疼痛應(yīng)答中背根神經(jīng)節(jié)可變剪接的鑒定與分析

鄧秀玲 王海生 葉紀(jì)誠 張建宇 孫計(jì)桃 苑紅

慢性疼痛是臨床上常見的神經(jīng)病理與主觀感受癥狀[1]，其形成和調(diào)控機(jī)制極具復(fù)雜性，目前各種治療效果都不理想，因此對(duì)于慢性疼痛的發(fā)病機(jī)制及藥物治療的研究仍然是人們關(guān)注的焦點(diǎn)和難點(diǎn)[2]。脊髓背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）作為聯(lián)系外周傳入纖維和脊髓的紐帶，其神經(jīng)元胞體能合成參與傳遞疼痛信息的各種神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)[3-4]，一直都是慢性疼痛發(fā)病機(jī)制及其治療的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用完全佛氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）誘導(dǎo)綿羊產(chǎn)生炎性疼痛，研究基于綿羊疼痛應(yīng)答過程中DRG 的RNA-seq 測(cè)序數(shù)據(jù)，通過Tophat 軟件分析鑒定炎性疼痛發(fā)生時(shí)DRG 內(nèi)可變剪接事件和差異剪接基因（DSG），通過GO 分析這些DSG 的功能，從而在轉(zhuǎn)錄水平揭示大型動(dòng)物對(duì)慢性疼痛應(yīng)答的分子機(jī)制，為深入研究疼痛產(chǎn)生機(jī)制提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取6 只綿羊，體重30 kg 左右，年齡2 歲齡，由內(nèi)蒙古生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室羊場(chǎng)提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組3 只。實(shí)驗(yàn)組采用足底掌部按50 uL/kg 皮下注射CFA，建立炎性疼痛模型；對(duì)照組不建立疼痛模型。對(duì)照組3 只綿羊依次命名為：c1、c2、c3；實(shí)驗(yàn)組3 只綿羊依次命名為：t1、t2、t3。屠宰后分別采集 6 只綿羊的背根神經(jīng)節(jié)組織立即保存于液氮中。

1.2 RNA 的提取和質(zhì)量檢測(cè)

采用TRIzol 法提取綿羊DRG 組織總RNA，利用BioRad 的分光光度計(jì)來判斷RNA 的純度，OD260/OD280 比值大于1.8，則說明制備的RNA 純度較好，無蛋白質(zhì)及小分子污染。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性。

1.3 RNA-seq 數(shù)據(jù)測(cè)序、比對(duì)與組裝

RNA-seq 測(cè)序由武漢生命之美科技有限公司完成，采用Illumina HiSeq 2000 進(jìn)行RNA 測(cè)序，將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)過濾，去除低質(zhì)量、污染序列和接頭后，得到clean reads，從數(shù)據(jù)庫中下載綿羊的參考基因組及相關(guān)注釋文件（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Ovis_aries/）然后采用Tophat 軟件將上述過濾得到的clean reads 與綿羊的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，再用Cufflinks 軟件對(duì)讀段進(jìn)行組裝和注釋。

1.4 可變剪接事件分析與鑒定

使用Tophat 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每個(gè)樣品存在的可變剪接位點(diǎn)及剪接方式進(jìn)行整體分析和歸類分析。根據(jù)P≤0.05，T ＞0 的為上調(diào)，T ＜0 的為下調(diào)，來尋找AS 差異表達(dá)的基因。使用DAVID 在線軟件對(duì)差異剪接基因進(jìn)行功能富集分析，采用P＜0.05作為顯著富集標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組綿羊一般情況

實(shí)驗(yàn)組綿羊經(jīng)CFA 誘導(dǎo)后，在注射部位觀察到局部出現(xiàn)紅、腫等炎性癥狀，并表現(xiàn)出踮腳、陂行及不能站立等功能異常，對(duì)照著組綿羊無炎性表現(xiàn)，行動(dòng)自如。

2.2 可變剪接方式位點(diǎn)分析

RNA-seq 原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控后，每個(gè)樣品均產(chǎn)生不低于5 GB的clean data，GC 含量平均為85.9%且Q30 ＞44.1%，測(cè)序數(shù)據(jù)滿足后續(xù)分析。通過Tophat 軟件將clean data 比對(duì)到綿羊參考基因組上，6 個(gè)樣品70%～84%的clean reads 能比對(duì)到綿羊的參考基因組上。將經(jīng)過Cufflinks 軟件組裝的轉(zhuǎn)錄本與綿羊參考基因組進(jìn)行比較，對(duì)照組鑒定出可變剪接事件為8 527 個(gè)，實(shí)驗(yàn)組鑒定出可變剪接事件為6 212 個(gè)，其中已注釋的可變剪接由1 321 下降為959 個(gè)，新的可變剪接數(shù)目由7 206 下降為5 253 個(gè)；可變剪接事件歸類分析顯示IR 事件為最多的可變剪接事件，約占29.3%，其次為A3SS、A5SS 和ES（見表1）。

