獐的消化道微生物探索

王怡然

[關(guān)鍵詞]獐;消化道;微生物

腸道微生物，是指動(dòng)物腸道內(nèi)全部的、復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)變化的微生物群落，腸道微生態(tài)系統(tǒng)與宿主的營養(yǎng)、代謝和免疫等方面密切相關(guān)。動(dòng)物并不是一個(gè)單純的個(gè)體，與動(dòng)物伴生著的，是寄生于動(dòng)物里的數(shù)量龐大的細(xì)菌們。它們廣泛分布在我們的口腔、腸道、皮膚、眼角膜、生殖道等幾乎身體的各處。很多時(shí)候是多種菌交叉互利共生，組成一個(gè)復(fù)雜的體系，往大了說，組成的是一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)，而且專門適應(yīng)于某種特定動(dòng)物的腸道。因此，研究物種消化道微生物是了解這一關(guān)系的重要起點(diǎn)。

1919年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了埃希氏細(xì)菌，這一發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著人們對消化道微生物奧秘探索的開始。從此，人們開始大量研究消化道微生物，這些研究主要集中在探究消化道菌群與宿主之間的關(guān)系。從而研究了消化道微生物的組成結(jié)構(gòu)、群落多樣性和一些生理特性問題（Smriga et al，2010）。隨著研究技術(shù)的發(fā)展，特別是分子生物學(xué)的快速發(fā)展，消化道微生物的研究也迅猛發(fā)展。近年來，對消化道微生物的研究主要集中在家禽家畜、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、野生動(dòng)物、昆蟲和人中，從高等白蟻消化道中分離到的多種異養(yǎng)型細(xì)菌，大多數(shù)為兼性厭氧菌（陳虹，2005），有的甚至是嚴(yán)格好氧菌，包括鏈球菌（Streptococcus sp.）、擬桿菌（Bacteroids sp.）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、葡萄球菌（StaphylOCOCCl，8sp）和芽胞桿菌（Bacilus sp）（黃云，2009）。Bairagi等人（Bairagi，2002）的相關(guān)研究表明，常見的草魚（Ctenopharyngodon idellus）、鯉魚（Cypnnus carpio）、羅非魚（Oreochromis mossambica）等9種魚類的消化道中，一些好氧細(xì)菌同時(shí)也具有分泌消化酶的功能，分泌的消化酶種類主要有淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶等。當(dāng)人們知道了消化道微生物對生物體的健康與疾病的關(guān)系之后，很多微生物制劑被應(yīng)用到健康領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、環(huán)境保護(hù)、分子生物領(lǐng)域等。消化道微生物的研究會(huì)越來越多，為我們揭示更多與寄主的關(guān)系，更多的造福人類。

消化道微生物參與動(dòng)物體的生長、發(fā)育、消化、吸收、營養(yǎng)、免疫、生物拮抗及其它各個(gè)方面的功能和結(jié)構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展和衰退的全過程（Ley et al.，2008）。其數(shù)量龐大，在成人消化道中，大約棲息著500種細(xì)菌，數(shù)量達(dá)到了1012-1014個(gè)，是人體自身細(xì)胞數(shù)量的10倍（Mcfall-Ngaiet al，2013）。

1研究對象

獐，為研究對象。又名河麂、毛獐、牙獐，偶蹄目、鹿科、獐亞科，是國家二級(jí)野生重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，IUCN紅色名錄易危等級(jí)。本實(shí)驗(yàn)的目的是：探索獐消化道里微生物的種類。

2實(shí)驗(yàn)方法

通過野外采樣：1.解剖采集消化道樣本，胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、盲腸。采集地址：崇明島明珠湖公園、松江浦南林地、浦東華夏公園。2采集糞便樣本（上海動(dòng)物園）3.DNA提純：用土壤動(dòng)物DNA提純試劑盒提純DNA。4高通量測序以及數(shù)據(jù)分析等過程完成實(shí)驗(yàn)。

3統(tǒng)計(jì)方法

3.IOTU聚類分析法：對測序結(jié)果進(jìn)行OTU聚類分析。OTU聚類分析：OTU（Operational Taxonomic Units）是為了便于研究人員進(jìn)行分析，在群體遺傳學(xué)或系統(tǒng)發(fā)生學(xué)科研究中，人為的為某一個(gè)分類單元（比如品系，屬，種、分組等）設(shè)置的一個(gè)同一標(biāo)志。如果要了解一個(gè)樣本測序結(jié)果里細(xì)菌的種或?qū)贁?shù)目信息，就必須對結(jié)果所得序列進(jìn)行歸類操作（cluster）。然后通過歸類操作，再將序列按照樣本彼此的相似性，進(jìn)行分成各個(gè)小組，每個(gè)小組即為一個(gè)OTU。可根據(jù)樣本中序列不同的相似度水平，對所有樣本序列進(jìn)行OTU歸類劃分，一般是先選擇在97%的OTU相似水平序列，再進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。利用Usearch軟件進(jìn)行處理。

