胰島素抵抗狀態(tài)下阿爾茨海默病大鼠模型的建立

張梁， 黃新宇， 黃康柏， 白東艷， 郝燕， 吳清龍

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的發(fā)生原因與機制到目前為止在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域仍未可知[1]。根據(jù)AD的發(fā)病原因以及各種假說，國內(nèi)外眾多學(xué)者已經(jīng)建立了多種AD動物模型，但是均存在一定局限性[2]。目前轉(zhuǎn)基因動物模型能夠復(fù)制出AD的部分神經(jīng)病理特征，如β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積、營養(yǎng)障礙性神經(jīng)炎癥、神經(jīng)膠質(zhì)增生等[3]，但這并不能模擬出AD的全部發(fā)病過程。有研究指出，AD與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）有密切關(guān)聯(lián)。糖尿病與AD的分子機制之間存在重疊和交叉點，胰島素信號通路受損引起的胰島素抵抗是2型糖尿病和AD的共同特征，說明了AD與糖尿病的強相關(guān)性。因此，胰島素抵抗可視為AD發(fā)生的主要機制之一，AD可被認為是一種腦特異性糖尿病[4]。本研究就是以胰島素抵抗模型大鼠——OLETF大鼠為基礎(chǔ)，嘗試建立同時具有胰島素抵抗和AD特征的復(fù)合動物模型，探索一種較為理想并且更加接近真實病理情況的AD大鼠模型，也為深入研究AD的發(fā)病原因、發(fā)病機制及治療方法提供理論與實驗基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物5周齡SPF級同品系雄性LETO大鼠12只和雄性O(shè)LETF大鼠24只，均購自于日本SLC Inc.公司。大鼠全程飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，SPF級飼養(yǎng)環(huán)境，給予充足飼料和飲水。統(tǒng)一普通飲食，飼料配方按照質(zhì)量比如下：小麥18%，玉米31%，稻谷4%，豆粕21%，麩皮10%，黃豆2%，魚粉5%，蛋黃粉3%，植物油1.5%，預(yù)混料3.5%，多種維生素1%。溫度：18～22℃；濕度：40%～85%；光照：12 h明/12 h暗，每日手動開關(guān)；照度：150～300 Lx。

1.2試劑與儀器D-半乳糖（批號：G0750）、三氯化鋁（AlCl3）（批號：249882），購自美國Sigma公司；水合氯醛（批號：30037517），購自康達藥業(yè)有限公司；葡萄糖（Glu）測試盒（貨：F006-1-1），購自南京建成生物工程研究所；胰島素（INS）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（批號：CEA448Ra）、C肽（C-P）ELISA試劑盒（批號：CEA447Ra），購自美國Cloud-clone公司；Tau蛋白ELISA試劑盒（批號：AB32057）、Aβ ELISA試劑盒（批號：Ab22258），購自美國Abcam公司；β淀粉樣前體蛋白（APP）ELISA試劑盒（貨號：CSBEL001950RA）、β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1（BACE1）ELISA試劑盒（貨號：CSB-E15038r），購自武漢華美生物工程有限公司；早老素1（PS1）ELISA試劑盒（貨號：SEC200Ra），購自美國Cloud-Clone公司。Morris水迷宮采用DigBehv動物行為分析系統(tǒng)，購自上海吉量軟件科技有限公司。

1.3實驗分組所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，待所有大鼠適應(yīng)環(huán)境后進行水迷宮測試，參照Morris水迷宮的實驗方案，初步剔除不合格模型[5]。剔除標準：①定位航行平均逃避潛伏期較長的大鼠；②空間探索中跨越原平臺次數(shù)較少的大鼠；③有效區(qū)停留時間較短的大鼠。將不合格的大鼠淘汰，然后進行分組。

將篩選合格的8只正常LETO大鼠作為正常LETO組。將篩選合格后的OLETF大鼠依照隨機數(shù)字表[6]隨機選取8只作為OLETF組，剩余OLETF大鼠進行AD造模處理。造模完成后，用Morris水迷宮進行行為學(xué)測試，再按隨機數(shù)字表挑選8只大鼠作為復(fù)合模型AD-OLETF組。

