粉色、黑色花生種皮色素的抗氧化活性及組分差異分析

林 茂,黃道梅,鄭秀艷,宋光艷,李國林,孟繁博,陳 曦

(貴州省農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所,貴州省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,貴州貴陽 550006)

花生是油食兼用的農(nóng)產(chǎn)品,也是很多食品加工原料,其種皮是花生榨油和休閑制品等加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物,約占花生種仁重量的2.6%,全世界每年約有75萬噸花生紅衣產(chǎn)生[1],我國花生加工過程中每年約有600噸花生種皮產(chǎn)生,這些花生種皮少部分被用來制藥,大部分均被當作飼料飼用,造成資源極大浪費[2]?；ㄉN皮色素的組成復(fù)雜,其中的主要功能成分是黃酮類化合物、原花色素和白藜蘆醇[3-6],具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、降低低密度脂蛋白等功能[7-9]。此外,花生種皮色素也是食品行業(yè)著色劑、抗氧化劑的良好配方之一[10-11]。

花生種皮顏色因品種不同而呈現(xiàn)粉色、紅色、紫黑等。普通市售花生種皮多為粉紅色,而“四粒紅”花生的種皮為紅色,“黔花生七號”則為紫黑色,在花生種皮色素方便研究報道表明,紅皮花生種皮色素中含有白藜蘆醇、(+)-兒茶素等組分具有一定抗氧化能力[12];黑皮花生種皮色素具有清除羥自由基、超氧陰離子以及DPPH自由基等能力[13],Tsujita等[14]研究認為,花生種皮色素主要成分是由兒茶素、表兒茶素等構(gòu)成的低聚原花色素組成。杜蕾等[15-16]對黑花生種皮色素進行了鑒定,認為黑花生種皮色素中的主要組分是原花生色素二聚體和三聚體物質(zhì);其它有關(guān)花生種皮色素的研究表明,黑花生種皮色素中還有矢車菊素一槐二糖苷和矢車菊素一接骨木二糖苷。由此可見,紅色和黑色花生種皮色素之間的組分差異很大。對比分析粉色和黑花生種皮色素方面的報道在以往研究中比較少。本研究選用粉色和黑色花生種皮為研究對象,探究其總抗氧化能力、抑制羥自由基和超氧陰離子能力的差異研究,再通過超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-Q-TOF-MS)對兩種花生種皮色素的組分進行鑒定,深入了解它們之間的抗氧化活性及組分差異,旨在為不同顏色花生種皮色素的利用和產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粉色種皮花生(銅仁珍珠花生)、黑色種皮花生(黔花生七號) 貴州省農(nóng)作物品種資源研究所提供;抑制超氧陰離子試劑盒、總抗氧化試劑盒、抑制羥自由基試劑盒 南京建成生物工程研究所;乙醇 國藥集團化學試劑有限公司;大孔樹脂 西安藍曉科技有限公司。

6430液相色譜儀 美國Agilent 公司;maXis II高分辨飛行時間質(zhì)譜儀 德國Bruker公司;RRHD SB-C18色譜柱 美國Agilent 公司;FA2004分析天平 上海精密科學儀器有限公司;ModulyoD真空冷凍干燥器 Thermo Fisher公司;RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ⅲ循環(huán)水多用真空泵 上海亞榮生化儀器廠;TYS-100粉碎機 浙江省永康市紅太陽機電公司;UV-2600紫外可見分光光度計 上海科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生色素的制備 首先將花生經(jīng)50 ℃烘干至種皮與種仁能分離,再經(jīng)人工剝離后去除種仁、保留種皮粉碎備用;稱取10 g粉碎種皮樣品分別加入石油醚30 mL提取3次,去除樣品中的脂肪,風干樣品;參照林茂等[17]不同顏色花生種皮色素提取方法,分別提取粉色和黑色花生種皮色素,合并多次提取液后過濾,40 ℃減壓濃縮。參照韓升廷[12]方法進行,首先將濃縮液加入無水乙醇攪拌后離心,除去多糖和蛋白質(zhì)等大分子,再通過大孔樹脂AB-8靜態(tài)吸附,用乙醇-水體系為洗脫液進行洗脫,收集洗脫液減壓濃縮后,真空干燥,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 花生種皮色素組分鑒定 根據(jù)歐陽新平等[18]方法,采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-Q-TOF-MS)進行分析,根據(jù)一級質(zhì)譜圖確定色素的特征準分子離子[M+H]+,再以準分子離子為母離子進行再次掃描,獲得碎片離子的二級質(zhì)譜圖,即失去一個基團后的碎片離子[M+H-X]+,通過質(zhì)譜信息獲得化合物的準分子量及構(gòu)成。

