新型飼草串葉松香草SOD提取條件優(yōu)化及其抗氧化能力

郭云霞，高雙喜，周秀平，張志儒，郝慶紅，劉月琴，張英杰

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071000；3.懷安縣農(nóng)牧局，河北張家口076150）

串葉松香草（Silphium perfoliatumL.）別名松香草，因能夠連續(xù)收割10～12年 （娜日蘇，2006），且葉蛋白質(zhì)含量豐富，可作為一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的飼用植物加以利用，同時(shí)其還具有耐熱、抗寒、耐鹽堿、抗蟲能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)（王瑋等，2004）。據(jù)報(bào)道，串葉松香草富含超氧化物歧化酶（SOD），其SOD活力為112.60 U/mL，僅次于葡萄干和大蒜（劉文海等，2008）。眾多學(xué)者從串葉松香草的引種（劉生龍，1995）、應(yīng)用價(jià)值及栽培要點(diǎn)（徐善光等，2010）、營(yíng)養(yǎng)成分及價(jià)值分析（譚興和等，2003）、飼喂效果（趙明坤等，2001）及水提液體外抗氧化活性（張薇，2012）、不同生育期營(yíng)養(yǎng)成分變化及瘤胃降解動(dòng)態(tài)（聶芙蓉，2009）等方面進(jìn)行了研究。但是，目前對(duì)串葉松香草藥用價(jià)值的探索及不同時(shí)期的合理運(yùn)用仍不完善，且對(duì)其不同發(fā)育期類SOD活性及抗氧化能力的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)對(duì)大葉期和開(kāi)花期的串葉松香草進(jìn)行提取，并對(duì)其類SOD含量及抗氧化成分的測(cè)定，初步確定串葉松香草的適宜收獲期及為牧草資源的合理利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料 葉叢期和開(kāi)花期串葉松香草樣品，采集于保定地區(qū)中贏自然（北京）農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司串葉松香草種植基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SOD活性測(cè)定 將張薇（2012）方法進(jìn)行改進(jìn)測(cè)定串葉松香草中SOD活性，即鄰苯三酚在堿性條件下會(huì)發(fā)生自氧化，加入含有SOD活性的物質(zhì)抑制鄰苯三酚自氧化速率以確定其SOD活性。制備A液：pH 8.2，0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）-鹽酸緩沖溶液（含1 mol/L EDTA-Na2）；B液：4.5 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液。

鄰苯三酚自氧化速率（△A）的測(cè)定：25℃水浴中，于10 mL比色管中依次加入A液2.35 mL，蒸餾水2.00 mL，預(yù)熱20 min后，加入B液0.15 mL?；旌暇鶆蚝罅⒓礄z測(cè)，以A液調(diào)零，在325 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定初始和1 min后吸光值，兩者之差即為△A。

樣液抑制鄰苯三酚自氧化速率（△A′）的測(cè)定：按照上述方法，在加B液之前加入不同劑量的樣液，以確定最佳的1/2△A抑制率，最終確定樣液加入量為20.0μL，加入B液混合均勻后立即檢測(cè)，以A液調(diào)零，在325 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定初始和1 min后吸光值，兩者之差即為△A′。根據(jù)公式計(jì)算樣品酶活：

SOD活 力/（U/g）=（△A-△A′）/△A×100%/50%×V0×D/V×V1/m；

式中：△A為鄰苯三酚自氧化速率；△A′為樣液抑制鄰苯三酚自氧化的速率；V為加入樣液的體積，mL；V0為反應(yīng)液總體積，mL；V1為樣液總體積，mL；D為樣液的稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.2 串葉松香草水提液最適提取條件優(yōu)化

1.2.2.1 單因素試驗(yàn)分析 將新鮮的串葉松香草樣品置于恒溫干燥箱中，105℃15 min，65℃4 h干燥至恒重后，粉碎過(guò)40目篩，并密封放于陰涼干燥處備用。用雙蒸水為串葉松香草的提取溶劑，以SOD活性為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)分析。分別對(duì)提取時(shí)間、提取料液比、提取溫度進(jìn)行確定。

