miR-429對乳癌細胞增殖和遷移影響及其靶基因初步鑒定

陳鳳婷 侯琳 韓清昕 于超 吳琍

[摘要]目的探討miR-429在人乳癌細胞系中的表達及其對細胞增殖和遷移的影響，初步鑒定miR-429的靶基因。方法采用實時熒光定量PCR（qPCR）方法檢測miR-429在人乳癌細胞系中的表達。通過MTT實驗和劃痕實驗確定miR-429對人乳癌細胞系MDA-MB-231細胞增殖和遷移的影響。采用生物信息學(xué)分析、qPCR和蛋白質(zhì)印跡方法鑒定miR-429的靶基因。結(jié)果miR-429在人乳癌細胞系MDA-MB-231和MCF-7中低表達。上調(diào)miR-429表達后，MDA-MB-231細胞增殖能力被顯著抑制（F=33.106，P<0.05），遷移能力明顯減弱（F=57.59，P<0.05）。過表達和抑制miR-429后，預(yù)測靶基因金屬蛋白酶2組織抑制劑（TIMP2）、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（CREB1）mRNA表達水平均無明顯變化;然而，過表達miR-429后，TIMP2蛋白的相對表達量顯著降低（F=33.74，P<0.05）。結(jié)論在MDA-MB-231細胞中，過表達miR-429可抑制細胞增殖和遷移。miR-429的過表達可能通過轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制TIMP2蛋白在MDA-MB-231細胞中的表達，初步鑒定TIMP2是miR-429的靶基因。

[關(guān)鍵詞]微RNAs;乳房腫瘤;細胞增殖;細胞運動;金屬蛋白酶2組織抑制劑

[中圖分類號]R737.9[文獻標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2019）03-0325-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression of microRNA-429 （miR-429） in human breast cancer cell line and its effect on the proliferation and migration of human breast cancer cell， and to preliminarily identify the target genes of miR-429. MethodsQuantitative real-time PCR （qPCR） was used to measure the expression of miR-429 in human breast cancer cell line. MTT assay and wound healing assay were used to investigate the effect of miR-429 on the proliferation and migration of human breast cancer MDA-MB-231 cell line. bioinformatics analysis， qPCR， and Western blot were used to identify the target genes of miR-429. ResultsMiR-429 showed low expression in human breast cancer MDA-MB-231 and MCF-7 cell lines. After upregulation of miR-429 expression， MDA-MB-231 cells had significant reductions in proliferative capacity （F=33.106，P<0.05） and migration ability （F=57.59，P<0.05）. There were no significant changes in the mRNA expression of the predicted target genes TIMP2 and CREB1 after miR-429 overexpression or inhibition; however， there was a significant reduction in the relative expression of TIMP2 protein after miR-429 overexpression （F=33.74，P<0.05）. ConclusionOverexpression of miR-429 may inhibit the proliferation and migration of MDA-MB-231 cell line and reduce the expression of TIMP2 protein in MDA-MB-231 cell line through post-transcriptional translation， and therefore， TIMP2 is preliminarily identified as the target gene of miR-429.

[KEY WORDS]microRNAs; breast neoplasms; cell proliferation; cell movement; tissue inhibitor of metalloproteinase-2

在世界范圍內(nèi)，乳癌發(fā)病率位列女性惡性腫瘤之首，居癌癥死亡原因的第6位。目前乳癌的確診主要依靠空芯針穿刺和手術(shù)活檢，對病人創(chuàng)傷較大。影像學(xué)檢查和血液檢驗主要用于檢查乳癌病人腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥，其靈敏度和特異度欠佳。因此，尋找在乳癌發(fā)生和進展過程中起關(guān)鍵作用的特異腫瘤標(biāo)志物對于乳癌的診斷治療至關(guān)重要。微RNAs（miRNAs）是單鏈非編碼RNAs，20～25個核苷酸長度，屬于一類新的內(nèi)源性干擾RNAs[1]。其通過與靶基因mRNA 3′非編碼區(qū)結(jié)合，對轉(zhuǎn)錄后基因沉默具有重要作用。miRNAs及其靶基因作為腫瘤標(biāo)志物在乳癌發(fā)生和進展中的作用是目前研究的熱點。miR-429作為癌基因或抑癌基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。已有研究顯示，乳癌組織miR-429的表達較癌旁組織明顯減低。miR-429在不同人乳癌細胞系中的表達存在差異[3]。關(guān)于miR-429在人乳癌組織中的靶基因及其生物學(xué)功能研究較少，且存在一定的爭議。有研究結(jié)果證實，在人乳癌組織中，miR-429通過下調(diào)ZEB1、CRKL、LIMK1、PLCG1等靶基因的表達，參與腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為[4-6]，發(fā)揮抑癌作用。因此，探討miR-429在乳癌中的作用機制，關(guān)鍵是研究miR-429及其靶基因的作用。本研究旨在探討miR-429在人乳癌細胞系中的表達情況，以及miR-429過表達和抑制對人乳癌MDA-MB-231細胞增殖和遷移的影響，并初步鑒定miR-429的靶基因，為明確miR-429參與乳癌的作用機制及尋找乳癌診斷、治療的標(biāo)志物提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料

