相一致，均推測(cè)可能是一些抑菌蛋白作用于菌體細(xì)胞膜，引起膜的損傷、破壞和通透性改變。當(dāng)然，關(guān)于B.pumilusHN-10菌株對(duì)T.roseum抑菌機(jī)理的揭示，還有待于通過透射電鏡等試驗(yàn)來進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

圖8 發(fā)酵液粗提物處理對(duì)T.roseum表面形態(tài)的影響Fig.8 Effect of fermentation fluid crude extract on spore morphology of T.roseum

3 結(jié)語

短小芽孢桿菌（Bacillus.pumilusHN-10）的發(fā)酵液能夠有效抑制粉紅單端孢（Trichothecium.roseum）菌體生物量增加，對(duì)其菌絲生長和孢子萌發(fā)有明顯抑制效果。同時(shí)，甜瓜（Cucumis melo L）懸液和菌絲塊接種試驗(yàn)驗(yàn)證了發(fā)酵液對(duì)病原菌粉紅單端孢引起的腐爛抑制效果顯著，其腐爛病斑直徑控制率分別為92.74%和89.50%。

B.pumilusHN-10發(fā)酵液蛋白粗提物處理對(duì)T.roseum液體培養(yǎng)條件下的電導(dǎo)率，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸滲出量均較對(duì)照顯著提高；掃描電鏡觀察結(jié)果表明，處理組菌體表面出現(xiàn)明顯的皺褶，有效抑制了孢子萌發(fā)過程芽管的形成。

B.pumilusHN-10發(fā)酵液粗提物對(duì)T.roseum的抑菌機(jī)理可能主要是對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成破壞作用，細(xì)胞內(nèi)溶物大量流出，使菌體代謝紊亂，菌體的生長繁殖受到阻礙和抑制。