天冬酰胺酶-吳茱萸堿核殼型脂質(zhì)納米粒的藥動學(xué)研究

黃永佳，楊 林，李 瑤，楊 強，楊仕鈺，張景勍

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院重慶高校藥物工程研究中心，重慶 400016；2. 重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系，重慶 401331；3. 重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心藥學(xué)部，重慶 400036)

與小分子化療藥相比，生物大分子藥物如酶、抗體等，具有特異性高和催化效力強的優(yōu)點[1]。天冬酰胺酶(asparaginase，ASNase)是一種自然界中廣泛分布的酶，其可以水解營養(yǎng)氨基酸天冬酰胺。在正常細胞中，天冬酰胺是一種非必需氨基酸，細胞可以通過自身的天冬酰胺合成酶合成天冬酰胺。然而，腫瘤細胞只能依賴于血液循環(huán)中提供的天冬酰胺，ASNase的使用會引起某些癌細胞的營養(yǎng)剝奪，從而導(dǎo)致腫瘤細胞死亡[2]。目前，臨床上主要將ASNase與其他小分子化療藥或放射療法聯(lián)合，用于治療急性淋巴細胞白血病。研究表明，接受ASNase治療的白血病患者其生存期明顯延長[3]。此外，ASNase在實體腫瘤，如乳腺癌[4]、卵巢癌[5]和肺癌[6]的研究中也取得了一定的效果。但是，治療過程中發(fā)生的許多嚴(yán)重不良反應(yīng)，如過敏反應(yīng)、凝血異常、胰腺炎等，限制了ASNase的進一步應(yīng)用[7]。此外，ASNase還具有穩(wěn)定性差、生物利用度低等不足[8]。

吳茱萸堿(evodiamine，EVO)是一種天然抗腫瘤活性物質(zhì)，可通過阻滯腫瘤細胞周期和誘導(dǎo)線粒體凋亡而抑制腫瘤細胞[9]。但EVO幾乎不溶于水，生物利用度非常低，限制了其應(yīng)用[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)，將EVO與環(huán)糊精制備成包合物可提高EVO的水溶性，增加其生物利用度[11]。

綜上所述，聯(lián)合ASNase的腫瘤“饑餓療法”和EVO的小分子化療機制，即一方面剝奪腫瘤細胞的營養(yǎng)供給，另一方面予以營養(yǎng)缺陷的腫瘤細胞致命打擊，理論上可以發(fā)揮良好的協(xié)同抗癌作用。為了解決兩者臨床應(yīng)用上的不足，本研究首次制備了新型天冬酰胺酶-吳茱萸堿核殼型脂質(zhì)納米粒(asparaginase-evodiamine core-shell lipidic nanoparticles，AELNs)。首先通過透明質(zhì)酸衍生物與羥丙基-β-環(huán)糊精在緩沖液中的自組裝作用，將ASNase包封進去形成納米粒的“核”。然后與復(fù)方藥物EVO的環(huán)糊精包合物(evodiamine-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex，EH)一起包封于脂質(zhì)囊殼中，從而形成具有“核-殼”型結(jié)構(gòu)的納米粒。AELNs具有長循環(huán)、生物相容性好、穩(wěn)定性佳等優(yōu)勢，理論上能提高ASNase和EVO的生物利用度。

1 材料

1.1 實驗動物清潔級SD大鼠，♂，體質(zhì)量(250±20)g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證編號：SCXK-(渝)2016-0001。

1.2 藥物與試劑ASNase，純度96%，來源于E.coli.，購自以色列Prospec公司；EVO，純度>99%，購自武漢遠城科技發(fā)展有限公司；天冬酰胺，純度98%，購自美國Sigma公司；Tris-HCl緩沖液(50 mmol·L-1，pH 7.3)，自配；甲醇(色譜純)，購自美國天地有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器Agilent 1100液相色譜儀(美國安捷倫公司)；UV-2600紫外分光光度計(島津儀器有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；TGL-16B臺式高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

2 方法

2.1 ASNase活性的測定

2.1.1Nessler試劑比色法 ASNase可以催化天冬酰胺分解產(chǎn)生游離氨，因此可以參照Nessler試劑比色法[12]，間接測定ASNase的活性。配制適當(dāng)濃度的天冬酰胺溶液，加入37 ℃預(yù)熱的ASNase血漿樣品，恒溫反應(yīng)10 min后，三氯乙酸終止反應(yīng)。離心，取上清液，加入Nessler試劑顯色，測定紫外吸收。根據(jù)氨氮標(biāo)準(zhǔn)曲線計算反應(yīng)生成的氨量。1個酶活力單位是指在實驗溫度37 ℃、pH7.3條件下，轉(zhuǎn)化1 μmol天冬酰胺所需的ASNase量。