提取時(shí)間的確定：稱取串葉松香草粉1 g，加入10 mL雙蒸水混勻，密封置于室溫下分別于2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)對(duì)提取液進(jìn)行SOD活性測(cè)定，確定最佳提取時(shí)間。

料液比的確定：稱取串葉松香草粉1 g，加入10 mL雙蒸水混勻，密封。料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，以最佳提取時(shí)間，對(duì)提取液進(jìn)行SOD活性測(cè)定，確定適宜料液比。

提取溫度的確定：稱取串葉松香草粉1 g，以最佳料液比和最佳提取時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)，置于37、4℃和18℃進(jìn)行提取，對(duì)提取液進(jìn)行SOD活性測(cè)定，最終確定提取溫度。

1.2.2.2 提取條件正交試驗(yàn)優(yōu)化 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，選取提取時(shí)間、料液比、提取溫度為自變量，以SOD活性為測(cè)定值，設(shè)計(jì)三因素兩水平的正交分析試驗(yàn)（表1、表2）。

表1 大葉期提取條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L4（23）

表2 開(kāi)花期提取條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L4（23）

1.2.3 類SOD成分含量測(cè)定

1.2.3.1 串葉松香草中維生素C含量測(cè)定 用紫外分光光度法測(cè)定串葉松香草中維生素C（VC）的含量，即根據(jù)VC在稀酸溶液中，于245 nm波長(zhǎng)處有最大吸收的特性測(cè)定VC的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取經(jīng)110℃干燥至恒重的抗壞血酸0.010 g，加入10%HCl溶液2 mL后用蒸餾水定容至100 mL，混勻得到濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液。梯度量取上述標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL于6支10 mL具塞比色管中，用蒸餾水定容至刻度。以抗壞血酸空白調(diào)零，在245 nm處測(cè)定吸光值，并以標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

VC標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 公 式：y=0.0598x+0.0159，R2=0.9992。

樣液VC含量的測(cè)定：量取0.2 mL樣液于10 mL具塞比色管中，向其中加入0.4 mL 10%的HCl溶液，并用蒸餾水定容至刻度后搖勻。以蒸餾水調(diào)零，在245 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出VC的濃度。再根據(jù)如下公式計(jì)算出樣液中VC的含量。

式中：X為樣液中維生素C含量，mg/kg；C為樣液中抗壞血酸的濃度，μg/mL；10為樣液定容體積，mL；A為樣液稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3.2 串葉松香草中總黃酮含量測(cè)定 測(cè)定串葉松香草中總黃酮的含量，依據(jù)黃酮類化合物被NaNO2還原后能與Al3+絡(luò)合形成在堿性條件下顯紅色的絡(luò)合物，于510 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光值來(lái)計(jì)算總黃酮化合物的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取經(jīng)120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.100 g，用95%的乙醇定容至100 mL，量取15 mL于50 mL容量瓶中，用95%的乙醇定容，即得0.3 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，并用95%的乙醇稀釋至6 mL后，分別加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻后靜置6 min；再加10%Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻后靜置6 min；最后加入10 mL 4%NaOH溶液搖勻，靜置12 min。以蘆丁空白調(diào)零，在510 nm處測(cè)定吸光值，并以蘆丁標(biāo)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 公 式：y=9.5167x+0.0295，R2=0.9935。

樣液總黃酮含量的測(cè)定：量取4.0 mL樣液于25 mL容量瓶中，余下按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中的操作，測(cè)定其吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出總黃酮的濃度。再根據(jù)如下公式計(jì)算出樣液中總黃酮的含量。

