豬源沙門氏桿菌分離與鑒定

尉玉杰

摘要：從豬的糞便中分離出引起仔豬副傷寒的病原菌，對(duì)該病原菌的菌落特征和生化特點(diǎn)進(jìn)行了鑒定分析，并對(duì)該病原菌進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示該種致病菌對(duì)頭孢塞芬、頭孢唑啉敏感性最強(qiáng)，抑菌圈分別是18、25mm，在豬源沙門氏菌防治中，應(yīng)該選擇上述2種抗生素進(jìn)行對(duì)癥治療，這樣才能提高治療效果。

關(guān)鍵詞：豬源沙門氏菌;分離鑒定;體外抑菌試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S852.61

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.24.005

0引言

沙門氏菌在自然界中廣泛分布，是牲畜體內(nèi)的一種常在菌群，廣泛存在于豬牛羊的腸道中，通常沙門氏菌不會(huì)表現(xiàn)出明顯的致病能力，只有當(dāng)動(dòng)物身體抵抗能力下降、胃腸道中的有益菌群失衡時(shí)，沙門氏菌才會(huì)表現(xiàn)出致病能力，導(dǎo)致豬出現(xiàn)典型的臨床癥狀。

1材料與方法

1.1材料選取

本次研究所采集到的病例主要來(lái)源于某中小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖的患病豬。在無(wú)菌條件下，直腸深部采集患病豬的新鮮糞便裝人到無(wú)菌保存袋后，帶回試驗(yàn)室保存，在4C環(huán)境下等待使用。本次研究中所使用的培養(yǎng)基主要包括黃綠磺胺培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基和檸檬酸鹽培養(yǎng)劑。上述幾種培養(yǎng)基按照相應(yīng)的配置方法嚴(yán)格制作。試驗(yàn)中使用的試劑主要包括結(jié)晶紫、盧格氏碘液、番紅染色液、甲基紅指示劑。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)

將采集到的糞便制作成涂片后，選擇使用革蘭氏染色劑對(duì)涂片進(jìn)行充分染色，結(jié)合染色結(jié)果判定是否為沙門氏菌，再?zèng)Q定是否需要進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。在細(xì)菌分離培養(yǎng)中，先進(jìn)行增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，將增菌液劃線接種到分離培養(yǎng)基上，然后挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，如果是紅色短棒桿菌[1]，需要進(jìn)行進(jìn)一步純化培養(yǎng)，重復(fù)上述步驟，直到顯微鏡檢查的致病菌形態(tài)一致為止。

1.2.2細(xì)菌形態(tài)鑒定

首先，革蘭氏染色。將采集到的病料，涂抹在載玻片上，使用結(jié)晶紫對(duì)涂片進(jìn)行充分染色，染色時(shí)間控制在1min。染色結(jié)束后用水小心沖洗，然后進(jìn)行媒染，向涂片滴加革蘭氏碘液，作用1min后，用清水將碘液去除，再將載玻片傾斜，向其中連續(xù)滴加95%的乙醇，脫色20～25s，直到流出的液體無(wú)色為止，然后使用清水立即清洗干凈[2]。選擇使用番紅復(fù)染，將染好的涂片放置在空氣中晾干或者使用吸水紙吸干;顯微鏡檢查。從培養(yǎng)基上選擇典型形態(tài)的單個(gè)致病菌菌落，小心挑取致病菌，制成涂片后進(jìn)行革蘭氏染色，然后放置在顯微鏡下觀察，致病菌被革蘭氏染.成紫色表示革蘭氏陽(yáng)性染色，若染成紅色表示為革蘭氏陰性染色。

1.2.3致病菌生化鑒定

將革蘭氏陰性染色的桿菌進(jìn)行各種發(fā)酵糖發(fā)酵試驗(yàn)，再進(jìn)行進(jìn)一步的生化鑒定。生化試驗(yàn)主要選擇過(guò)氧化氫試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、乙酰甲基醇試驗(yàn)、苯丙氨酸試驗(yàn)。結(jié)合最終試驗(yàn)結(jié)果確定相應(yīng)的細(xì)菌種類。

1.2.4藥敏試驗(yàn)

選擇使用紙片擴(kuò)散法，將培養(yǎng)好的致病菌涂布在培養(yǎng)皿上，將各種藥名紙片做好標(biāo)記后，放置在培養(yǎng)皿中，持續(xù)培養(yǎng)24h后，觀察抑菌圈大小，用抑菌圈的大小表示該種抗生素對(duì)致病菌的敏感程度。

2結(jié)果

2.1致病菌形態(tài)

致病菌能在黃綠磺胺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，生長(zhǎng)出圓形、表面濕潤(rùn)光滑、邊緣整齊、淡黃色透明的致病菌菌落，菌落中央突起。同時(shí)，在細(xì)菌培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基顏色由紅色逐漸變成淡黃色。進(jìn)一步鏡檢可以發(fā)現(xiàn)致病菌呈桿狀，兩端呈橢圓形，革蘭氏陰性染色。進(jìn)一步分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)分離出的沙門氏菌菌落直徑為0.5～1.5mm，中央凸起，圓形，邊緣整齊，呈淡黃色，濕潤(rùn)光滑，細(xì)菌有鞭毛能運(yùn)動(dòng)，沒有芽孢，沒有夾膜[3]。