人乳癌細胞系MCF-7（青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室）;人乳房上皮細胞系MCF-10A、人乳癌細胞系MDA-MB-231（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心實驗室）;miR-429 mimics、mimics NC、inhibitors NC、miR-429 inhibitors、Cy3標(biāo)記的mimics NC（上海吉瑪公司）;RIPA裂解液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）;BI胎牛血清（青島博康生物科技有限公司）;DMEM/High Glucose培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）;MTT試劑（Sigma公司）;Trizol Reagent（Invitrogen公司）;TransIntroTM EL Trans-fection Reagent、熒光定量PCR Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、鼠抗人GAPDH抗體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）;引物（上海桑尼生物科技有限公司）;兔抗人金屬蛋白酶2組織抑制劑（TIMP2）和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（CREB1）抗體（恩晶生物）;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG（北京博奧森公司）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)細胞用含體積分數(shù)0.10胎牛血清、10 g/L青鏈霉素混合液的DMEM/High Glucose培養(yǎng)液，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染和分組取生長狀態(tài)良好的細胞按每孔2×105接種于6孔板，待細胞匯合度達40%～60%時進行轉(zhuǎn)染。根據(jù)miRNA mimics和Trans-IntroTM EL Transfection Reagent轉(zhuǎn)染操作說明，用Cy3標(biāo)記的mimics NC和TransIntroTM EL Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。轉(zhuǎn)染后12 h更換含血清培養(yǎng)液并于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。最佳轉(zhuǎn)染條件為：mimics NC 12.5 μL、TransIntroTM EL Transfection Reagent 5 μL。細胞按轉(zhuǎn)染不同分為miR-429 mimics組（A組）、mimics NC組（B組）、control組（C組）、inhibitors NC組（D組）和miR-429 inhibitors組（E組）。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h用于后續(xù)實驗。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖活力取對數(shù)生長期細胞消化后接種于96孔板，每孔約6 000個細胞，每組設(shè)置5個復(fù)孔，共鋪4塊板。待細胞匯合度達到40%進行轉(zhuǎn)染。每天取一板細胞用MTT法檢測細胞增殖活力。從轉(zhuǎn)染12 h后開始檢測，每孔加入5 g/L的MTT 10 μL，放入培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后棄去培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO溶解甲瓚顆粒。酶標(biāo)儀設(shè)置震板5 min溶解甲瓚顆粒，檢測490 nm波長處各孔吸光度（A）值，以轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時間為橫軸、A值為縱軸制作細胞增殖曲線。

1.2.4細胞劃痕實驗取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，待細胞匯合度達到40%～60%時進行轉(zhuǎn)染，待細胞匯合度達到90%時進行劃痕實驗。分別于劃痕0、24 h時觀察細胞遷移情況并拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件計算劃痕面積，結(jié)果取3次重復(fù)實驗的均值。計算24 h劃痕愈合率[（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%]。

1.2.5生物信息學(xué)方法預(yù)測并篩選miR-429靶基因以miR-429為檢索詞，分別在miRanda、Targetscan和Pictar數(shù)據(jù)庫中篩選miR-429可能的靶基因，將至少兩個軟件都能預(yù)測到的基因作為其可能的靶基因。為了深入了解miR-429對乳癌細胞生物學(xué)功能的影響，將預(yù)測得到的miR-429靶基因進行GO富集分析，選擇富集了參與調(diào)控癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的靶基因。通過miRNA CancerMap數(shù)據(jù)庫和文獻分析排除已驗證過的靶基因，最終選取TIMP2、CREB1、EDNRA、TUBB、DUSP1、MED13、LRP1、GDI2、GABPA、UBE2B、EPS8、MYCN、PLK2、OCLN等作為待測的miR-429靶基因。