式中：X為樣液中總黃酮含量，mg/kg；C為樣液中蘆丁的濃度，mg/mL；25為樣液定容體積，mL；A為樣品稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3.3 串葉松香草中總多酚含量測(cè)定 用福林酚比色法測(cè)定串葉松香草中總多酚的含量，即根據(jù)多酚類化合物在堿性溶液中可將鎢鉬酸還原成藍(lán)色化合物，于765 nm處有最大吸收的特性測(cè)定總多酚的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：制備濃度0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0 mg/L的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)液，各加5.0 mL水、1.0 mL福林酚試劑和3.0 mL碳酸鈉溶液，混勻后放置2 h顯色。以沒(méi)食子酸空白調(diào)零，在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣液總多酚含量的測(cè)定：量取0.1 mL樣液代替沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，余下按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中的操作，測(cè)定其吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出總多酚的濃度?？偠喾訕?biāo)準(zhǔn)曲線公式：y=0.1004x+0.056，R2=0.9999。再根據(jù)如下公式計(jì)算出樣液中總多酚的含量。

式中：X為樣液中總多酚含量，mg/kg；C為樣液中沒(méi)食子酸的濃度，mg/L；10為樣液定容體積，mL；A為樣品稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 抗氧化能力分析

1.2.4.1 清除羥自由基能力的測(cè)定 用水楊酸法測(cè)定串葉松香草水提液對(duì)羥自由基的清除能力，按表3所示，在具塞試管中依次加入以下各藥品后搖勻，并于37℃水浴中加熱15 min，于510 nm處測(cè)定其吸光值。A0測(cè)定時(shí)，以不加雙氧水的體系調(diào)零；Ax、Ax0測(cè)定時(shí)，以蒸餾水調(diào)零。

根據(jù)如下公式計(jì)算樣液清除羥自由基的速率：

羥自由基清除率/%=[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100；

式中：A0為空白對(duì)照的吸光值；Ax為加樣品的吸光值；AX0為試劑空白的吸光值。

1.2.4.2 清除1，1-二苯代苦味酞基（DPPH）能力的測(cè)定 用分光光度法測(cè)定串葉松香草水提液對(duì)DPPH的清除能力，即根據(jù)紫色的DPPH無(wú)水乙醇溶液在517 nm處有最大吸收，若向其中加入具有清除DPPH功能的樣液，就可結(jié)合或代替DPPH，使自由基數(shù)量減少，吸光值變小，以此評(píng)價(jià)樣液對(duì)DPPH的清除作用。

制備DPPH溶液：準(zhǔn)確稱取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品0.005 g，溶于適量無(wú)水乙醇中，并超聲5 min，使其充分溶解后，定容至100 mL。取適量DPPH溶液，在517 nm處測(cè)定其吸光度，使A=1.2～1.3為最佳。

表3 清除羥自由基試驗(yàn)方法mL

取DPPH溶液2 mL，向其中由少至多漸加樣液，邊加邊混合并觀察溶液的褪色情況，記下溶液顏色基本褪去時(shí)的加樣量，以確定樣液加入量。按表4所示，在具塞試管中依次加以下各藥品后搖勻，避光靜置30 min后，以無(wú)水乙醇調(diào)零，在517 nm處測(cè)定吸光值。

表4 清除DPPH試驗(yàn)方法mL

根據(jù)如下公式計(jì)算樣液清除DPPH的速率：

式中：A0為空白對(duì)照的吸光值；Ax為加樣品的吸光值；Ax0為試劑空白的吸光值。

1.2.4.3 清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定用鄰苯三酚法測(cè)定串葉松香草水提液對(duì)超氧陰離子的清除能力，即鄰苯三酚在堿性條件下自氧化可產(chǎn)生有色中間產(chǎn)物使吸光值增加，此過(guò)程中吸光度值與反應(yīng)時(shí)間呈線性關(guān)系。當(dāng)在該反應(yīng)體系中加入抗氧化物質(zhì)后，抗氧化物催化超氧陰離子反應(yīng)為過(guò)氧化氫，使有色中間產(chǎn)物生成受阻，鄰苯三酚自氧化的速率降低，吸光值下降，以此作為測(cè)定該抗氧化物清除超氧陰離子的依據(jù)。

