急性髓系白血病患者外周血外泌體中miR-4286 表達水平檢測及其診斷價值

全海薇, 張亞麗, 王 涵, 艾一玖, 鄒雨彤, 夏 薇

（1.北華大學醫(yī)學技術學院血液檢驗教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學附屬醫(yī)院血液科，吉林 吉林 132011）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種造血系統(tǒng)惡性腫瘤，好發(fā)于成人，具有高復發(fā)率和高死亡率等特征［1］。外泌體是細胞膜衍生的囊泡，攜帶信使RNA（mRNA）、蛋白質(zhì)和微小RNA（microRNAs，miRNAs）等大量信號分子，廣泛分布于血清、尿液和唾液等體液中，參與細胞間相互作用，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關聯(lián)［2-3］。研 究［4-5］表 明：白 血 病 細 胞 分 泌 的 外 泌 體可通過介導細胞間信號傳遞抑制造血、重塑骨髓造血微環(huán)境、誘導免疫耐受進而提高抗藥性，與AML 的發(fā)生發(fā)展關系密切。miRNAs 是一類長度約為22 nt 的單鏈非編碼RNA，多種外泌體miRNAs 已成為疾病的診斷指標。骨髓間充質(zhì)干細胞 （bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）和AML 細 胞 分 泌 的 外 泌 體miRNAs 在AML 細胞增殖、凋亡和分化的全過程均發(fā)揮重要作 用［6-8］。研 究［9］表 明：BMSCs 源 性 外 泌 體miR-425-5p 靶向Wilms 腫瘤蛋白1 相關蛋白（Wilms’tumor protein 1-associating protein，WTAP）抑制AML 細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移。BMSCs 源性外泌體microRNA-7-5p 靶向氧化固醇結(jié)合樣蛋白11 （oxysterol binding protein-like 11，OSBPL11）延 緩AML 病 程［10］；人 間 充 質(zhì) 干細胞源外泌體miR-23b-5p 靶向三結(jié)構域蛋白14（tripartite motif containing 14，TRIM14）抑 制AML 細 胞 的 生 長［11］；AML 細 胞 源 性 外 泌 體miR-548ac 靶向TRIM28/STAT3 通路參與造血功能 調(diào) 節(jié)［12］。外 泌 體 內(nèi)miRNAs 參 與AML 臨 床 診治：外周血外泌體中miR-532、miR-10b和miR-125b表達水平可作為AML 預后不良的診斷指標［13-15］；小鼠外周血外泌體miR-150、miR-155 和miR-1246的聯(lián)合檢測可作為小鼠AML 的診斷指標［16］。二代測序技術的推廣和應用為AML 診療拓寬思路。分析GEO 數(shù)據(jù)庫基因表達芯片（GSE64029）［17］結(jié)果顯示：與CD34+的骨髓基質(zhì)細胞正常分泌的外泌體比較，原代AML 細胞分泌的外泌體中miR-4286表達水平明顯升高。本研究結(jié)合生物信息學篩選差異表達基因，觀察AML 患者和健康對照人群外周血外泌體miR-4286 表達水平，評估外泌體miR-4286 對AML 的診斷效能，為臨床診斷AML 提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2020 年2 月—2021 年9 月于北華大學附屬醫(yī)院就診的45 例AML 初診患者（AML 組）外周血標本，其 中 男 性23 例，女性22 例，平均年齡（43.4±14.04）歲。AML 患者診斷標準依據(jù)《世界衛(wèi)生組織AML 診斷和分類標準2016》［18］。納入標準：符合診斷標準的初診AML 患者；無重要臟器功能損害。排除標準：伴非AML 惡性腫瘤。初診AML 患者FAB 分型：急性髓細胞白血病微分化型（M0）4 例（8.889%），急 性 粒 細 胞 白 血 病 未 成 熟 型 （M1）4 例（8.889%），急性粒細胞白血病部分成熟型（M2）13 例（28.889%），急性早幼粒細胞白血?。∕3）8 例（17.778%），急性粒單核細胞白血?。∕4）6 例（13.333%），急性單核細胞白血?。∕5）10 例（22.222%）。另隨機收集35 名同期健康體檢者外周血標本作為對照組，其中男性16 名，女性19 名，平均年齡（33.71±9.52）歲。受試者均已簽署知情同意書，并同意參加本研究。本研究獲北華大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準［（2020）年第（04）號］。