2.1.2線性范圍 配制系列硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液，含氮濃度分別為0、40、80、200、400、480、600、800 mg·L-1，分別按“2.1.1”項處理后(ASNase血漿樣品替換為空白血漿)，最終測定的氮濃度分別為0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.2、1.5、2.0 mg·L-1。以不含氮組樣品為空白參比，測定其余各樣品在420 nm處的吸光度，根據(jù)氮濃度和吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3重復(fù)性 配制低、中、高(80、400、800 mg·L-1)濃度的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度5份，分別按“2.1.1”項處理后測定吸光度值，根據(jù)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各測量值之間的RSD，考察方法的重復(fù)性。

2.1.4回收率 配制“2.1.3”項溶液，同法處理后，計算氮測得量與加入量的比值，考察方法的準(zhǔn)確度。

2.2 EVO含量的測定

2.2.1血漿樣品的處理 吸取100 μL血漿樣品，加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作液(和厚樸酚20 mg·L-1)，加入氨水(2 ∶1，V∶V)，渦旋0.5 min后，加入5倍體積的乙醚沉淀蛋白，繼續(xù)渦旋3 min。所得樣品溶液于6 000 r·min-1離心5 min，取上清液至離心管中，氮氣揮去乙醚。加入等血漿體積的甲醇復(fù)溶，渦旋，離心，取上清液40 μL進樣，檢測EVO含量。

2.2.2色譜條件 色譜柱：Lichrospher C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長：225 nm；流動相：甲醇 ∶水(70 ∶30，V∶V)，柱溫：35 ℃，流速：1.0 mL·min-1。

2.2.3專屬性 取空白血漿、空白血漿+EVO+和厚樸酚、血漿樣品+和厚樸酚，分別按“2.2.1”項方法處理血漿樣品，在“2.2.2”項條件下進行分析，記錄色譜圖。

2.2.4線性范圍 配制100 mg·L-1的EVO甲醇溶液，分別用流動相稀釋至濃度為5、10、20、50、100、200、400、500、800、1 000、2 000、5 000 μg·L-1的EVO標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取SD大鼠空白血漿100 μL，分別加入上述EVO標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL制備模擬血漿樣品。按“2.2.1”項方法處理后，進樣檢測藥物峰和和厚樸酚峰。以EVO峰面積和和厚樸酚峰面積的比值(S∶Sr，Y)對EVO的濃度(C)做線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。

2.2.5精密度 制備低、中、高3個濃度的EVO模擬血漿樣品(EVO濃度分別為1、5、20 mg·L-1)，各濃度平行配制3份，分別按“2.2.1”項方法處理后，得到EVO濃度分別為100、500、2 000 μg·L-1的檢測樣品，在“2.2.2”項條件下進行分析，1 d內(nèi)連續(xù)測定5次考察日內(nèi)精密度，連續(xù)檢測5 d考察日間精密度。

2.2.6回收率 制備“2.2.5”項檢測樣品，分別測定EVO的峰面積，計算各質(zhì)量濃度的平均峰面積(Ar)。配制相同質(zhì)量濃度的對照品溶液直接進樣，計算平均峰面積(As)。由Ar與As的比值，分別計算低、中、高3個濃度EVO的提取回收率。

2.3 給藥方案與樣品采集

2.3.1AELNs的制備 首先稱取處方量的ASNase溶于10 g·L-1的聚乙二醇化透明質(zhì)酸溶液中，將其緩慢加入60 g·L-1的羥丙基-β-環(huán)糊精溶液中，冰浴下磁力攪拌2 h即得納米制劑的“核”。接著，稱取處方量的卵磷脂和膽固醇于圓底燒瓶中，加入適量二氯甲烷溶解，減壓除去二氯甲烷至形成均勻薄膜后，加入乙醚復(fù)溶。稱取處方量的EH，連同上述“核”溶液一起加入有機相中，超聲至形成均勻帶乳光的分散體系。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)至凝膠狀塌陷為均勻液體，即得核殼型脂質(zhì)納米粒AELNs，ASNase的濃度為5×105IU·L-1。

2.3.2ASNase溶液的配制 稱取5 000 IU ASNase于10 mL容量瓶中，加入Tris-HCl緩沖液溶解并稀釋至刻度，即得5×105IU·L-1的游離ASNase溶液。