2.3 可變剪接差異基因鑒定

各個(gè)樣本剔除重復(fù)后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，共得到360 條AS 差異表達(dá)基因，117 條上調(diào)，243 條下調(diào)，見表2。差異剪接基因中IR 事件的所占比最高，在上調(diào)基因中約占48.7%，下調(diào)基因中約占34.2%。結(jié)果顯示，發(fā)生AS 差異表達(dá)的基因更傾向于在疼痛應(yīng)答過程中，DRG 基因以gene model 的形式表達(dá)或者不發(fā)生可變剪接事件。

2.4 差異剪接基因的功能富集分析

對(duì)獲得的差異剪接基因進(jìn)行GO 富集分析，可變剪接最顯著的10 類GO 分析生物過程顯示，這些差異基因主要富集在電壓門控離子通道、鈉離子結(jié)合和鈉離子運(yùn)輸相關(guān)基因及鈣離子通道及離子運(yùn)輸相關(guān)基因、調(diào)控Ras-GTP 酶活性和Ras 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能上等過程中（圖1）。其中HCN，CLCN3，KCNC4，CACNA2D1，TRPC4，CACNA2D1，ACAP2，GIT2，TRIO 基 因 的可變剪接模式存在顯著差異。

表1 可變剪接事件類型及基因數(shù)（個(gè)）

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較AS 差異表達(dá)基因數(shù)（個(gè)）

圖1 差異表達(dá)基因最顯著的前10 類GO 分析過程

3 討論

可變剪接是真核基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和蛋白質(zhì)多樣性的重要機(jī)制，RNA-seq 可以準(zhǔn)確檢測(cè)基因的表達(dá)量，精確地識(shí)別基因序列變化，被廣泛應(yīng)用于鑒定和分析動(dòng)植物基因組中發(fā)生的可變剪接事件[5]?？勺兗艚拥氖д{(diào)會(huì)導(dǎo)致人類各種疾病的發(fā)生，如：癌癥、早衰癥、強(qiáng)直性營養(yǎng)不良等[6-7]，它已成為真核基因調(diào)控領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但目前關(guān)于可變剪接與疼痛發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)研究鮮為少見。因此，本研究通過RNA-seq 技術(shù)鑒定綿羊DRG 組織發(fā)生的可變剪接事件，對(duì)照組鑒定出可變剪接事件為8 527 個(gè)，實(shí)驗(yàn)組鑒定出可變剪接事件為6 212 個(gè)，暗示綿羊疼痛應(yīng)答傾向于減少可變剪接事件的發(fā)生，這可能是綿羊在可變剪接調(diào)控水平對(duì)疼痛應(yīng)答的機(jī)制之一。本研究中發(fā)現(xiàn)了大量的新可變剪接事件，其中IntronR 事件為最多的可變剪接事件，其次為A3SS、A5SS 和ES?？勺兗艚幽Ｊ酱嬖陲@著差異的基因主要富集在鉀、鈉、鈣離子通道、調(diào)控RasGTP酶活性和Ras 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能中。其中HCN，CLCN3，KCNC4，CACNA2D1，TRPC4，CACNA2D1，ACAP2，GIT2，TRIO 基因的可變剪接模式存在較為顯著的差異。RasGTPase 是重要的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在神經(jīng)軸突的生長、導(dǎo)向和分枝中發(fā)揮重要功能，而且與神經(jīng)性疼痛相關(guān)[8]，本研究發(fā)現(xiàn)該類基因的可變剪接在疼痛響應(yīng)中受可變剪接調(diào)控。近年來有學(xué)者[9-11]采用DNA 芯片和生物信息的方法，篩選外周神經(jīng)損傷后DGR神經(jīng)元基因表達(dá)變化，得到了大量的調(diào)控基因。Chengyu Yin[12]等采用RNA-seq 技術(shù)對(duì)疼痛綜合征小鼠DRG 內(nèi)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序，鑒定了295 個(gè)差異表達(dá)的基因，其中上調(diào)基因195 個(gè)，下調(diào)基因100 個(gè)。本研究發(fā)現(xiàn)，電壓門控離子通道相關(guān)基因發(fā)生可變剪接模式的差異表達(dá)，暗示綿羊中電壓門控離子通道相關(guān)基因可能通過可變剪接模式的改變來參與疼痛應(yīng)答，這將為炎性疼痛在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制研究提供新思路，本實(shí)驗(yàn)篩選出了可變剪接具有差異的基因，可為后續(xù)研究提供方向。