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    地黃飲子湯對(duì)rt-PA溶栓后急性腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響*

    2019-09-13 08:25:34劉王波方志成
    中國中醫(yī)急癥 2019年8期
    關(guān)鍵詞:飲子腦組織溶栓

    劉王波 彭 禹 馬 瑞 方志成

    (湖北省十堰市太和醫(yī)院,湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院,湖北 十堰 442000)

    急性腦梗死(ACI)發(fā)病率和死亡率很高,嚴(yán)重威 脅人類健康[1]。ACI的病理基礎(chǔ)為急性局灶腦缺血,腦血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,血腦屏障功能喪失,缺血性腦組織發(fā)生細(xì)胞凋亡和壞死[2]。腦梗死急性期,缺血區(qū)中央帶神經(jīng)元在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生不可逆壞死,出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損癥狀,導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和生物功能喪失[3]。細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的過程[4]。B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)的主要功能是抑制細(xì)胞凋亡。研究表明,Bcl-2基因表達(dá)和蛋白質(zhì)水平降低將顯著增加細(xì)胞凋亡水平和加重神經(jīng)功能障礙[5-6]。Caspase是凋亡通路的中心環(huán)節(jié),Caspase-3參與受體和線粒體凋亡通路,可在細(xì)胞表面相互作用,介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。因此,抑制腦梗死半暗區(qū)細(xì)胞凋亡可保護(hù)神經(jīng)功能。ACI唯一被認(rèn)可的治療方法是在癥狀出現(xiàn)后的前4~5 h內(nèi)用重組組織纖溶酶原激活劑(rt-PA)溶栓,然而,溶栓后再灌注可加重缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死,引起繼發(fā)性損傷[8]。地黃飲子湯具有滋腎陰、補(bǔ)腎陽、開竅化痰的功效,在治療缺血性腦血管疾病方面取得了一定療效,但其作用機(jī)制研究較少[9]。因此,本研究通過檢測(cè)地黃飲子湯對(duì)rt-PA溶栓后急性腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響,探討其治療ACI的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取體質(zhì)量200~240 g的雄性8周齡SD大鼠40只,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供,許可證號(hào):SZXK(京)2011-00120。在SPF環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),動(dòng)物相關(guān)處置均符合《中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。

    1.2 試藥與儀器 地黃飲子湯(熟地黃、山茱萸肉、石斛、巴戟天、肉蓯蓉、白茯苓、炮附子、肉桂、五味子各30 g,麥冬、菖蒲、遠(yuǎn)志各15 g,生姜3片和大棗2枚為配伍,用12倍水煎煮2次,合并濾液,用旋轉(zhuǎn)儀蒸發(fā)濃縮成生藥量為2.5 g/mL的湯劑,冰箱貯存?zhèn)溆茫?;rt-PA(德國勃林格殷格翰制藥有限公司);凍干人凝血酶(上海太陽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn));戊巴比妥(上海上藥新亞藥業(yè)有限公司);三苯基四氮唑(TTC)(美國Biosharp公司);白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司);TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司);TRIzol(天根生化科技有限公司,中國);RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司,中國);熒光定量PCR試劑盒(大連TaKaRa公司,中國);Bcl-2、Bax、Caspase-3引物由大連TaKaRa公司設(shè)計(jì)并合成:Bcl-2上游引物為5′-CCCGTTGCTTTTCCTCTGG-3′,下游引物為 5′-ATCCCACTCGTAGCCCCTCT-3′;Bax上游引物為 5′-GACGAACTGGACAGTAACATGGA-3′,下游引物為5′-GCAAAGTAGAAAAGGGCGACA-3′;Caspase-3上游引物為5′-GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA-3′,下游引物為 5′-AGGTTTGCTGCATCGACATCTG-3′;GAPDH 引物序列:上游引物為 5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′,下游引物為:5′-GGTATCCATCGCCATGCTC-3′;激光多普勒血流檢測(cè)儀(PE-5001,Sweden)(上海永州實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司);HBS-1096B酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);病理切片機(jī)、包埋機(jī)、脫水機(jī)(德國Leica公司);NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測(cè)儀(美國Thermo公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國BD公司)。

