溫陽(yáng)健腦方對(duì)血管性認(rèn)知障礙模型大鼠血清MDA、SOD和腦組織DA的影響*

佟麗妍 艾秀峰 史秀麗 徐煥鳳

（1.浙江省杭州市中醫(yī)院，浙江 杭州 310007；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；3.河北省玉田縣計(jì)劃生育中心醫(yī)院，河北 玉田 064100；4河北省石家莊市長(zhǎng)江心理醫(yī)院，河北 石家莊050000）

血管性認(rèn)知障礙（VCI）是1993年Hachinski和Bowlerl［1］提出的基于血管性癡呆的一個(gè)概念，是指由腦血管病危險(xiǎn)因素（高血壓、糖尿病、高血脂等）、明顯（腦梗死和腦出血等）或不明顯（白質(zhì)疏松和慢性腦缺血等）的腦血管病引起的從輕度認(rèn)知障礙到癡呆的一大類綜合征［2］。2011年美國(guó)心臟協(xié)會(huì)/美國(guó)卒中協(xié)會(huì)（AHA/ASA）將VCI的概念變得更為寬泛：指由于腦血管及其危險(xiǎn)因素導(dǎo)致的認(rèn)知損害癥狀由輕度到重度的一系列綜合征。而VCI的提出，是源于對(duì)血管性癡呆的早期防治的迫切需要。VCI在全國(guó)乃至全世界，是普遍存在的、亟待解決的重要問(wèn)題，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有效治療方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察溫陽(yáng)健腦方中藥制劑對(duì)VCI模型大鼠血清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和腦組織多巴胺（DA）的影響來(lái)探討本方對(duì)于VCI的腦保護(hù)作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠共46只，鼠齡3～5個(gè)月，體質(zhì)量250～300 g，清潔級(jí)，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。合格證號(hào)：032582。購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～70%。大鼠實(shí)驗(yàn)前在動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)7 d。

1.2 試藥與儀器 溫陽(yáng)健腦方：黃芪20 g，淫羊藿10 g，高良姜10 g，遠(yuǎn)志15 g，葛根12 g，姜黃12 g，石菖蒲12 g，當(dāng)歸10 g，川芎12 g。中藥購(gòu)自杭州市中醫(yī)院中藥房，濃煎100 mL，制得生藥含量為2 g/mL的藥液備用。大鼠血清MDA試劑盒（南京建成，cat△A003-1）；大鼠血清SOD試劑盒（南京建成，cat△A001-3）；大鼠腦組織DA試劑盒（南京建成，cat△H170）。超低溫冰箱（青島海爾，型號(hào)DW-86L388），水迷宮（淮北正華，型號(hào)ZH0065），數(shù)碼相機(jī)（佳能505D），高通量組織研磨器（寧波新芝，型號(hào)SCIENTZ-48），臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（上海盧湘儀，型號(hào)TDZ6B-WS）。

1.3 模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，造模前，用Morris水迷宮及Zea longa神經(jīng)功能缺損評(píng)分法［3］評(píng)估出正常可參與實(shí)驗(yàn)的大鼠，剔除不合格大鼠。取40只大鼠進(jìn)行造模，采用改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法（2VO法）［4］：大鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸前部常規(guī)消毒備皮，碘伏消毒后沿正中線切開，鈍性剝離結(jié)締組織和頸前肌群，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈；腹腔注射硝普鈉2.5 mg/kg，隨即用無(wú)創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10 min，灌注10 min，再夾閉10 min，再通后，永久結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，并剪斷，以永久阻斷血流，逐層縫合頸部創(chuàng)口。在手術(shù)過(guò)程中，保持動(dòng)物自主呼吸，并保持肛溫（37±0.5）℃。待大鼠蘇醒后依據(jù)Zea longa神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)篩選，1～4分視為造模成功。造模后3 d，每日肌注10萬(wàn)單位青霉素鈉抗感染。造模成功SD大鼠共計(jì)30只。