色譜條件:采用RRHD SB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,1.8 μm),流速為0.3 mL/min,進樣體積為2 μL,流動相A為0.1%甲醇-水,流動相B為乙腈;洗脫程序:0(A:95%,B:5%)～15 min(A:5%,B:95%),柱溫40 ℃;檢測波長為340 nm。

質(zhì)譜條件:電噴射離子源,正離子模式,噴射電壓450 V,噴射壓力150 kPa,干燥氣流速6.0 L/min,干燥氣溫度180 ℃,掃描質(zhì)荷比范圍m/z 100～1200。

1.2.3 花生種皮色素的抗氧化活性測定

1.2.3.1 總抗氧化能力(T-AOC)測定 分別取0.1 g的樣品,按照南京建成生物工程研究所T-AOC試劑盒說明書測定1.2.1制備樣品的總抗氧化能力。定義在37 ℃時,每分鐘每毫升樣品液使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值增加 0.01 為1個T-AOC 單位(u),即表示為u·mL-1。每組測定重復(fù)3次,取平均值。

超氧陰離子抑制率(%)=[(A0-A1)/A0]×100

1.2.3.3 羥自由基(·OH)抑制能力測定 配制濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml的粉色、黑色花生種皮色素樣品,按照南京建成生物工程研究所羥自由基試劑盒說明書測定出樣品的吸光值A(chǔ)1和空白樣品(蒸餾水)吸光值A(chǔ)0,計算不同樣品的羥自由基抑制率,根據(jù)半抑制濃度(IC50)的大小判斷色素清除羥自由基的能力大小[18]。

羥自由基抑制率(%)=[(A0-A1)/A0]×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以均值±標準誤差表示。應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件,對數(shù)據(jù)進行方差分析,用Orign8.1軟件畫圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 粉色、黑色花生的種皮色素組分鑒定

2.1.1 粉色、黑色花生種皮色素質(zhì)譜分析 通過超高效液相色譜飛行時間質(zhì)譜對粉色和黑色花生種皮色素溶液進行全掃描,正離子模式下的離子流圖如圖1所示,出峰集中在前4 min,并且2種色素的出峰時間具有一定差異,可以初步判斷其組分會存在異同;通過對一級質(zhì)譜圖和二級級質(zhì)譜中的準分子離子和離子碎片進一步綜合分析,結(jié)合質(zhì)譜信息可獲得化合物的準確相對分子質(zhì)量及組成結(jié)構(gòu),可推測出其組成。

圖1 粉色、黑色花生種皮色素的離子流圖(正離子)Fig.1 Ion flow diagram of pigments from pink and black peanut seed skin(positive ion)