制備A液：pH 8.2，0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）-鹽酸緩沖溶液（含1 mol/L EDTANa2）；B液：4.5 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液。按表5所示，在具塞試管中依次加入以下各藥品，以A液調(diào)零，在325 nm處測(cè)其吸光值。

根據(jù)如下公式計(jì)算樣液清除超氧陰離子的速率：

超氧陰離子清除率/%=[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100；

式中：A0為空白對(duì)照的吸光值；Ax為加樣品的吸光值；Ax0為試劑空白的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)分析 本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行整理得到均值與方差，并通過(guò)SPSS（17.0）軟件進(jìn)行顯著性分析，以最小顯著差異（LSD）的t檢驗(yàn)方法，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 串葉松香草水提液的提取條件優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1.1 提取時(shí)間確定 由圖1可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，不同生長(zhǎng)期串葉松香草的SOD活性逐漸上升，在12 h時(shí)提取效果最佳，葉叢期與開(kāi)花期分別為2129.48、2021.73 U/g。因此兩個(gè)不同的生長(zhǎng)期均選擇12 h的提取時(shí)間進(jìn)行提取。

2.1.1.2 料液比確定 由圖2可知，隨著料液比的減小，不同生長(zhǎng)期串葉松香草的SOD活性逐漸上升，在料液比為1∶20時(shí)，開(kāi)花期SOD活力較葉叢期高55.94%（P＜0.05）。在1∶25時(shí)兩個(gè)時(shí)期的提取效果均最佳，其中葉叢期比開(kāi)花期SOD活力顯著升高了10.83%（P＜0.05）。因此兩個(gè)不同的生長(zhǎng)期均可選擇1∶25的料液比進(jìn)行提取。

表5 清除超氧陰離子試驗(yàn)方法mL

圖1 串葉松香草各生長(zhǎng)期不同提取時(shí)間的SOD活力

圖2 串葉松香草各生長(zhǎng)期不同料液比SOD活力

2.1.1.3 提取溫度確定 由圖3可知，隨著提取溫度的提高，不同生長(zhǎng)期串葉松香草的SOD活性逐漸上升，在37℃時(shí)提取效果最佳，葉叢期與開(kāi)花期分別為3912.49、4367.09 U/g。因此兩個(gè)不同的生長(zhǎng)期均選擇37℃的提取溫度進(jìn)行提取。

2.2 提取條件正交試驗(yàn)優(yōu)化 由表6、表7可知，用正交試驗(yàn)法確定提取條件的最佳組合，各組比較發(fā)現(xiàn)葉叢期與開(kāi)花期均是料液比為1:25，37℃水浴中浸提12 h時(shí)SOD活性最高，分別為4030.12、4445.31 U/g。

2.3 串葉松香草類SOD活性 由表8可知，按最優(yōu)提取方案對(duì)串葉松香草的類SOD其他成分進(jìn)行分析得出，串葉松草開(kāi)花期維生素C、總黃酮和總多酚含量極顯著高于葉叢期，分別高了34.51%（P＜0.01）、56.59%（P＜0.01）和23.15%（P＜0.01）。

圖3 串葉松香草各生長(zhǎng)期不同提取溫度的SOD活力

表6 葉叢期提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 開(kāi)花期提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表8 串葉松香草類SOD活性成分含量比較mg/kg

2.4 串葉松香草提取液的抗氧化能力檢測(cè) 由表9可知，串葉松香草開(kāi)花期清除羥自由基和DPPH的能力極顯著高于葉叢期，分別增加了205.65%（P＜0.01）和12.20%（P＜0.01）；開(kāi)花期清除超氧陰離子的能力較葉叢期降低8.39%（P＜0.05）。