    1.3 分組及造模 將40只大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法均分為4組:假手術(shù)組、模型組、rt-PA組和地黃飲子湯組。每組用5只大鼠進(jìn)行血液采集和TTC染色、5只進(jìn)行細(xì)胞凋亡和mRNA檢測(cè)。大鼠術(shù)前12 h禁食,用戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉后沿進(jìn)行開顱,切除了硬腦膜,暴露了大腦中動(dòng)脈(MCA)。模型組、rt-PA和地黃飲子湯組將含有1 mL純化鼠凝血酶(1.5 UI)的微管插入MCA分叉的管腔內(nèi),仔細(xì)注射,誘導(dǎo)原位血栓形成。注射10 min后移除了移液管,此時(shí)血塊已經(jīng)穩(wěn)定。用激光多普勒血流檢測(cè)儀檢測(cè)左側(cè)大腦血流變化,當(dāng)凝血酶注射時(shí),腦血流速度從基線下降到至少60%,并且在至少20 min內(nèi)保持穩(wěn)定時(shí),血凝塊被定義為成功。假手術(shù)組只開顱不進(jìn)行相關(guān)操作。

    1.4 給藥方法 造模結(jié)束20 min后rt-PA組和地黃飲子湯組大鼠尾靜脈注射rt-PA(10 mg/kg),地黃飲子湯組同時(shí)灌胃給予地黃飲子湯(5 g/kg),其余組給予等量0.9%氯化鈉注射液。2 h后半夏瀉心湯組以5 g/kg進(jìn)行灌胃,對(duì)照組和模型組給予等量0.9%氯化鈉注射液。24 h后處死大鼠進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

    1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1)TTC染色。大鼠心臟取血后分離完整腦組織,行冠狀位切片,厚度2 mm,置于2%的TTC染液中孵育30 min,用磷酸鹽緩沖液終止染色。用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算梗死體積。2)ELISA法檢測(cè)血清中IL-6和TNF-α水平。對(duì)血液進(jìn)行離心,分離血清,按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行IL-6和TNF-α水平測(cè)定。3)TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。腦組織進(jìn)行石蠟包埋,切片(2.0 μm),經(jīng)脫蠟、酒精梯度脫水后,按TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。使用熒光顯微鏡檢測(cè)凋亡細(xì)胞(綠色熒光染色),最后用碘化丙啶(PI)反染細(xì)胞核,計(jì)數(shù)綠色和紅色熒光細(xì)胞,計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞率。4)RT-PCR法檢測(cè)Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)。取約0.1 g腦組織,用液氮充分研磨后加入1 mL TRIzol進(jìn)行總RNA提取,然后合成cDNA,制備20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。以 GADPH 作為內(nèi)參,采用 2-ΔΔCt法計(jì)算Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用IBM SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以()表示,采用單因素方差分析進(jìn)行判斷,組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1 各組大鼠腦梗死體積和細(xì)胞凋亡率的比較 見表1,圖1~2。與假手術(shù)組比較,其余各組大鼠腦梗死體積和細(xì)胞凋亡率增高(P<0.05);與模型組比較,rt-PA組和地黃飲子湯組大鼠腦梗死體積和細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與rt-PA組比較,地黃飲子湯組大鼠腦梗死體積和細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。

    表1 各組大鼠腦梗死體積和細(xì)胞凋亡率比較(%,±s)

    表1 各組大鼠腦梗死體積和細(xì)胞凋亡率比較(%,±s)

    與假手術(shù)組相比較,#P<0.05;與模型組相比較,*P<0.05;與rt-PA組相較,△P<0.05。下同

    細(xì)胞凋亡率0.42±0.06 4.81±0.23#2.94±0.26#*1.85±0.20#*△組別假手術(shù)組模型組rt-PA組地黃飲子湯組n 5 5 5 5大鼠腦梗死體積0.00±0.00 37.51±5.43#29.97±3.14#*18.64±2.07#*△

    圖1 各組大鼠腦梗死體積

    圖2 各組大鼠細(xì)胞凋亡情況

    2.2 各組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平的比較 見表2。與假手術(shù)組比較,其余各組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平均增高(P<0.05);與模型組比較,rt-PA組和地黃飲子湯組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05);與rt-PA組比較,地黃飲子湯組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05)。

    表2 各組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平比較(ng/L,±s)

    表2 各組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平比較(ng/L,±s)

    組別假手術(shù)組模型組rt-PA組地黃飲子湯組n 5 5 5 5 IL-6 123.19±15.02 463.57±26.26 281.49±30.09#*198.34±22.04#*△TNF-α 31.57±4.38 201.84±26.19#136.46±15.41#*75.54±9.20#*△

    2.3 各組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平的比較 見表3。與假手術(shù)組比較,其余各組大鼠腦組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)降低,Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平增高(P<0.05);與模型組比較,rt-PA組和地黃飲子湯組大鼠腦組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)增高,Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05);與rt-PA組比較,地黃飲子湯組大鼠Bcl-2 mRNA表達(dá)增高,Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。

    表3 各組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較(±s)