2.1.2 粉色花生種皮色素組分鑒定 粉色花生種皮色素中的6種組分見表1,其中包括1種(表)兒茶素、2種原花色素二聚體、1種原花色素三聚體和2種原花色素四聚體。(保留時間為1.82 min,準分子離子m/z[M+H]+291,通過逆狄爾斯-阿德爾(RDA)反應(yīng)失去一個C8H8O3,產(chǎn)生碎片離子m/z 139[M+H-152]+;再失去一個間苯三酚和乙烯酮產(chǎn)生碎片離子m/z 165[M+H-126]+和m/z 123[M+H-126-42]+,具有兒茶素類化合物裂解時產(chǎn)生的特征子離子m/z 165[19],故推測為(表)兒茶素,分子量為290,分子式為C15H14O6。保留時間1.67、2.54 min,準分子離子m/z 為579[M+H]+,發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾(RDA)反應(yīng),先失去一個間苯三酚(C8H8O3),得到碎片離子m/z 427[M+H-152]+,再失去一個水分子,產(chǎn)生碎片離子m/z 409[M+H-152-18]+,失去一個C6H4O2(間苯二酚),產(chǎn)生碎片離子m/z 301[M+H-152-18-108]+,這種裂解方式為2個(表)兒茶素單元構(gòu)成的二聚體,推斷該化合物為B型原花色素二聚體,其分子量為578,分子式為C30H26O12。保留時間2.69、3.10 min 時的 準分子離子 m/z 577,與m/z 579 發(fā)生的裂解方式一致,只是該組分少了2個H,故推斷為A型原花色素二聚體。保留時間2.03、2.18、2.30 和 2.63 min,準分子離子m/z 865[M+H]+,發(fā)生RDA裂解,失去脫氫(表)兒茶素,產(chǎn)生碎片離子m/z 713[M+H-152]+、m/z 425[M+H-152-288]+、m/z 577[M+H-288]+和m/z 287[M+H-578]+,故推測為A型原花色素三聚體,其分子量為864,分子式為 C36H36O18。保留時間1.93 min,其準分子離子m/z 1153[M+H]+,同樣發(fā)生了發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾(RDA)反應(yīng),失去一個C8H8O3,產(chǎn)生碎片離子m/z 1001[M+H-152]+;再失去一個C15H12O6(脫氫(表)兒茶素),產(chǎn)生碎片離子m/z 865[M+H-288]+,繼續(xù)發(fā)生RDA反應(yīng),產(chǎn)生碎片離子575[M+H-288-290]+和287[M+H-866]+,由此可推斷該組分是由4個脫氣(表)兒茶素聚合構(gòu)成的單元,故為B型原花色素四聚體,其分子量為1152,分子式為C60H48O24;而保留時間2.4、2.85和3.07 min 時,準分子離子m/z 1151,與B原花色素四聚體發(fā)生了同樣的裂解,只是少了2個H,故推斷為A型原花色素三聚體,其分子量為1150,分子式為C60H46O24。

表1 粉色花生種皮色素組分的種類Table 1 Composition of pigment components in pink peanut seed skin

粉色花生種皮色素中主要有(表)兒茶素和原花色素二聚體、三聚體、四聚體,其同分異構(gòu)體之間相差2個H,該結(jié)果與杜蕾等[15]分析紅色組分結(jié)果一致,只是在鑒定過程中所獲得的碎片離子信息略有差異,這些多聚體與其它農(nóng)作物種皮中的原花色素多聚體也具有一些相同的組分;鄧菊等[20]從蠶豆皮中鑒定出3種(m/z 577、m/z 593和m/z 609)原花色素二聚體同分異構(gòu)體和3種(m/z 865、m/z 881和m/z 897)原花色素三聚體,所獲得的二聚體與本研究的 m/z 579 是不一樣的,但是所獲得的三聚體 m/z 865的結(jié)果是一致的,徐歆等[21]從紫鵑茶鑒定出多種原花色素多聚體和同分異構(gòu)體。由此可見,花生種皮色素中的原花色素多聚體也應(yīng)該有多種同分異構(gòu)體,需要進一步研究明確。