1.2 主要試劑和儀器抗CD63 抗體、抗CD9 抗體和羊抗鼠單克隆二抗（英國Abcam 公司），Trizol 試劑、miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green?Premix Ex Taq? Ⅱ試劑盒（日本TaKaRa 公司），實 時 熒 光 定 量 PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）引物［生工生物工程（上海）有限公司］。超速離心機（型號：Sorvall WX 100+，美國Thermo 公司），RT-qPCR儀（型號：5100，美國Thermo 公司），透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）（型號：HT7700，日本Hitachi 公司），納米粒度分析儀（型號：Nanotrac wave Ⅱ，美國Microtrac 公司），垂直板電泳系統(tǒng)（型號：PowerPac，美國Bio-Rad 公司）。

1.3 臨床標本采集處理用含促凝劑的真空采血管采集受試者靜脈血10 mL，4 ℃、3 000 r·min－1離心10 min，分離血清。4 ℃、12 000 g 離心10 min，上清分裝至1.5 mL EP 管中，－80 ℃保存。

1.4 外泌體提取將－80 ℃儲存的血清置于冰上融化，采用超速離心法［19］提取外泌體。過程如下：血清4 ℃、2 000 g 離心30 min；上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，4 ℃、12 000 g 離心45 min；上清轉(zhuǎn)移至超離管，4 ℃、110 000 g 離心2 h。收集沉淀，1 mL無菌PBS 緩沖液重懸。使用0.22 μm 的無菌過濾膜過濾較大囊泡，濾液4 ℃、110 000 g 離心70 min。收集沉淀，200 μL 無菌PBS 緩沖液重懸，－80 ℃保存。

1.5 外泌體鑒定采用TEM 觀察外泌體形態(tài)：外泌體樣品滴加到銅網(wǎng)中心，3%磷鎢酸負染色后烘干，于TEM 下觀察外泌體顆粒形態(tài)并拍照。采用納米顆粒示蹤分析 （nanoparticle tracking analysis，NTA）法檢測外泌體粒徑：200 μL 外泌體稀釋（1∶100）樣本混勻后加入樣本分析室，設置反應條件（90 s、3 次），分析外泌體粒徑。Western blotting 法檢測外泌體標志蛋白（CD63 和CD9 蛋白）表達情況：使用RIPA 裂解液提取外泌體內(nèi)總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度；通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。使用5%脫脂奶粉封閉液于室溫搖床封閉2 h。加入一抗兔抗人CD9抗體（1∶1 000）和CD63抗體（1∶1 000），4 ℃冰箱孵育過夜。TBS-T 洗脫3 次后加入二抗稀釋液于室溫搖床1 h，再 用TBS-T 洗 脫3 次。按說明書配制發(fā)光底物，加入發(fā)光液，顯影并拍照。