表9 不同生長(zhǎng)期串葉松香草對(duì)自由基的清除率%

3 討論

串葉松香草為多年生草本植物，其提取液具有抗糞腸球菌和大腸桿菌的功能（Kowalski，2007）。Shang等（2017）利用響應(yīng)面法對(duì)串葉松香草活性成分提取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，以水料比為15 mL/g，提取時(shí)間為61 min，提取溫度為97℃的工藝提取的多糖濃度最高，且冷凍干燥所保留的抗氧化活性物質(zhì)濃度最高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，1∶25料液比，37℃，提取12 h時(shí)得到串葉松香草水提液，葉叢期SOD活力為4030.12 U/g，開(kāi)花期為4445.31 U/g。有機(jī)體生理代謝過(guò)程中細(xì)胞均會(huì)產(chǎn)生活性氧（ROS），在正常代謝下，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，只有當(dāng)ROS的產(chǎn)生與清除失去平衡時(shí)，才會(huì)引起氧化脅迫，多余的ROS會(huì)導(dǎo)致生物大分子、生物膜發(fā)生可逆或不可逆損傷，甚至引起細(xì)胞死亡。在活性氧清除反應(yīng)中首先啟動(dòng)的抗氧化酶是SOD，通過(guò)歧化超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為氧分子和過(guò)氧化氫（H2O2），然后經(jīng)過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)，將H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)樗头肿友酰╕ergaliyev等，2016），解除氧脅迫，保證機(jī)體健康。開(kāi)花期SOD活力顯著增加，表明串葉松香草在開(kāi)花期的抗氧化能力強(qiáng)于葉叢期，且開(kāi)花期類SOD活性成分VC、總黃酮和總多酚的含量分別比大葉期極顯著增加了34.51%、56.59%和23.15%。本研究發(fā)現(xiàn)開(kāi)花期比葉叢期總黃酮的含量極顯著升高。黃酮類化合物可通過(guò)與金屬離子螯合阻斷自由基生成或與脂質(zhì)過(guò)氧基（ROO·）反應(yīng)，阻斷脂質(zhì)的過(guò)氧化過(guò)程或阻斷自由基所引發(fā)的連鎖反應(yīng)，達(dá)到清除氧自由基和抗氧化的效果。據(jù)報(bào)道，VC清除DPPH的能力強(qiáng)于黃酮和蘆丁，同時(shí)VC與黃酮復(fù)配抗氧化能力強(qiáng)于各自單獨(dú)的功能（劉軍軍，2014）。

DPPH是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，當(dāng)羥自由基的有效濃度降低時(shí)，表明該物質(zhì)能將其清除。一般情況下，植物開(kāi)花期的抗氧化酶活性要高于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，對(duì)于多年生植物，在適應(yīng)了生存環(huán)境后，在生長(zhǎng)旺盛階段，體內(nèi)的抗氧化酶對(duì)于環(huán)境的脅迫反應(yīng)更敏感，更能快速的清除多余的氧自由基。Almeselmani等（2006）證實(shí)，在高溫脅迫試驗(yàn)中，小麥的抗氧化酶活性均為開(kāi)花期明顯高于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段。本試驗(yàn)結(jié)果表明，開(kāi)花期比葉叢期串葉松香草提取液清除羥自由基和DPPH的能力極顯著增加了205.65%和12.20%。超氧陰離子是體內(nèi)重要的自由基之一，同時(shí)也是所有活性氧自由基的前體，是導(dǎo)致自由基連鎖反應(yīng)的啟動(dòng)者，其可經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化生成H2O2、羥自由基（·OH）和單線態(tài)氧（1O2），作為生理環(huán)境中的毒性因子，引發(fā)一系列疾病。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在開(kāi)花期超氧陰離子極顯著低于葉叢期。綜上表明，開(kāi)花期比葉叢期具有更強(qiáng)的抗氧化能力。

4 結(jié)論

4.1 通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，確定葉叢期與開(kāi)花期串葉松香草SOD提取條件為：料液比1∶25，溫度37℃，浸提時(shí)間12 h，此時(shí)提取液SOD活性分別為4030.12、4445.31 U/g。

4.2 串葉松香草水提液，開(kāi)花期類SOD成分VC、總黃酮和總多酚含量較叢葉期分別極顯著增加34.51%、56.59%和23.15%，同時(shí)清除羥自由基和DPPH的能力分別極顯著增加205.65%和12.20%。