2.1.3 黑色花生種皮色素組分鑒定 黑色花生種皮色素中的9種組分見表2,其中包括3種原花色素多聚體,,保留時間為2.04、2.18 和2.64 min可推斷為A型原花色素三聚體,分子量為864,分子式為 C36H36O18;保留時間2.70和3.09 min時的峰推斷為A型原花色素二聚體,比原花色素B型少2個H,其分子量為576,分子式為C30H24O12;保留時間2.85 min的峰推斷為A型原花色素四聚體,這3種原花色素多聚體的裂解方式同粉色花生種皮色素中對應(yīng)的多聚體。從圖2可見花青素的結(jié)構(gòu),通常裂解過程中會失去葡萄糖,會產(chǎn)生m/z162碎片;因此,可根據(jù)碎片離子信息來進行推斷。保留時間1.69 min,準分子離子m/z 611,失去2分子葡萄糖(162×2)得到碎片離子m/z 287[M+H-324]+,據(jù)報道[22-23]碎片離子m/z 287為矢車菊素,故推斷該組分為矢車菊-3,5-二葡萄糖苷,其分子量為610,分子式為 C27H30O16;保留時間1.84 min,準分子離子m/z 581[M+H]+,失去一分子葡萄糖(162)和一分子芹糖(132)得到碎片離子m/z 287[M+H-294]+,根據(jù)質(zhì)譜信息確認碎片離子m/z 287為矢車菊素糖芹苷,故推測該組分為矢車菊素-葡萄糖-芹糖苷,其分子量為580,分子式為C26H28O15。表2中保留時間2.37 min,準分子離子m/z 773[M+H]+,失去一分子葡萄糖產(chǎn)生碎片離子m/z 611[M+H-162]+,再失去一分子鼠李糖,產(chǎn)生碎片離子465[M+H-162-146]+,通過進一步分析碎片離子303[M+H-162-146-162]+三級質(zhì)譜信息,確認m/z 303的為飛燕草素,推測該化合物為飛燕草素-葡萄糖-蕓香苷,其分子量為772,分子式為 C33H40O21;保留時間2.46 min,準分子離子m/z 641[M+H]+,失去一個葡萄糖和葡萄糖醛酸產(chǎn)生碎片離子m/z 479[M+H-162]+m/z 303[M+H-162-176]+,故推斷該組分為飛燕草素--葡萄糖-葡萄糖醛酸苷,其分子量為640,分子式為 C27H28O18;保留時間2.50 min,其準分子離子m/z 627[M+H]+,失去2分子葡萄糖,產(chǎn)生碎片離子m/z 465[M+H-162]+和m/z 303[M+H-162-162]+,所以推測該化合物為飛燕草素-3,5-葡萄糖苷,其分子量為626,分子式為 C27H30O17;保留時間t=3.06 min,其準分子離子m/z 479[M+H]+,失去一分子葡萄糖醛酸,產(chǎn)生碎片離子303[M+H-176]+,故推測該化合物為飛燕草素-葡萄糖-醛酸苷,其分子量為478,分子式為 C21H18O13。

圖2 花青素結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structural formula of anthocyanins

表2 黑色花生種皮色素組分的種類Table 2 Composition of pigment components in black peanut seed skin

黑色花生種皮色素中的組分與粉色花生種皮色素具有明顯差異,黑色花生種皮色素中除了含有原花色素二聚體、三聚體四聚體外,還含有矢車菊素和飛燕草素類組分,研究報道[24-25]表明,化合物裂解過程中產(chǎn)生離子碎片m/z 303通常為飛燕草的特征離子碎片,m/z 287為矢車菊素特征離子碎片,m/z 287為葡萄糖的特征離子碎片。