1.4 分組及給藥 將30只模型大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表方法分為5組，每組6只；另取6只正常SD大鼠作為空白組。1）空白組：不手術(shù)，不喂藥。2）模型組：手術(shù)后僅用0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg，每日2次灌胃。3）吡拉西坦組：吡拉西坦片0.05 g/kg磨粉溶解至0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg中，每日2次灌胃。4）吡拉西坦+溫陽(yáng)健腦組：吡拉西坦片0.05 g/kg磨粉溶解至0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg中，與溫陽(yáng)健腦中藥湯劑10 mL/kg，先后灌服，每日2次灌胃。5）溫陽(yáng)健腦低劑量組：采用溫陽(yáng)健腦中藥湯劑，給予10 mL/kg，每日2次灌胃。6）溫陽(yáng)健腦高劑量組：采用溫陽(yáng)健腦中藥湯劑，給予20 mL/kg，每日2次灌胃。

1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 用藥后第14日參照Z(yǔ)ea longa評(píng)分法給予各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分。0級(jí)：無(wú)體征，記0分。Ⅰ級(jí)：動(dòng)物不能完全伸直其前肢，記1分。Ⅱ級(jí)：動(dòng)物一側(cè)肢體癱瘓，有追尾現(xiàn)象，記2分。Ⅲ級(jí)：動(dòng)物不能站立/打滾，記3分。Ⅳ級(jí)：無(wú)自發(fā)性活動(dòng)，有意識(shí)障礙，記4分。

1.6 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 用藥后第14日對(duì)每組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)［5-6］。首先進(jìn)行定位航行試驗(yàn)：訓(xùn)練前使大鼠在水池內(nèi)自由游泳2 min，以熟悉環(huán)境。第1日：可視平臺(tái)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前將大鼠籠放入測(cè)試房間適應(yīng)至少30 min，期間避免其看到水池。實(shí)驗(yàn)時(shí)，輕輕抓住大鼠尾根，使其面對(duì)池壁，從離平臺(tái)最遠(yuǎn)的象限入水，記錄大鼠找到平臺(tái)的潛伏期，時(shí)間為90 s。如果大鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)找到平臺(tái)，讓其在平臺(tái)上停留5 s，如果大鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)未找到平臺(tái)，讓其在平臺(tái)上停留20 s。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，吹干毛發(fā)，將大鼠放回籠中飼養(yǎng)。第2至第5日：隱藏平臺(tái)試驗(yàn)。訓(xùn)練時(shí)間共4 d，每天固定時(shí)間進(jìn)行4次訓(xùn)練，每次90 s，每次間隔20 s（每只大鼠隨機(jī)從每個(gè)象限的中點(diǎn)面壁式入水1次），如果90 s仍未找到站臺(tái)，由操作者將大鼠引上站臺(tái)休息20 s，訓(xùn)練后吹干毛發(fā)，將大鼠放回籠中飼養(yǎng)。圖像采集系統(tǒng)及分析系統(tǒng)自動(dòng)記錄保存大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡、找到站臺(tái)的潛伏期（escape latency）、游泳時(shí)間、游泳速度、游泳距離及尋找站臺(tái)的搜尋策略等信息。

1.7 標(biāo)本采集與檢測(cè) Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)完畢，予每組大鼠斷頭處死，分別取血以檢查血清SOD、MDA，取其腦組織，置冰盒上，于視交叉與視乳頭之間冠狀位處垂直切開腦組織，鈍性分離出兩側(cè)海馬，分別稱重，按質(zhì)量和體積比1∶10的比例，加入生理鹽水冰浴勻漿。血液靜置30 min后，和組織勻漿均在4℃，3 500 r/min條件下離心10 min，取上清液，參照生化試劑盒說(shuō)明書的檢測(cè)方法檢測(cè)血清MDA、SOD和腦組織DA。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié) 果

2.1 一般情況 大鼠模型復(fù)制完成后，均出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，第2日多數(shù)模型大鼠口鼻有血性分泌物，表現(xiàn)為毛發(fā)干枯，精神倦怠，反應(yīng)遲鈍，蜷縮懶動(dòng)，部分左側(cè)肢體偏癱，并有多只死亡，解剖死亡的大鼠發(fā)現(xiàn)右腦水腫嚴(yán)重。大鼠腦水腫癥狀在24～72 h左右達(dá)到高峰期，隨后逐漸恢復(fù)。