2.3.3EVO混懸液的配制 稱取5.0 mg EVO于10 mL容量瓶中，加入0.5%的羧甲基纖維鈉液助懸，稀釋至刻度即得0.5 g·L-1的EVO混懸液。

2.3.4動物實驗 將18只SD大鼠隨機分成3組，禁食不禁水12 h。分別尾靜脈注射AELNs、游離ASNase或EVO混懸液(ASNase給藥劑量為2 000 IU·kg-1，EVO給藥劑量為2 mg·kg-1)。給藥后，于不同時間點眼底靜脈采集48 h內(nèi)血樣，采血體積約0.3 mL，離心，取上清液，置-20 ℃冷凍備用。

2.4 藥動學(xué)研究分別按“2.1”和“2.2”項所述方法，測定血漿樣品中ASNase和EVO的含量，繪制血藥濃度隨時間變化的曲線。根據(jù)血樣測定結(jié)果，使用DAS軟件(2.1.1版)計算藥代動力學(xué)參數(shù)，比較制劑AELNs與游離藥物ASNase或EVO的藥代動力學(xué)行為和生物利用度差異。

3 結(jié)果

3.1 ASNase測定方法學(xué)經(jīng)考察，氨氮濃度在0.1～2.0 mg·L-1范圍內(nèi)時，氨與Nessler試劑反應(yīng)形成的絡(luò)合物，在420 nm處的吸光度與氨氮濃度呈線性相關(guān)。線性回歸方程為：Y= 0.220 5C-0.012 1(r=0.9997)。重復(fù)測定低、中、高3個濃度氨氮溶液5次結(jié)果的RSD分別為3.80%、1.08%、2.62%，平均回收率分別為112.55%、103.98%、104.27%。表明該方法重復(fù)性和準(zhǔn)確性良好，符合測定要求。

3.2 EVO測定方法學(xué)如Fig 1所示，血漿中雜質(zhì)或內(nèi)源性物質(zhì)對EVO的測定無干擾，表明該分析方法專屬性強。經(jīng)分析，EVO濃度在5～5 000 μg·L-1時，其峰面積比(Y)與EVO的濃度(C)線性相關(guān)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.001 3C+0.033 1(r=0.999 4)。低、中、高3個濃度的日內(nèi)精密度分別為3.18%、1.50%、3.83%，日間精密度分別為5.00%、4.11%、3.98%，平均回收率分別為92.70%、91.19%、93.13%，均滿足方法驗證的要求。

Fig 1 Chromatograms of blank plasma(A), blankplasma+EVO+honokiol(B) and plasma sample+honokiol(C)

1:EVO;2:honokiol

3.3 AELNs中ASNase的藥動學(xué)研究以時間為橫坐標(biāo)，血漿中ASNase濃度為縱坐標(biāo)，繪制靜脈注射AELNs和游離ASNase后，大鼠體內(nèi)ASNase的藥-時曲線。如Fig 2所示，AELNs組的AUC(0～48 h)明顯大于游離ASNase組。靜脈注射游離ASNase后，酶活性下降較AELNs快，12 h時活性消失。而AELNs組失活較慢，24 h尚有一定活性。結(jié)果表明，AELNs可延長ASNase在大鼠體內(nèi)的活性保留時間。

Fig 2 Mean concentration-time curve of ASNaseafter intravenous administration in

經(jīng)DAS軟件(2.1.1版)計算，得到AELNs和游離ASNase的藥代動力學(xué)參數(shù)見Tab 1(非房室模型)和Tab 2(房室模型)。從非室模型藥動學(xué)參數(shù)可知，AELNs的AUC(0～48 h)較游離ASNase增加了約39.07 U·mL-1·h-1，表明血液循環(huán)中AELNs的保留量增加；MRT(0～48h)和Cmax分別為游離ASNase的1.94倍和1.14倍，同時游離ASNase的血漿清除速率是AELNs的2.13倍，說明AELNs在血液循環(huán)中清除較慢，持續(xù)時間較長。房室模型結(jié)果與非室模型結(jié)果幾乎一致。與游離ASNase相比，AELNs的相對生物利用度約為183.15%(非房室模型)或169.11%(房室模型)。以上結(jié)果表明，AELNs延長了ASNase在大鼠體內(nèi)的血液循環(huán)時間，提高了ASNase的生物利用度。

3.4 AELNs中EVO的藥動學(xué)研究繪制靜脈注射AELNs和游離EVO后大鼠體內(nèi)EVO的藥-時曲線(Fig 3)。由于復(fù)方藥物EVO的靜脈給藥量(2 mg·kg-1)較低，游離EVO組血藥濃度低于檢測限而未表示出來。如Fig 3所示，靜脈注射相同劑量的AELNs(按EVO計)后，AELNs在大鼠血液循環(huán)中的保留時間長達6 h。從AELNs的非房室模型主要藥動學(xué)參數(shù)(Tab 3)可知，AELNs的Cmax可達423.37 μg·L-1，AUC(0～48 h)為527.81 μg·L-1·h-1。與張雪等[11]研究結(jié)果經(jīng)劑量換算后比較，在不考慮非線性動力學(xué)的情況下，AELNs的相對生物利用度約為游離EVO的28.94倍，EH的11.64倍。以上結(jié)果說明，AELNs可延緩EVO的體內(nèi)清除速率，提高EVO在大鼠體內(nèi)的生物利用度。