1.6 RT-qPCR 法檢測外泌體中miR-4286 表達水平外泌體溶液冰上溶解，采用TRIzol 試劑法提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。按照RT-qPCR 試劑盒說明書配制反應體系。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火及延伸1 min，40 個循環(huán)。miR-4286 正向引 物 序 列：5′-CGTACCCCACTCCTGGTACC-3′。通用引物和U6 引物均為試劑盒自帶。以U6 為內(nèi) 參 基 因，采 用2－ΔΔCt法 計 算miR-4286 表 達 水 平。以2－ΔΔCt值大于3.182 為表達陽性，每個樣品設置3 個復孔。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件和GraphPad Prism version 8.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。AML 組和對照組外周血外泌體中miR-4286 表達水平均呈非正態(tài)分布，以中位數(shù)（四分位間距）［M（Q）］表示，組間比較采用非參數(shù)曼-惠特尼U檢驗。繪制ROC 曲線計算外泌體miR-4286 診斷AML 的靈敏度和特異度及AUC，評價miR-4286對AML 的診斷效能。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清外泌體鑒定TEM 觀察，分離的外周血外泌體是一種具有脂質(zhì)雙層膜的囊狀顆粒，呈一側(cè)凹陷半球形，具有典型的外泌體結(jié)構，直徑為30～100 nm。見圖1。NTA 法檢測外泌體粒徑，結(jié)果顯示：粒徑呈單峰正態(tài)分布曲線，主要分布在30～150 nm，顆粒分散均一。見圖2。Western blotting法檢測結(jié)果顯示：AML 組和對照組受試者外周血中外泌體均表達CD63 和CD9 蛋白。見圖3。上述結(jié)果表明本研究采用的外泌體分離方法可用于后續(xù)實驗。

圖1 TEM 觀察AML 患者外周血中外泌體形態(tài)表現(xiàn)（Bar=100 nm）Fig.1 Morphology of exosomes in peripheral blood of AML patients observed by TEM（Bar=100 nm）

圖2 NAT 法檢測AML 患者外周血中外泌體粒徑Fig.2 Particle sizes of exosomes in peripheral blood of AML patients detected by NAT method

圖3 2 組受試者外周血外泌體中CD63 和CD9 蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of CD63 and CD9 proteins in exosomes in peripheral blood of subjects in two groups

2.2 AML 患者外周血外泌體中miR-4286 表達水平RT-qPCR 法檢測結(jié)果見圖4A，AML 組患者外周血外泌體中miR-4286 表達水平［3.788（1.733，9.996）］高于對照組［0.994 （0.641，1.396）］，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-5.543，P<0.01）。GEO 數(shù)據(jù)庫基因表達芯片（GSE64029）檢測結(jié)果顯示：AML 組（原代AML 細胞）分泌的外泌體中miR-4286 表達水平高于對照組CD34+的骨髓基質(zhì)細胞（P<0.01）（圖4B）。

圖4 對照組和AML 組受試者外周血外泌體（A）和細胞（B）中miR-4286 表達情況Fig.4 Expressions of miR-4286 in cells(A) and exosomes in peripheral blood(B) of subjects in control group and AML group

2.3 外周血外泌體中miR-4286 表達水平診斷效能評估根據(jù)外周血外泌體miR-4286 表達水平生成ROC 曲線，評估外泌體miR-4286 對AML 患者的診斷價值，結(jié)果顯示：外周血外泌體中miR-4286表達水平用于診斷AML 時，AUC 為0.862 9（95%CI：0.774 7，0.937 1，P<0.01）；當診斷臨界值為3.182 時，靈敏度為66.67%，特異度為97.14%，具有良好的診斷效能（圖5）。

圖5 外周血外泌體中miR-4286 表達水平診斷AML的ROC 曲線Fig.5 ROC curves of expression level of miR-4286 in exosomes in peripheral blood in diagnosis of AML

3 討 論

AML 以克隆性造血干/祖細胞分化障礙、增殖失控和凋亡受抑為特征，具有高度異質(zhì)性［20］。AML 的診斷已整合細胞形態(tài)學、細胞化學、免疫表型、細胞遺傳學和分子生物學等多種學科［21］。已被證實有200 多種與AML 相關的分子和染色體異常，但仍有20%～25%的患者無法通過上述指標準確診斷［22］，未來仍需要檢測其他生物標志物。