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 用藥14 d后空白組、模型組、吡拉西坦組、吡拉西坦+溫陽(yáng)健腦組、溫陽(yáng)健腦低劑量組、溫陽(yáng)健腦高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為0分、（3.17±0.75）分、（1.83±0.75）分、（0.67±0.52）分、（1.00±0.63）分、（0.83±0.75）分。模型組、吡拉西坦組、溫陽(yáng)健腦低劑量組評(píng)分均顯著高于空白組（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，吡拉西坦組、吡拉西坦+溫陽(yáng)健腦組、溫陽(yáng)健腦低劑量組、溫陽(yáng)健腦高劑量組評(píng)分均顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 各組大鼠水迷宮隱藏平臺(tái)試驗(yàn)第1日游泳總路程比較 見表1。用藥14 d后隱藏平臺(tái)試驗(yàn)第1日，與空白組比較，各組動(dòng)物水迷宮游泳總路程及平臺(tái)潛伏期均明顯增加，游泳速度減慢（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組游泳總路程均減少，平臺(tái)潛伏期縮短，游泳速度增快，其中以溫陽(yáng)健脾腦高劑量組最為顯著（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠水迷宮隱藏平臺(tái)試驗(yàn)第1日結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠水迷宮隱藏平臺(tái)試驗(yàn)第1日結(jié)果比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組別空白組模型組吡拉西坦組吡拉西坦+溫陽(yáng)健腦組溫陽(yáng)健腦低劑量組溫陽(yáng)健腦高劑量組n 6 6 6 6 6 6路程（cm）360.55±188.95 1 494.38±773.26△△902.53±291.63*△△658.87±372.37**△△566.88±300.85**△518.30±139.21**△游泳速度（cm/s）21.18±2.18 15.21±3.40△△16.83±3.06*△17.55±3.98 17.88±2.60△20.37±3.04*平臺(tái)潛伏期（s）53.87±13.07 80.62±17.89△72.63±15.95△52.73±24.55*78.27±20.57△55.37±15.35*

2.4 各組大鼠血清MDA、SOD和腦組織DA含量比較 見表2。與空白對(duì)照組比較，模型組血清MDA較空白對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）；模型組血清SOD及腦組織DA較空白對(duì)照組顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組血清MDA下降，其中溫陽(yáng)健腦高劑量組血清下降最為顯著（P＜0.01）；各給藥組血清SOD及腦組織DA均上升，其中溫陽(yáng)健腦高劑量組血清SOD上升最顯著（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠血清MDA、SOD和腦組織DA含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清MDA、SOD和腦組織DA含量比較（±s）

組別空白組模型組吡拉西坦組吡拉西坦+溫陽(yáng)健腦組溫陽(yáng)健腦低劑量組溫陽(yáng)健腦高劑量組n 6 6 6 6 6 6 MDA（mol/mg）6.16±5.29 8.86±1.37△1.44±0.71**3.07±3.50**2.71±3.62**0.93±0.40**SOD（U/mg）503.41±131.60 310.42±102.74△398.18±147.72 413.00±144.37 390.19±81.35 451.47±96.92*DA（ng/mL）960.53±375.50 430.25±178.36△△944.93±214.01**863.08±333.70*760.18±279.27**1044.10±323.86**

3討論

VCI患者存在包括記憶障礙在內(nèi)的多認(rèn)知域損害，有相關(guān)研究表明血管性病灶破壞了與記憶相關(guān)的海馬-內(nèi)側(cè)顳葉-皮質(zhì)下通路是導(dǎo)致這一損害的原因［7］。腦卒中發(fā)病次數(shù)及梗死面積，尤其發(fā)生于額葉、顳葉及丘腦等部位更易引起認(rèn)知功能障礙［8］。VCI發(fā)病的重要因素之一是自由基代謝失衡所致的組織脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物，是自由基對(duì)生物細(xì)胞膜損傷后的主要代謝產(chǎn)物，正常情況下體內(nèi)產(chǎn)生的少量自由基可被抗氧化劑及時(shí)清除，維持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，腦缺血及再灌注時(shí)該平衡破壞，引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。DA調(diào)節(jié)自主運(yùn)動(dòng)同時(shí)也作用于學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的神經(jīng)元，多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)與工作記憶的關(guān)系尤為密切。