1.4造模方法以胰島素抵抗OLETF大鼠為基礎(chǔ)對象，采用腹腔注射D-半乳糖（60 mg·kg-1·d-1）聯(lián)合灌胃AlCl3溶液（50 mg·kg-1·d-1）的方法建立AD模型[7]（作為AD-OLETF組）。按照10 mL/kg溶液體積配制溶液，連續(xù)造模90 d。

1.5觀察指標與方法

1.5.1 行為學(xué)觀察 在造模期間和造模后，觀察各組大鼠的飲食、體質(zhì)量、毛發(fā)、精神狀態(tài)及活動情況。

1.5.2 Morris水迷宮實驗 用Morris水迷宮圖像自動監(jiān)視處理系統(tǒng)完成對實驗數(shù)據(jù)的采集以及處理。

1.5.3 血漿空腹血糖（FPG）、血漿FINS、血清C-P、腦脊液INS含量測定 造模前及水迷宮測試后所有大鼠禁食12 h，按照0.003 3 mL/g的劑量腹腔注射體積分數(shù)100 g/L水合氯醛將大鼠預(yù)先麻醉，眼眶靜脈竇采血，檢測FPG。采用ELISA法檢測血漿FINS、血清C-P、腦脊液INS含量，具體步驟嚴格按試劑盒說明書。

1.5.4 海馬組織、腦脊液Aβ、Tau及海馬組織APP、BACE1、PS1含量測定 采血后，清理并暴露小腦及延髓部，用注射器針頭在腦膜上開孔，向內(nèi)插入細管，收集20～50 μL腦脊液。斷頭取腦，取大鼠海馬組織。將海馬分成左右兩部分備用，左側(cè)海馬CA1區(qū)進行切片染色，右側(cè)海馬檢測分析相關(guān)指標。采用ELISA法檢測海馬組織、腦脊液Aβ、Tau及海馬組織APP、BACE1、PS1含量，具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，并記錄相關(guān)參數(shù)。

1.6統(tǒng)計方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-x±s)表示。經(jīng)方差齊性檢驗后，若方差齊用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K法；若方差不齊用Welch分析，兩兩比較用Tambane’s T2。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1造模前LETO大鼠和OLETF大鼠體質(zhì)量、FPG、FINS水平比較表1結(jié)果顯示，造模前OLETF大鼠的體質(zhì)量，F(xiàn)PG、FINS水平均顯著高于LETO大鼠（P＜0.01）。

表1 造模前LETO大鼠和OLETF大鼠體質(zhì)量，F(xiàn)PG、FINS水平比較Table 1 Comparison of body mass，F(xiàn)PG，F(xiàn)INS in LETO rats and OLETF rats before modeling(-x±s)

2.2各組大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果表2結(jié)果顯示：在前4 d的定位航行實驗中，AD-OLETF組大鼠每日的逃避潛伏期較LETO組和OLETF組明顯延長（P＜0.01）；在第5天撤除平臺后，AD-OLETF組穿越原平臺象限時間占總時間百分比較LETO組和OLETF組顯著減少（P＜0.01）。

表2 各組大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果比較Table 2 Comparison of Morris water maze test results in various groups (-x±s)

2.3各組大鼠FPG、血漿FINS、C-P、腦脊液INS含量比較表3結(jié)果顯示：OLETF組和ADOLETF組大鼠的FPG、血漿FINS、C-P含量明顯高于LETO組（P＜0.01）。OLETF組和AD-OLETF組大鼠腦脊液INS含量明顯低于LETO組（P＜0.01），且AD-OLETF組腦脊液INS含量降低更明顯。

2.4各組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)比較實驗結(jié)束后，大鼠海馬組織HE染色，在高倍鏡（400×）下觀察大鼠海馬組織CA1區(qū)形態(tài)，結(jié)果見圖1。LETO組：海馬區(qū)神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)正常、清晰，排列整齊，細胞核呈圓或橢圓形，形狀規(guī)則，核仁清晰。OLETF組：與LETO組相比，海馬區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)目較少，排列基本整齊。AD-OLETF組：與LETO和OLETF組相比，海馬區(qū)神經(jīng)細胞損傷變形，數(shù)量較少，排列無序混亂，細胞體積增大，細胞核固縮、染色加重，且呈現(xiàn)不規(guī)則外形，核仁消失，部分神經(jīng)細胞呈現(xiàn)出月牙型、多齒形等其他形態(tài)。