外泌體是直徑為30～100 nm、含雙層膜結(jié)構的囊泡小體，可由多種細胞產(chǎn)生［23］。腫瘤細胞源性外泌體促進腫瘤生長，外泌體病理性改變可應用于腫瘤的診治［24］。目前可借助外泌體分離技術測定外泌體中蛋白質(zhì)、mRNA 和miRNAs 等內(nèi)容物，分析腫瘤特異性和階段特異性。有研究［25-26］證實：可利用外泌體中miRNAs 含量輔助診斷乳腺癌亞型。研 究［5，7，27-29］表 明：AML 分 泌 的 外 泌 體 在AML 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如參與基因調(diào)控網(wǎng)絡、攜帶免疫抑制分子、重塑造血微環(huán)境和引發(fā)化療耐藥［白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/血 管 內(nèi) 皮 生 長 因 子 受 體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）］，為AML 診治及預后監(jiān)測提供新的研究方向。

miRNAs 作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，與基因表達調(diào)控、細胞生物學過程和腫瘤發(fā)展有密切關聯(lián)［5］。外泌體miRNAs 水平在患者外周血中保持穩(wěn)定，可反映腫瘤細胞生物學特性，協(xié)助多種惡性腫瘤的早期診斷和預后評估，其中多種外泌體miRNAs 參與AML 的 發(fā) 生 發(fā) 展［5］。結(jié) 合 生 物 信 息 學 分 析 結(jié) 果［17］顯示：CD34+的骨髓基質(zhì)細胞和原代AML 細胞分泌的外泌體miR-4286 表達水平差異有統(tǒng)計學意義。已有研究［30-34］表明：miR-4286 可通過多種作用方式參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，其可通過靶向INPP4A 調(diào)控Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3 （signal transducer and activator of transcription，STAT3）通路、靶向第10 號染色體缺失的磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）調(diào)控 PI3K/Akt 通路，調(diào)節(jié)miR-4286/轉(zhuǎn)化 生 長 因 子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad3 負 反 饋 軸 和miR-4286/BZRAP1軸，參與胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）和 TGF-β 信號傳遞，進而參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖分化。綜上，外周血外泌體miR-4286 或可作為AML 的診斷標志物。

本研究通過超速離心法提取外周血外泌體，對外泌體miR-4286 進行RT-qPCR 法檢測，結(jié)果顯示：與健康人群比較，AML 組患者外周血外泌體中miR-4286 表達水平差異有統(tǒng)計學意義，AML 患者外周血外泌體miR-4286 表達水平明顯升高。ROC 分析結(jié)果顯示：外周血外泌體miR-4286 表達水平診斷AML 的AUC 為0.862 9，靈敏度和特異度較高。聯(lián)合分析miRNA 靶基因預測軟件miRWalk 和miRTarBase 顯 示：miR-4286 靶 基 因FANCC、FANCA、TP53、ITGB3 與AML 的 發(fā)生發(fā)展有密切關聯(lián)。通過對miR-4286 靶基因GO 和KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)：靶基因多集中范可尼貧血復合物、核質(zhì)和染色質(zhì)相關功能區(qū)域，參與DNA、肽鏈修復及酶結(jié)合，在范可尼貧血通路參與AML 病程。

本研究結(jié)果表明：外泌體miR-4286 表達水平可用于輔助AML 診斷，未來可進一步分析miR-4286 對白血病細胞功能的影響，探索miR-4286 基于納米顆粒藥物傳遞系統(tǒng)作為AML 治療靶點的可能性。

綜上所述，外周血外泌體miR-4286 在AML 患者中表達增強，可以作為AML 的診斷標志物。本研究存在一定局限性：①僅研究了外周血外泌體miR-4286 對AML 的診斷價值，但不排除與miR-125b、miR-150、miR-155 和miR-1246 等 聯(lián) 合診斷會提高AML 的診斷效能；②本研究僅闡述部分miR-4286 的生信分析結(jié)果，預測其在AML 中的信號調(diào)控網(wǎng)絡，具體機制還有待進一步研究。本研究未來仍需大規(guī)模、多中心的臨床研究累積數(shù)據(jù)，推廣應用于臨床診斷，進一步探索外周血外泌體miR-4286 作為AML 診斷標志物的意義，實現(xiàn)準確快捷診斷AML。