1.2.6實時熒光定量PCR（qPCR）檢測細胞miR-429表達水平和預(yù)測靶基因mRNA表達水平將轉(zhuǎn)染miR-429 mimics、mimics NC、inhibitors NC、miR-429 inhibitors的MDA-MB-231和MCF-7細胞以及只加TransIntroTM EL Transfection Reagent的control組細胞分別用Trizol法提取總RNA，測定各組RNA濃度，根據(jù)A260/280值判斷RNA純度。各組RAN A260/280均在1.8～2.0區(qū)間內(nèi)，純度較高。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件如下：65 ℃、5 min，冰上孵育2 min;42 ℃、15 min，85 ℃、5 s。根據(jù)qPCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為：94 ℃、30 s; 94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán)。各待測基因引物序列見表1。每組樣品至少設(shè)置3個復(fù)孔，實驗至少重復(fù)3次。以2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。

1.2.7Western blot方法檢測細胞TIMP2蛋白的相對表達量將上述5組細胞棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，加入RIPA裂解，提取總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。加入6×Protein Loading Buffer后煮沸5 min。在120 g/L SDS-PAGE分離膠+50 g/L濃縮膠的凝膠系統(tǒng)中電泳分離蛋白，然后將蛋白電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移至0.45 μm的PVDF膜上。條帶用50 g/L的脫脂奶粉在搖床上室溫封閉2 h，用對應(yīng)的1∶1 000稀釋的鼠抗人GAPDH抗體、兔抗人TIMP2抗體、兔抗人CREB1抗體在搖床上室溫孵育2.5 h，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。用對應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，重復(fù)TBST洗膜步驟，按說明配制ECL發(fā)光液并顯影。應(yīng)用Fusion FX7成像系統(tǒng)拍照并分析，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0和Graphpad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，樣本間比較采用析因設(shè)計的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1miR-429對MDA-MB-231細胞增殖活力影響

miR-429表達情況與培養(yǎng)時間存在交互效應(yīng)（F=5.941，P<0.05），miR-429表達對細胞增殖有顯著影響（F=33.106，P<0.05），從培養(yǎng)3 d開始各組的增殖水平開始出現(xiàn)差異（F=24.468、19.130，P<0.05）。培養(yǎng)3、4 d時miR-429 mimics組細胞增殖能力較control組、inhibitors NC組、miR-429 inhibitors組明顯減低（t=5.193～7.338，P<0.05），而miR-429 mimics組和mimics NC組細胞增殖能力無顯著差異（t=1.243、3.121，P>0.05）。見圖1。

2.2miR-429對MDA-MB-231細胞遷移能力影響

miR-429 mimics組、mimics NC組、control組、inhibitors NC組、miR-429 inhibitors組細胞的劃痕愈合率分別為0.101±0.043、0.139±0.010、0.413±0.020、0.416±0.066和0.361±0.064，miR-429的表達對MDA-MB-231細胞遷移能力有顯著影響（F=57.59，P<0.05）。組間兩兩比較，miR-429 mimics組和mimics NC組細胞遷移能力差異無顯著意義（t=1.199，P>0.05），miR-429 mimics組細胞遷移能力較control組、inhibitors NC組、miR-429 inhi-bitors組明顯減低（t=9.708～11.640，P<0.05）。

2.3miR-429在人乳癌細胞系MDA-MB-231和MCF-7中的表達

與非致瘤的上皮細胞系MCF-10A相比，人乳癌細胞系MDA-MB-231和MCF-7中miR-429的相對表達量分別為0.009±0.002（n=3）和0.007±0.002（n=4），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=921.264、1 233.490，P<0.05），結(jié)果表明miR-429在人乳癌MDA-MB-231和MCF-7細胞系中低表達。

2.4過表達或抑制miR-429后預(yù)測靶基因mRNA水平的變化

通過生物信息學(xué)結(jié)合文獻分析的方法得到預(yù)測靶基因TIMP2和CREB1。在MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞中分別過表達和抑制miR-429，采用qPCR檢測各靶基因的mRNA表達水平變化。與control組相比，在MDA-MB-231和MCF-7細胞中過表達和抑制miR-429，TIMP2和CREB1 mRNA相對表達水平無明顯變化（P>0.05）。見表2。