2.2生化鑒定

對(duì)從患病豬糞便中分離出來(lái)的致病菌進(jìn)行生化鑒定，發(fā)現(xiàn)該種致病菌過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，檸檬酸鹽試驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、乙酰甲基醇試驗(yàn)、苯丙氨酸試驗(yàn)全部為陰性。結(jié)合上述致病菌培養(yǎng)的形態(tài)特征和生化鑒定，結(jié)果可以判定分離出來(lái)的細(xì)菌屬于沙門氏菌屬。將分離出來(lái)的致病菌進(jìn)行進(jìn)一步的糖發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果顯示分離得到的致病菌能發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖、麥芽糖，不能發(fā)酵乳糖和蔗糖，結(jié)合常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)，對(duì)該細(xì)菌種類進(jìn)行鑒定，可知分離得到的沙門氏菌屬于甲型副傷寒沙門氏菌。

2.3藥敏試驗(yàn)

將分離得到的致病菌分別與頭孢唑林、頭孢塞酚、萬(wàn)古霉素、紅霉素、氯霉素、青霉素、四環(huán)素、苯唑西林、甲氧氟啶、諾氟沙星進(jìn)行紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)。在藥敏試驗(yàn)判定中，如果抑菌圈的大小超過(guò)15mm，則判定該種抗生素對(duì)沙門氏菌高度敏感，具有強(qiáng)抑菌作用。如果抑菌圈的直徑大于10mm、小于15mm，則表示該種抗生素對(duì)致病菌具有中度抑菌作用。如果抑菌圈的直徑小于10mm，表示該種抗生素對(duì)沙門氏菌的抑菌作用較低。如果抑菌圈直徑小于5mm，表示該種致病菌對(duì)該種抗生素具有耐藥性。通過(guò)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)頭孢唑林、頭孢塞酚、萬(wàn)古霉素、紅霉素、氯霉素、青霉素、四環(huán)素、苯唑西林、甲氧氟啶、諾氟沙星的抑菌圈直徑分別為18、25、7、7、8、7、9、13、10、3mm，結(jié)合，上述判定要求，發(fā)現(xiàn)分離得到的致病菌對(duì)頭孢唑林、頭孢塞酚高敏，對(duì)苯唑西林、甲氧氟啶中敏，對(duì)四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、青霉素、萬(wàn)古霉素低敏，對(duì)諾氟沙星耐藥。

3討論與結(jié)論

3.1合理選擇分離培養(yǎng)基

沙門氏菌在不同生長(zhǎng)環(huán)境下所需要的培養(yǎng)基種類存在很大差異性，因此應(yīng)該根據(jù)沙門氏菌所處的生長(zhǎng)環(huán)境與不同培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況進(jìn)行綜合選擇。在進(jìn)行沙門氏菌分離培養(yǎng)中，常規(guī)的方法是選擇麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、sS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。其中在SS瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的致病菌無(wú)色透明，中間帶有黑色的金屬光澤感;在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)出無(wú)色透明的致病菌菌落，能與大腸桿菌作出區(qū)分。本次所選擇的培養(yǎng)基中，致病菌在黃綠磺胺培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，會(huì)使培養(yǎng)基的顏色由紅色變成淡黃色，顏色變化較為明顯，同時(shí)分離出的致病菌形態(tài)更為明顯，能更加明顯地鑒定沙門氏菌屬性。

3.2細(xì)菌分離鑒定

沙門氏菌在分離鑒定中常規(guī)的方法是根據(jù)致病菌的形態(tài)以及生化試驗(yàn)確定致病菌類型，同時(shí)也可以借助分子生物學(xué)，如血清鑒定、PCR技術(shù)等，但由于基層地區(qū)的試驗(yàn)室缺乏相應(yīng)的檢測(cè)設(shè)備，同時(shí)這些技術(shù)操作要求相對(duì)較高，基層地區(qū)不具備該條件，因此通常采用傳統(tǒng)分離鑒定方法。本次分離鑒定主要包括選擇性增菌、分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)、生化鑒定、糖發(fā)酵等幾個(gè)步驟，準(zhǔn)確性相對(duì)較高，采用上述步驟，能得到比較純凈的沙門氏菌菌種。

3.3致病菌耐藥性鑒定

甲型副傷寒沙門氏菌是獸醫(yī)臨床上比較常見的沙門氏菌菌屬，該種沙門氏菌具有很強(qiáng)的致病性，在豬群中一旦爆發(fā)流行，將會(huì)造成極大的危害，導(dǎo)致大量豬死亡。近年，隨著生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)不斷向前發(fā)展，很多養(yǎng)殖戶存在盲目用藥的行為，抗生素的使用種類不斷增多，使用量不斷增大，導(dǎo)致致病菌的耐藥性日趨嚴(yán)重。因此，在進(jìn)行具體診治中，在明確致病原的基礎(chǔ)上一定要進(jìn)行嚴(yán)格的藥敏試驗(yàn)。本次藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離得到的致病菌對(duì)頭孢唑林、頭孢塞酚高敏，對(duì)苯唑西林、甲氧氟啶中敏，對(duì)四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、青霉素、萬(wàn)古霉素低敏，對(duì)諾氟沙星耐藥。因此，獸醫(yī)在進(jìn)行臨床治療中，一定要結(jié)合本地區(qū)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇相應(yīng)的抗菌藥物，這樣能極大縮短發(fā)病周期，提高治療效果。

參考文獻(xiàn)

[1]李三星.沙門氏菌藥敏試驗(yàn)及質(zhì)粒的保有狀況[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，1998（6）：7.

[2]馮文喆，金菊，王盎，等.鵝沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2018（6）：27-28.

[3]宋岱松，陳煥昌，劉媛媛，等.1例育肥豬沙門氏菌性腸炎的診治[J].養(yǎng)殖與飼料，2019（5）：70-74.