2.2 不同種皮顏色花生種皮色素的抗氧化活性比較

2.2.1 總抗氧化能力 粉色和黑色花生種皮色素的總抗氧化能力見圖3,粉色花生種皮色素的抗氧化能力為(17.46±1.88) U·mL-1,黑色花生種皮色素的總抗氧化能力為(23.77±1.58) U·mL-1,黑色花生種皮色素的總抗氧化能力是粉色花生種皮色素的1.36倍。張孟智等[26]研究表明,粉色花生、黑色皮的總抗氧化能力分別為5.69和25.76 U·mL-1,不同類型的花生,其總抗氧化能力具有明顯差異。從組分鑒定和總抗氧化測定結(jié)果來看,粉色花生中主要是(表)兒茶素和原花色素多聚體;而黑色花生中除了原花色素多聚體外,還含有飛燕草素和矢車菊素類組分,這可能跟多種組分并存且發(fā)生協(xié)同效應(yīng)有關(guān)聯(lián)。

圖3 花生種皮色素總抗氧化能力Fig.3 Comparison of total antioxidant activity of pigments from peanut seed coat

2.2.2 粉色、黑色花生種皮色素抑制羥自由基的能力 由圖4可見,隨著色素濃度的增加,2種色素對羥自由基的抑制能力上升趨勢明顯,色素濃度為0.2 mg/mL時,黑色花生種皮色素的抑制率為24.70%、粉色花生種皮色素的抑制率為23.13%,這時黑色花生種皮色素對羥自由基的抑制率略高于粉色花生;但隨著色素濃度增加至1.0 mg/mL時,黑色花生和粉色花生種皮色素對羥自由基的抑制率分別提高至73.08%和79.01%,粉色花生種皮色素高于黑色花生種皮色素。根據(jù)統(tǒng)計學分析計算出黑色花生種皮色素的IC50為0.58 mg/mL,粉色花生種皮色素的IC50為0.39 mg/mL,由此可見,粉色花生種皮色素抑制羥自由基的能力強于黑色花生種皮色素,肖春玲等[27]研究表明,不同顏色花生種皮色素的IC50具有一定差異,其中粉色花生種皮對羥自由基的抑制能力強于黑色花生種皮,與本研究的結(jié)果一致。

圖4 花生種皮色素的羥自由基抑制率比較Fig.4 Comparison of ·OH free radical inhibition rate of pigments from peanut seed coat

2.2.3 粉色、黑色花生種皮色素抑制超氧陰離子能力 從圖5可見,隨著色素濃度的增加,2種色素對超氧陰離子的抑制能力逐漸上升,粉色花生種皮色素的抑制率明顯高于黑色花生種皮色素,當色素濃度為0.5 mg/mL時,黑色花生種皮色素的抑制率為29.94%、粉色花生種皮色素的抑制率為38.76%,色素濃度增加至2.5 mg/mL時,黑色花生和粉色花生種皮色素對羥自由基的抑制率分別提高至50.78%和56.59%。黑色花生種皮色素的IC50為1.79 mg/mL,粉色花生種皮色素的IC50為1.41 mg/mL,由此可見,粉色花生種皮色素抑制超氧陰離子的能力強于黑色花生種皮色素。

圖5 花生種皮色素超氧陽離子抑制率比較Fig.5 Comparison of superoxide anions resistance ability of pigments from peanut seed coat

3 結(jié)論

粉色花生種皮色素中主要包括(表)兒茶素、A型和B型原花色素二聚體、A型原花色素三聚體、A型和B型原花色素三聚體;黑色花生種皮色素中除了A型原花色素二聚體、三聚體和四聚體以外,還有矢車菊-3,5-二葡萄糖苷、矢車菊素-葡萄糖-芹糖苷、飛燕草素-葡萄糖-蕓香糖苷、飛燕草素-葡萄糖-葡萄糖醛酸、飛燕草素-3,5-葡萄糖苷和飛燕草素-葡萄糖-醛酸苷。2種花生種皮色素的組分具有明顯差異,其總抗氧化、抑制超氧陰離子和羥自由基的能力也差異,黑色花生種皮色素的總抗氧化能力強于粉色花生種皮色素;而粉色花生種皮色素抑制超氧陰離子和羥自由基的能力強于黑色花生種皮色素,這種差異應(yīng)該跟多種組分協(xié)同作用具有關(guān)聯(lián),需要進一步深入研究。