2.5各組大鼠海馬、腦脊液中Aβ含量的比較表4結(jié)果顯示：OLETF組大鼠海馬、腦脊液中Aβ含量較LETO組均有所提升（P＜0.01）；AD-OLETF組大鼠海馬、腦脊液中Aβ含量較LETO組和OLETF組均明顯升高（均P＜0.01）。

表3 各組大鼠FPG、血漿FINS、C-P、腦脊液INS含量比較Table 3 Comparison of the contents of FPG，plasma FINS，C-P and cerebrospinal fluid INS in various groups(-x±s)

圖1 各組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of morphological features of the hippocampus in various groups（by HE staining，× 400）

表4 各組海馬、腦脊液中Aβ含量的比較Table 4 Comparison of the content of Aβ in the hippocampus and Cerebrospinal fluid in various groups[-x±s，ρ/（pg·mL-1）]

2.6各組大鼠海馬、腦脊液中Tau蛋白含量的比較表5結(jié)果顯示：AD-OLETF組大鼠海馬Tau蛋白含量明顯高于LETO組和OLETF組（均P＜0.01）；各組大鼠腦脊液Tau蛋白含量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 各組大鼠海馬、腦脊液Tau蛋白含量的比較Table 5 Comparison of the content of Tau protein in the hippocampus and Cerebrospinal fluid in various groups[-x±s，ρ/（ng·L-1）]

2.7各組大鼠海馬中APP、BACE1、PS1含量的比較表6結(jié)果顯示：AD-OLETF組大鼠海馬中APP、BACE1、PS1含量明顯高于LETO組和OLETF組（均P＜0.01）。

表6 各組大鼠海馬中APP、BACE1、PS1含量的比較Table 6 Comparison of the content of APP，BACE1，PS1 in the hippocampus in various groups (-x±s)

3 討論

阿爾茨海默?。ˋD）是一種神經(jīng)退行性疾病，與記憶和認知功能障礙有關(guān)。AD主要的病理特征包括由Aβ沉淀形成的神經(jīng)細胞間的大量老年斑（senile-plaques，SP）、由微管蛋白Tau過度磷酸化表達形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neuro fibrillary tangles，NFTs）以及神經(jīng)元的大量凋亡。有研究表明，與健康人群相比，2型糖尿病患者患AD的風險更高，其認知能力的下降幅度在20%～50%之間[8]。與血糖正常者比較，血糖受損者從輕度認知障礙（mild cognitive impairment，MCI）到AD的轉(zhuǎn)化率更高，提示胰島素抵抗在認知能力下降和AD進展中起著關(guān)鍵作用[9]。與糖尿病和AD進展相關(guān)的主要生物學(xué)機制尚未被闡釋清楚，胰島素信號受損、葡萄糖代謝失控、氧化應(yīng)激、蛋白加工異常以及炎癥通路的刺激是AD和2型糖尿病的共同特征。其中，胰島素抵抗是AD和2型糖尿病發(fā)病的常見誘因和主要危險因素。因此，AD也被認為是“3型糖尿病”[4]。此外，一些鼻內(nèi)注射胰島素治療AD的臨床試驗也說明了抗胰島素抵抗的方法在AD治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[10，11]。

本實驗的目的是設(shè)計一種專門應(yīng)用在抗胰島素抵抗治療AD的干預(yù)措施研究上的動物模型。OLETF大鼠是一種自發(fā)性胰島素抵抗模型大鼠，與同品系的正常大鼠LETO大鼠相比，OLETF大鼠存在的病理表現(xiàn)有顯著肥胖，雄鼠出生18周后隨著年齡的增長血糖值逐漸上升，25周時幾乎所有的雄鼠都表現(xiàn)出高血糖并伴有高胰島素血癥，還可能出現(xiàn)其他表現(xiàn)如糖尿病腎病、糖尿病性神經(jīng)癥、糖尿病性視網(wǎng)膜癥等[12]。本實驗使用的OLETF大鼠模型，在造模之前其體質(zhì)量、FPG、血漿FINS均明顯高于LETO大鼠，符合OLETF大鼠的病理特征。