2.5miR-429對MDA-MB-231細胞中TIMP2蛋白表達的影響

miR-429 mimics組TIMP2蛋白表達明顯低于mimics NC組、control組、inhibitors NC組和miR-429 inhibitors組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=33.74，P<0.05）;而CREB1蛋白在各組細胞中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.557，P>0.05）。見表3。

3討論

目前，miR-429在乳癌中的生物學(xué)功能的研究較少。LI等[4]的研究結(jié)果表明，miR-429-5p通過LIMK1/CFL1通路顯著抑制人乳癌MDA-MB-231和HCC1937細胞的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。秦科宇等[3]的研究表明，miR-429能夠顯著促進人乳癌Bcap37細胞的增殖和遷移。本研究采用qPCR方法檢測顯示，miR-429在人乳癌MDA-MB-231、MCF-7細胞系中特異性表達下調(diào)。miR-429 mi-mics組較control組和inhibitors NC組細胞增殖、遷移能力減低，說明過表達miR-429可明顯抑制人乳癌MDA-MB-231細胞增殖和遷移。這與LI等[4]的研究結(jié)果相一致。本文MTT和劃痕實驗結(jié)果顯示，miR-429 mimics組和mimics NC組細胞增殖和遷移能力無顯著差異，可能是因為mimics NC樣品不純。外源性補充miR-429 inhibitors對人乳癌MDA-MB-231細胞增殖和遷移能力無明顯影響，可能是由于單鏈miR-429 inhibitors對內(nèi)源性miR-429抑制作用不顯著。miR-429在不同人乳癌細胞系中發(fā)揮不同作用，可能與該細胞系中miR-429及其靶基因表達譜相關(guān)，也可能與其所處的腫瘤微環(huán)境不同有關(guān)。

miR-429對TIMP2的靶向調(diào)控作用已經(jīng)在肺癌A549細胞系中得到證實[7]。該研究結(jié)果顯示，miR-429在A549細胞中高表達，外源性過表達miR-429可顯著促進細胞增殖、遷移和侵襲。本文研究結(jié)果顯示，過表達miR-429的人乳癌MDA-MB-231細胞中，TIMP2蛋白表達水平明顯減低，而TIMP2 mRNA表達水平則無明顯變化，間接說明TIMP2是miR-429的靶基因，miR-429在蛋白質(zhì)翻譯過程中下調(diào)TIMP2的表達。

TIMP2是一種基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）抑制劑，被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制因子。目前已在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了TIMP2的表達失調(diào)[8-11]。有研究表明，TIMP2在乳癌[12-13]、卵巢癌[14]、肺癌[15]中呈高表達。TIMP2在體外降低生長因子介導(dǎo)的細胞增殖水平[16]，抑制新生血管生成和腫瘤生長[17]，不是通過抑制MMP的活性[16]。miR-429在腫瘤中的作用取決于TIMP2的多功能作用[18]。關(guān)于TIMP2在乳癌中抑癌作用的研究較少。本研究通過蛋白質(zhì)印跡實驗證明，miR-429對TIMP2的抑制作用顯著。由本文MTT和劃痕實驗結(jié)果可推測，miR-429抑制細胞增殖和遷移并不全是通過下調(diào)TIMP2的表達而實現(xiàn)。

已有研究對miR-429在癌癥中的作用機制進行了探討。WANG等[19]研究結(jié)果表明，miR-429通過靶向TRAF6抑制NF-κB途徑進而抑制肝癌的進展。TANG等[20]研究表明，miR-429通過靶向抑制PTEN的表達，激活PI3K/AKT/GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白的核轉(zhuǎn)位，降低β-連環(huán)蛋白的磷酸化水平，促進肝癌細胞的侵襲和遷移。CHEN等[21]研究結(jié)果表明，miR-429的過度表達通過抑制Wnt/β-catenin通路，抑制卵巢上皮癌細胞的侵襲和化學(xué)耐藥。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，miR-429調(diào)控多個靶基因及信號通路。miR-429參與乳癌發(fā)生發(fā)展的機制尚不明確，乳癌中miR-429更多的靶基因及miR-429調(diào)控TIMP2發(fā)揮抑癌作用的機制尚需進一步研究。

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（本文編輯 馬偉平）