環(huán)氧澤瀉烯對(duì)2型糖尿病小鼠的降糖作用

張偉云，王明軍，劉華欣，王 青，陳全成

(1.廈門(mén)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建 廈門(mén) 361023；2.廈門(mén)大學(xué)藥學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102)

糖尿病是一種嚴(yán)重危害健康的代謝性疾病[1]。糖尿病患者中90%以上屬于2型糖尿病，2型糖尿病主要特征是胰島素抵抗和高血糖[2]。糖尿病治療的重點(diǎn)是降低血糖水平，因?yàn)楦哐鞘翘悄虿〔l(fā)癥的主要原因[2-3]。中藥澤瀉[Alismaorientalis(Samuel.) Juzep.]提取物具有較好的降糖活性[4]，但具體的降糖有效成分及其作用機(jī)制尚不十分明確。倍半萜類(lèi)化合物是澤瀉的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，其主要代表性成分環(huán)氧澤瀉烯(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)Fig 1)具有抗炎作用[5]。本實(shí)驗(yàn)為探討環(huán)氧澤瀉烯是否具有降血糖活性，應(yīng)用鏈脲佐菌素和煙酰胺建立了2型糖尿病小鼠模型[6]。羅格列酮通過(guò)增強(qiáng)胰島素敏感性，有效控制2型糖尿病患者的血糖[7]，因此，本實(shí)驗(yàn)選用羅格列酮作為陽(yáng)性對(duì)照藥。在誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞后，對(duì)胰島素的敏感性增強(qiáng)，新的成熟脂肪細(xì)胞加快消耗外部環(huán)境中葡萄糖。因此，前脂肪細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于降血糖藥物的篩選[8]。本實(shí)驗(yàn)采用3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化模型，探索了環(huán)氧澤瀉烯對(duì)前脂肪細(xì)胞脂分化過(guò)程的影響。

Fig 1 Chemical structure of alismoxide

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6 ♂小鼠，5～6周齡，體質(zhì)量(21～23) g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為2015000501745，適應(yīng)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。

1.3 藥物與試劑鏈脲佐菌素、煙酰胺、葡萄糖、胰島素、羅格列酮、油紅O和哈里斯氏蘇木精染劑，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；葡萄糖熒光示蹤劑2-[N-(7-硝基苯-2-氧代-1，3-重氮基-4-基)氨基]-2-脫氧-D-葡萄糖(2-NBDG)，購(gòu)自美國(guó)Molecular Probes公司；環(huán)氧澤瀉烯(純度>98%)，購(gòu)自成都瑞芬思有限公司；胎牛血清、胰酶、低糖DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；其他試劑均為分析級(jí)。

1.4 儀器羅氏血糖儀(羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司); IFS-110-8型CO2恒溫培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司)；熒光顯微鏡XTZ-Y3(上海天珠光學(xué)儀器廠)。

2 方法

2.1 2型糖尿病模型的誘導(dǎo)參照文獻(xiàn)方法[4]，將C57BL/6 ♂小鼠禁食過(guò)夜后，腹腔注射240 mg·kg-1煙酰胺，15 min后，腹腔注射100 mg·kg-1鏈脲佐菌素誘導(dǎo)2型糖尿病模型。2 d后再次腹腔注射相同劑量的煙酰胺和鏈脲佐菌素。通過(guò)測(cè)試3周后小鼠空腹血糖值和d 22口服葡萄糖耐受試驗(yàn)期間空腹血糖值，來(lái)判斷2型糖尿病模型是否誘導(dǎo)成功。與空白對(duì)照組相比，腹腔注射煙酰胺和鏈脲佐菌素的小鼠空腹血糖值均高于11.1 mmol·L-1，則提示2型糖尿病小鼠建模成功，并將成模后的小鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組、10 mg·kg-1羅格列酮組、環(huán)氧澤瀉烯組(5、10、20 mg·kg-1)，每組8只小鼠，用于灌胃給藥和測(cè)定相應(yīng)組小鼠血糖濃度、體重。每組分別按照下列方式灌胃3周?？瞻讓?duì)照組正常小鼠和2型糖尿病模型組每日灌胃生理鹽水，羅格列酮組每日灌胃羅格列酮10 mg·kg-1，環(huán)氧澤瀉烯組按小鼠體重灌胃相應(yīng)劑量的環(huán)氧澤瀉烯。

2.2 造模期間血糖濃度測(cè)定第1次注射煙酰胺和鏈脲佐菌素前，采集小鼠血液20 μL，注射后的每7 d采集1次血液，即在d 0、7、14、21，分別使用血糖測(cè)試儀測(cè)量血糖濃度。d 22進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)，小鼠禁食過(guò)夜后，各組分別灌胃2.0 g·kg-1的葡萄糖溶液，然后，在灌胃葡萄糖溶液前(0 min)，以及灌胃葡萄糖溶液后的第30、60、120 min，分別采集各組小鼠血液標(biāo)本，測(cè)定血糖濃度。d 21空腹血糖值和d 22口服葡萄糖耐量試驗(yàn)中，血糖值均高于11.1 mmol·L-1的小鼠作為模型組小鼠。