Tab 1 Non-compartment model pharmacokinetic parameters ofintravenously injected AELNs and free ASNase in

Tab 2 Compartment model pharmacokinetic parameters ofintravenously injected AELNs and free ASNase in

Fig 3 Mean concentration-time curve of EVO inAELNs after intravenous administration in

ParameterNon-compartmentmodelCompartmentmodelAUC(0～48 h)/μg·L-1·h-1527.81±31.14518.48±80.66AUC(0-∞)/μg·L-1·h-1656.15±75.78664.81±100.54MRT(0～48 h)/h1.29±0.03-MRT(0-∞)/h2.36±0.39-t1/2/h-1.43±0.08CL/L·h-1·kg-10.01±0.000.01±0.00V/L·kg-10.02±0.000.02±0.00Tmax/h0.50±0.000.50±0.00Cmax/μg·L-1423.37±12.71423.37±12.71α-0.49±0.03β-0.31±0.27k10-0.42±0.04k12-0.18±0.26k21-0.34±0.23

4 討論

ASNase是一種有效的抗癌酶，其介導(dǎo)的是營養(yǎng)剝奪療法。該酶可以將腫瘤部位的必需氨基酸天冬酰胺水解掉，從而導(dǎo)致腫瘤細胞營養(yǎng)缺陷[2]，對化療藥物敏感。EVO可通過阻滯腫瘤細胞周期和誘導(dǎo)線粒體凋亡而抑制腫瘤細胞增殖[9]。兩種藥物的組合理論上可通過不同的作用機制增強抗癌作用。因此，本研究首次將ASNase和EVO共同包載于新型核殼型脂質(zhì)納米粒AELNs中，并初步考察了AELNs在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為。

本實驗分別采用Nessler試劑比色法和HPLC法，測定血漿樣品中ASNase和EVO的濃度，方法準(zhǔn)確、可靠。大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)結(jié)果顯示，AELNs的相對生物利用度約為游離ASNase的1.83倍。與張雪等[11]研究結(jié)果相比較，AELNs的相對生物利用度約為游離EVO的28.94倍。表明通過將藥物包封在核殼型脂質(zhì)納米粒中，可明顯提高藥物的生物利用度。該納米粒提高ASNase生物利用度的機制可能是：① 納米粒表面的聚乙二醇可以減少載體與血液成分的相互作用，減少RES系統(tǒng)的攝取和腎臟的清除，從而延長納米粒在體內(nèi)的半衰期[13]；② 納米粒對ASNase具有封裝保護效應(yīng)，可以有效減少藥物分子與血液循環(huán)中多種代謝酶的接觸，從而減少血漿清除率；③ 納米?？梢跃S持ASNase的有效構(gòu)象，提高其穩(wěn)定性和催化活性[8,12]。納米粒提高EVO生物利用度的機制除了與ASNase相同的①、②兩點外，可能還有：③ EVO屬于難溶性藥物，通過環(huán)糊精的包合技術(shù)可以增加其溶解度，改善其在體內(nèi)的吸收和分布行為[11]；④ 納米粒中的脂質(zhì)成分與生物細胞膜親和力強，可以增加EVO到達靶部位的量[14]。綜上所述，該新型核殼型脂質(zhì)納米?？梢杂行岣逜SNase和EVO的生物利用度。

本實驗首次制備的新型自組裝核殼型脂質(zhì)納米粒，不僅可以同時提高大分子藥物ASNase和小分子藥物EVO的生物利用度和延長血液循環(huán)時間，制劑結(jié)構(gòu)中的透明質(zhì)酸衍生物還具有腫瘤CD44受體靶向的特點[15]。因此，在本實驗基礎(chǔ)上，還可進一步考察AELNs的腫瘤靶向效率和協(xié)同抑癌作用，為構(gòu)建生物相容性好、靶向性佳、療效可靠的蛋白多肽類藥物與小分子藥物協(xié)同遞送系統(tǒng)奠定良好的基礎(chǔ)。

(致謝: 本實驗在重慶醫(yī)科大學(xué)重慶高校藥物工程研究中心完成，在此真誠感謝實驗室的所有老師和同學(xué)。)