在本研究中，我們嘗試在OLETF大鼠的基礎(chǔ)上，通過使用D-半乳糖和AlCl3制作新的AD復(fù)合動物模型。有文獻報道，在D-半乳糖和AlCl3的聯(lián)合干預(yù)下可以制作出AD動物模型，能夠引發(fā)動物記憶和學(xué)習(xí)能力障礙[13]。D-半乳糖是一種還原糖，很容易與肽和蛋白質(zhì)中氨基酸的游離胺發(fā)生反應(yīng)，長期低劑量服用D-半乳糖可誘導(dǎo)動物發(fā)生類似自然衰老過程的變化，包括認知功能障礙、氧化應(yīng)激、免疫應(yīng)答下降以及基因轉(zhuǎn)錄異常[14]。慢性全身接觸D-半乳糖引起的神經(jīng)毒性是研究AD機制和藥物篩選的常用模型之一[15]。鋁（Al）是許多日常用品的組成部分，如除臭劑、食品添加劑和藥物如抗酸劑等。Al很容易滲透到人體中，在進入大腦后，Al會顯著影響軸突應(yīng)答，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起突觸結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)退化[16]。人體在鋁元素的環(huán)境中過度暴露會導(dǎo)致神經(jīng)細胞中APP的過度表達和Aβ斑塊的沉積，Al的神經(jīng)毒性與AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)[17]。

在造模結(jié)束后觀察模型大鼠外形發(fā)現(xiàn)，模型AD-OLETF大鼠與正常LETO組相比，毛質(zhì)粗糙、灰暗、沒有光澤，質(zhì)地較硬，在行為上對外界的應(yīng)激性較低，反應(yīng)不敏感，并且活動相對較少，幾乎整日趴臥在籠中，缺乏活力。復(fù)合模型成功建立的標準是，在水迷宮實驗第5天的空間探索實驗中，與正常大鼠組比較，實驗組大鼠的穿越平臺象限時間占總時間的百分比明顯減少，說明記憶受損[18]。本研究結(jié)果顯示，在水迷宮前4 d的實驗中，AD-OLETF組大鼠每日的逃避潛伏期較LETO組和OLETF組延長（P＜0.01），表明ADOLETF組存在認知障礙。在第5天的空間探索實驗中，AD-OLETF組穿越平臺象限時間較LETO組和OLETF組縮短（P＜0.05或P＜0.01），提示模型大鼠的記憶力顯著弱于正常組和OLETF組，表明造模成功。之后的海馬切片觀察結(jié)果顯示，ADOLETF組大鼠的海馬神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)異常，并呈現(xiàn)出混亂、無序、不規(guī)則的趨勢，符合AD的特征。此外，Aβ與Tau蛋白含量顯著升高，是AD的主要病理表現(xiàn)之一；APP、BACE1、PS1等的升高可加劇腦內(nèi)Aβ沉積所形成的老年斑。這些指標的檢測結(jié)果說明復(fù)合模型大鼠除了胰島素抵抗之外，還具備AD的主要病理特征。

存在不足：本實驗用于造模的D-半乳糖和AlCl3溶液的劑量是根據(jù)眾多參考文獻和多次預(yù)實驗篩選后確定的，在正式實驗中未采用多組劑量對照的方式篩選最佳搭配，有可能存在其他劑量的組合搭配也能模擬出類似的AD病理特征，在今后的實驗中我們將繼續(xù)探索。

本研究結(jié)果證實，以胰島素抵抗模型大鼠為基礎(chǔ)，運用D-半乳糖和AlCl3聯(lián)合干預(yù)成功建立了一種多因素復(fù)合的AD大鼠模型。實驗結(jié)果表明該動物模型在行為學(xué)以及神經(jīng)病理學(xué)等方面能夠較好地模擬出AD的主要特征。該動物模型可為進一步探索和研究胰島素抵抗與AD的發(fā)病關(guān)系、發(fā)病機制以及相關(guān)治療藥物的篩選提供研究平臺，也為臨床上中藥及針灸治療AD提供了新的思路和方向。