中醫(yī)學(xué)對(duì)VCI的定位主要集中在“神志病”范疇，其臨床特點(diǎn)與中醫(yī)之“善忘、呆證、腦髓消、文癡”相似。歷代醫(yī)家多以肝腎陰虛而辨之，治以滋陰補(bǔ)腎為主，多在中風(fēng)后遺癥的基礎(chǔ)上治療血管性癡呆，從而忽略了大部分腦缺血后神經(jīng)功能缺損較輕或無(wú)的輕度認(rèn)知功能障礙的患者，進(jìn)而失去了治療先機(jī)。中醫(yī)藥在本病治療方面有其特定的優(yōu)勢(shì)，并能從輕度認(rèn)知障礙開始，預(yù)防和治療認(rèn)知障礙及癡呆。

本研究結(jié)果提示溫陽(yáng)健腦高劑量組在降低血清MDA及升高血清SOD方面有明顯優(yōu)勢(shì)，比溫陽(yáng)健腦低劑量組和溫陽(yáng)健腦+吡拉西坦組及單獨(dú)吡拉西坦組均有明顯療效。在提高腦內(nèi)DA方面，也具有明顯效果，較吡拉西坦及吡拉西坦聯(lián)合溫陽(yáng)健腦組以及單獨(dú)溫陽(yáng)健腦低劑量組的效果均突出。

溫陽(yáng)健腦方重在溫陽(yáng)補(bǔ)氣健脾充腦，促進(jìn)周身各臟器功能的改善，從而達(dá)到對(duì)腦髓的保養(yǎng)及充實(shí)，預(yù)防及治療由于氣血不暢、腦髓失養(yǎng)所致之呆證。方中黃芪補(bǔ)氣健脾，具有抗氧化的作用，黃芪總黃酮和總皂苷等成分具有顯著的抗氧化活性［9］，能抑制自由基的產(chǎn)生和清除體內(nèi)過(guò)剩的自由基，阻止新的自由基形成，有類似SOD的作用。淫羊藿總黃酮能顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖，使SOD活性升高、MDA含量降低［10］。高良姜醇提物能減少細(xì)胞內(nèi)MDA含量，提高胞內(nèi)SOD及GGSH-Px的活性，具有較好的抗氧化活性［11］，其歸脾腎經(jīng)，溫中散寒助淫羊藿補(bǔ)腎而升陽(yáng)。遠(yuǎn)志皂苷元能增強(qiáng)海馬神經(jīng)元抗氧化能力［12］。石菖蒲對(duì)小鼠各種記憶障礙模型均有不同程度的改善作用［13］，還可以提高腦內(nèi)DA含量。葛根可以通過(guò)直接擴(kuò)張腦血管、增加腦血流量，來(lái)提高腦組織和細(xì)胞的供血和供氧。葛根升陽(yáng)的同時(shí)可解肌透熱生津，在本方應(yīng)用大量溫補(bǔ)藥物的同時(shí)，給予辛涼對(duì)沖，以防陽(yáng)熱過(guò)旺，蒸灼津液而傷陰。姜黃中的姜黃素被認(rèn)為是一種天然的抗氧化劑，Kunwar等通過(guò)研究指出了姜黃素可直接清除體內(nèi)的氧自由基，減少氧自由基的產(chǎn)生，起到抗氧化作用［14］。當(dāng)歸、川芎在眾多實(shí)驗(yàn)中均可見到抑制血小板聚集，改善微循環(huán)的作用［14-16］。由此可見，本方對(duì)VCI的作用主要在于3個(gè)方面：一為清除體內(nèi)氧自由基、抗氧化，因而可以提高SOD，降低MDA含量；二為抗血栓，預(yù)防及改善腦血管反復(fù)堵塞，從而預(yù)防癡呆加重；三為調(diào)節(jié)腦功能，改善作息節(jié)律，使其通過(guò)調(diào)節(jié)大腦作息而迅速恢復(fù)認(rèn)知能力。本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步在此基礎(chǔ)上深入研究溫陽(yáng)健腦方對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響，以進(jìn)一步明確本方劑的作用機(jī)制，并逐漸投入臨床研究，以期獲得更加有力的證據(jù)。