2.3 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)各組灌胃給藥后的d 22進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)。小鼠禁食過(guò)夜后，空白對(duì)照組、糖尿病模型組均灌胃生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃10 mg·kg-1羅格列酮，測(cè)試組分別灌胃5、10、20 mg·kg-1環(huán)氧澤瀉烯，2 h后，各組分別灌胃2.0 g·kg-1的葡萄糖溶液，然后，在灌胃葡萄糖溶液前(0 min)，以及灌胃葡萄糖溶液后的第30、60、120 min，分別采集各組小鼠血液標(biāo)本，測(cè)定血糖濃度。

2.4 環(huán)氧澤瀉烯對(duì)2型糖尿病小鼠降糖活性的測(cè)定通過(guò)測(cè)定灌胃給藥前(d 0)和灌胃給藥后d 7、14、21的空腹血糖水平，比較陽(yáng)性對(duì)照藥羅格列酮及環(huán)氧澤瀉烯不同劑量對(duì)2型糖尿病小鼠血糖濃度的影響。

2.5 體重測(cè)定2型糖尿病模型建立過(guò)程中和模型建立之后灌胃給藥期間，測(cè)定和記錄各組動(dòng)物體重。

2.6 細(xì)胞培養(yǎng)小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞用添加10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.7 油紅O染色參照文獻(xiàn)方法[9]，3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。首先，將3T3-L1前脂肪細(xì)胞按照4×103個(gè)細(xì)胞/孔的標(biāo)準(zhǔn)接種到96孔板，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)24 h后，再換成含10%胎牛血清和1 μmol·L-1胰島素的DMEM，并分別用含有環(huán)氧澤瀉烯(0.5、1 μmol·L-1)、羅格列酮(0.5、1 μmol·L-1)的DMEM培養(yǎng)3 d。對(duì)照組細(xì)胞不需要用其他藥物處理，只用1 μmol·L-1胰島素處理。各組細(xì)胞培養(yǎng)12 d后，用油紅O溶液染色。首先在室溫條件下，用10%福爾馬林溶液固定細(xì)胞1 h，然后用油紅O溶液染色細(xì)胞2 h，再用蘇木精-伊紅染色15 min。接著用60%異丙醇溶液清洗細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合細(xì)胞的染料。最后，將細(xì)胞置于顯微鏡下拍攝圖像(400×)。

3 結(jié)果

3.1 建立2型糖尿病小鼠模型期間的小鼠體重變化在造模期間，分別記錄各組小鼠的體重。與空白對(duì)照組相比，2型糖尿病模型組小鼠體重有所下降, 但差異并無(wú)顯著性。

3.2 環(huán)氧澤瀉烯對(duì)2型糖尿病小鼠血糖的影響羅格列酮10 mg·kg-1劑量組連續(xù)每天給藥1次，與2型糖尿病模型組小鼠相比，d 0(給藥羅格列酮之前)和給予羅格列酮的d 7、14、21的血糖明顯降低。環(huán)氧澤瀉烯10 mg·kg-1劑量組比5 mg·kg-1劑量組的降血糖活性稍好，但差異無(wú)顯著性(P<0.05)，而20 mg·kg-1劑量組降血糖活性與10 mg·kg-1劑量組相近(Fig 2)。

3.3 環(huán)氧澤瀉烯對(duì)2型糖尿病小鼠口服葡萄糖耐受試驗(yàn)的影響為了測(cè)定環(huán)氧澤瀉烯對(duì)葡萄糖耐受和胰島素分泌的影響，對(duì)2型糖尿病模型組和藥物組進(jìn)行了口服葡萄糖耐受試驗(yàn)。與2型糖尿病模型組相比，每日給予劑量10 mg·kg-1且持續(xù)21 d的羅格列酮組于d 22的口服葡萄糖耐受試驗(yàn)中，第30 min和60 min明顯地降低了小鼠血糖值，每日給予10、20 mg·kg-1且持續(xù)21 d的環(huán)氧澤瀉烯組于d 22的口服葡萄糖耐受試驗(yàn)中，第30 min和60 min也體現(xiàn)出降低血糖的趨勢(shì)。每日給予5 mg·kg-1環(huán)氧澤瀉烯組在持續(xù)給藥21 d后，在口服葡萄糖耐受試驗(yàn)中也體現(xiàn)出降低血糖的活性，但是與2型糖尿病模型組相比，降血糖活性并不明顯(Fig 3)。

Fig 2 Influence of alismoxide on blood

##P<0.01vsblank control group;**P<0.01vstype 2 diabetic model group

Fig 3 Influence of alismoxide on blood

#P<0.05,##P<0.01vsblank control group;*P<0.05vstype 2 diabetic model group

3.4 環(huán)氧澤瀉烯對(duì)2型糖尿病小鼠體重的影響與2型糖尿病模型組比較，每天灌胃10 mg·kg-1羅格列酮或環(huán)氧澤瀉烯并沒(méi)有對(duì)小鼠體重產(chǎn)生明顯的影響(Fig 4)。