    表3 各組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較(±s)

    組別假手術(shù)組模型組rt-PA組地黃飲子湯組n5 5 5 5 Bcl-2 1.00±0.06 0.57±0.06 0.69±0.09#*0.84±0.04#*△Bax 1.00±0.04 2.84±0.19#1.98±0.21#*1.54±0.20#*△Caspase-3 1.00±0.07 3.05±0.26#2.71±0.35#*1.94±0.28#*△

    3討論

    腦梗死屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”“卒中”范疇,其病因多為痰濁上泛,下元虛衰,阻塞竅道所致,祛瘀通絡(luò)、化痰瀉濁的方劑可切中其病機(jī)[10]。地黃飲子湯具有開竅化痰的功效,在臨床對(duì)于風(fēng)痰瘀阻證患者,取得了滿意的療效?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明,地黃飲子湯具有清除自由基、抗脂質(zhì)氧化的作用[11]。臨床研究表明,地黃飲子湯能顯著清除急性腦梗死患者的自由基,改善血液流變學(xué)指標(biāo),保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[12]。本研究也顯示,地黃飲子湯可以降低rt-PA溶栓后ACI大鼠的腦梗死體積。筆者推測(cè),其作用機(jī)制可能與抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有關(guān),因?yàn)樵俦狙芯恐泄P者也檢測(cè)到地黃飲子湯組大鼠細(xì)胞凋亡明顯受到抑制。

    rt-PA治療后最嚴(yán)重的并發(fā)癥是出血和血腦屏障破裂。一些實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明,rt-PA溶栓治療可能抵消對(duì)微循環(huán)的有益影響,這可能與rt-PA介導(dǎo)了血腦屏障(BBB)通透性的增加有關(guān)[13]。腦缺血/再灌注導(dǎo)致促炎介質(zhì)(TNF-α和IL-6)的釋放,進(jìn)而導(dǎo)致駐留細(xì)胞和浸潤細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP),從而增加BBB的通透性,促進(jìn)腦水腫的形成,并導(dǎo)致腦卒中的急性死亡[14]。地黃飲子湯顯著降低了IL-6和TNF-α水平,從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

    在ACI中,視缺血缺氧程度,細(xì)胞可能發(fā)生壞死和凋亡。缺血核心區(qū)的細(xì)胞由于長期嚴(yán)重缺氧缺血而死亡,這是一個(gè)不可逆的過程。在缺血半暗區(qū),位于缺血灶周圍,缺血程度較低,及時(shí)建立側(cè)支循環(huán),可在一定程度上改善腦功能[15]。近期發(fā)現(xiàn)急性腦梗死后半暗區(qū)細(xì)胞凋亡是治療急性腦梗死的關(guān)鍵,這一過程是可逆的,可抑制細(xì)胞功能的恢復(fù)[16]。因此,有效抑制該區(qū)域的凋亡對(duì)減少腦細(xì)胞凋亡和神經(jīng)功能損傷具有重要意義。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞維持自身穩(wěn)定的重要機(jī)制,如果藥物的保護(hù)作用及時(shí)生效,細(xì)胞的凋亡會(huì)減少,但細(xì)胞死亡的過程也會(huì)延遲。

    Bcl-2家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡信號(hào)通路中起主要作用。Bcl-2是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的主要抑制蛋白。對(duì)急性腦梗死患者的研究表明,血清中Bcl-2的表達(dá)明顯下降,提示患者抗凋亡功能下降[17]。正常情況下,Bcl-2和Bax的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定。然而,當(dāng)Bax過表達(dá)時(shí),Bax二聚體數(shù)量顯著增加,刺激細(xì)胞,引起細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bcl-2高表達(dá)時(shí),Bax二聚體解離形成更穩(wěn)定的Bcl-2和Bax復(fù)合物,從而延長細(xì)胞壽命[18]。因此,Bcl-2/Bax的比例在維持細(xì)胞存活過程中起著重要作用。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族的成員,是參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶,通過降解細(xì)胞內(nèi)底物激活細(xì)胞凋亡通路,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此,它被稱為“分子開關(guān)”,但其活化依賴于細(xì)胞色素C的釋放,而Bcl-2家族,包括Bcl-2,可以通過線粒體介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放[19]。本研究結(jié)果也證實(shí)了地黃飲子湯能抑制Caspase-3和Bax的表達(dá),促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)。

    綜上所述,地黃飲子湯可降低缺血性病變體積,降低rt-PA溶栓后急性腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡,從而為地黃飲子湯防治急性腦梗死溶栓后再灌注損傷提供理論依據(jù)。

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