Fig 4 Effect of alismoxide on body

3.5 環(huán)氧澤瀉烯對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響如Fig 5所示，與空白對(duì)照組和對(duì)照組相比，羅格列酮促進(jìn)了3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程，并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)趨勢(shì)。環(huán)氧澤瀉烯(0.5、1 μmol·L-1)也加速了3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程，并且展現(xiàn)出比羅格列酮更強(qiáng)的趨勢(shì)。

4 討論

目前，臨床用于血糖控制的口服抗糖尿病西藥均有不同程度的不良反應(yīng)或副作用[10]，而中藥治療2型糖尿病及其并發(fā)癥具有良好的臨床療效和應(yīng)用前景[11]。據(jù)報(bào)道，植物多糖、生物堿、黃酮、苷類(lèi)、肽類(lèi)等具有降血糖活性[12-13]，但是具體的活性物質(zhì)及其作用機(jī)制尚不明確。因此，從中藥資源中尋找具有明確機(jī)制的、安全的活性物質(zhì)用于防治2型糖尿病迫在眉睫[14]。作者前期研究結(jié)果表明，灌胃給予澤瀉乙酸乙酯萃取層不僅能降低2型糖尿病小鼠空腹血糖，而且在口服葡萄糖耐量試驗(yàn)期間降低血糖[4]，但是具體的有效活性物質(zhì)還需深入探索。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)2型糖尿病小鼠模型和3T3-L1前脂肪細(xì)胞模型，探索了澤瀉中具有降低血糖活性的有效成分。

通過(guò)測(cè)定并對(duì)比空白對(duì)照組和2型糖尿病模型組小鼠血糖值，從而確定2型糖尿病小鼠模型是否建立成功，選擇空腹血糖值高于11.1 mmol·L-1的小鼠作為2型糖尿病模型[15]。結(jié)果顯示，2型糖尿病模型組小鼠在腹腔注射煙酰胺和鏈脲佐菌素后的d 21，空腹血糖值均高于11.1 mmol·L-1，且明顯高于空白對(duì)照組小鼠血糖值。在口服葡萄糖耐受試驗(yàn)的0、30、60、120 min，2型糖尿病模型組小鼠血糖值均高于空白對(duì)照組，提示2型糖尿病模型組小鼠對(duì)胰島素敏感性降低，證明成功建立2型糖尿病模型。

Fig 5 Effect of alismoxide on 3T3-L1 preadipocyte differentiation(×400)

Representative images of Oil Red O-stained pre-adipocytes of blank control group(A), differentiated 3T3-L1 adipocytes in control group(B), and cells treated with 0.5 μmol·L-1rosiglitazone(C), 1 μmol·L-1rosiglitazone(D), 0.5 μmol·L-1alismoxide(E), and 1 μmol·L-1alismoxide(F).

每日按照2型糖尿病小鼠體質(zhì)量灌胃10 mg·kg-1羅格列酮1次，持續(xù)灌胃21 d后的血糖明顯低于d 1灌胃給藥前的血糖值。每日按照2型糖尿病小鼠體重灌胃1次，持續(xù)灌胃21 d后的環(huán)氧澤瀉烯(5、10、20 mg·kg-1)組的小鼠血糖值均低于d 1灌胃給藥前的血糖值，提示環(huán)氧澤瀉烯對(duì)2型糖尿病小鼠具有降血糖活性的潛力。

為探索環(huán)氧澤瀉烯對(duì)胰島素的敏感性，在連續(xù)灌胃羅格列酮或環(huán)氧澤瀉烯3周后，將小鼠禁食過(guò)夜，于d 22進(jìn)行了口服葡萄糖耐受試驗(yàn)。在口服葡萄糖耐受試驗(yàn)過(guò)程中，連續(xù)21 d每日灌胃給予羅格列酮10 mg·kg-1組、環(huán)氧澤瀉烯(10、20 mg·kg-1)組的2型糖尿病小鼠均呈現(xiàn)血糖降低的趨勢(shì)，因此推斷環(huán)氧澤瀉烯具有類(lèi)似羅格列酮降血糖的活性。脂肪細(xì)胞油紅O染色結(jié)果顯示，在0.5、1 μmol·L-1濃度下，環(huán)氧澤瀉烯促進(jìn)3T3-L1前脂肪分化，這可能有利于增強(qiáng)胰島素的敏感性，但需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)探索了環(huán)氧澤瀉烯對(duì)空腹血糖值、口服葡萄糖耐受試驗(yàn)過(guò)程中血糖值、3T3-L1前脂肪分化過(guò)程的影響，提示環(huán)氧澤瀉烯具有降血糖的潛力，促進(jìn)脂肪分化，但其具體作用機(jī)制需要深入研究。