分析方法具體為：先對優(yōu)化序列提取序列中的非重復(fù)部分，這樣方便降低分析中間過程時(shí)的冗余計(jì)算量，然后再去除沒有重復(fù)的單序列，對非重復(fù)序列（不包含單序列），按照97%的相似性，對OTU進(jìn)行聚類分析，在聚類分析的過程中，注意要去除嵌合體，然后便可得到OTU的代表序列。把所有的優(yōu)化序列map到OTU代表序列中，然后選出相似性在97%以上的序列為代表序列，進(jìn)而生成OTU表格。為得到所有OTU對應(yīng)的物種分類上的信息，采用RDP classifier貝葉斯算法，對OTU代表序列（97%相似水平）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分類分析，并在所有水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落構(gòu)成。

選擇以下幾個(gè)數(shù)據(jù)庫：16s細(xì)菌和古菌核糖體數(shù)據(jù)庫（在沒有特別指定時(shí)，可默認(rèn)使用silva數(shù)據(jù)庫）（Silva et al，2013）CReleasel23http：//www.arb-silva.de），RDP（Cole et al，2009）（Release 113http：//rdp.cmemsu.edu/）;18S真菌數(shù)據(jù)庫：Silva（Qnast et al，2013）;ITS真菌數(shù)據(jù)庫：Unite（Urmaset al，2013）;功能基因：FGR（Jordanetal，2013）;RDP的整理來自于GeneBank的功能基因數(shù)據(jù)庫。

3.2多樣性指數(shù)分析。群落生態(tài)學(xué)中的研究微生物群落多樣性，通過對每個(gè)樣品進(jìn)行多樣性分析（Alpha多樣性），便可以反映微生物的群落多樣性和物種豐度，還包括應(yīng)用一系列的統(tǒng)計(jì)生物學(xué)分析指數(shù)來估計(jì)環(huán)境群落的物種豐度和多樣性。

Shannon指數(shù)：可用來估算樣本中微生物群落多樣性，并且可以與Simpson多樣性指數(shù)來反映alpha生物多樣性指數(shù)。在Shannon值越大時(shí)，群落多樣性就越高。使用的軟件：mothur（Schloss et al，2011）。

3.3繪制香農(nóng)威納（sharmon-Wiener）曲線，所使用軟件：以97%相似度水平的OTU為基礎(chǔ)，使用mothur來計(jì)算不同的隨機(jī)抽樣下的得到的shannon值，然后利用R語言工具，繪制曲線圖。

Shannon-Wiener指數(shù)是用來反映樣品中微生物群落多樣性的一個(gè)指標(biāo)（YuWanget al 2012）。以各樣本的測序量為基礎(chǔ)，構(gòu)建在不同測序深度時(shí)的微生物群落多樣性指數(shù)曲線，以此來反映在不同測序數(shù)量時(shí)，各個(gè)樣品的微生物群落多樣性情況。當(dāng)香農(nóng)威納曲線趨于平坦時(shí)，此時(shí)說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，并可以反映已經(jīng)包含了樣品中的絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。

3.4繪制稀釋性曲線（Rarefaction curve），所使用軟件是：依然是以97%相似度的OTU為基礎(chǔ)，并做mothur做rarefaction分析，然后通過R語言工具來制作曲線圖。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)論

獐的消化道和糞便中的微生物，可測出的含量超過1%的微生物一共有約16個(gè)門。消化道里有104個(gè)屬，糞便里有113個(gè)屬。（自然界中食草動(dòng)物平均140多個(gè)屬，食肉動(dòng)物平均92個(gè)屬。

5討論

壁菌門為革蘭氏陽性，是人體及高等哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)最為優(yōu)勢的一大類細(xì)菌，比例約占總菌群的50-60%（Subnmgrnang et al，2004：Schuurman et al，2007;Zoetendal et al，2001）。厚壁菌門中的部分細(xì)菌對多糖的代謝和對于宿主的能量供應(yīng)及腸上皮細(xì)胞的發(fā)育有重要作用（Hooper et al，2001）。在未補(bǔ)鹽實(shí)驗(yàn)中成獐的回腸、結(jié)腸優(yōu)勢菌都是厚壁菌門，且胃部第二大優(yōu)勢菌也是厚壁菌門，它們或許對獐的多糖代謝、能量供應(yīng)以及細(xì)胞的發(fā)育起到了一定的作用。

擬桿菌門是人體腸道內(nèi)第二大優(yōu)勢類群，數(shù)量僅次于厚壁菌門。這一類細(xì)菌屬于革蘭陰性的嚴(yán)格厭氧菌，具有碳水化合物發(fā)酵、參與膽汁酸和類固醇代謝、維持腸道正常生理等諸多功能，對人體健康具有重要影響（schloss et al，2005）。并且其中的部分細(xì)菌還能夠降解人體不能代謝的植物多糖，為宿主提供能量（schloss et al，2005）及抵御腸侵人性病原菌的粘附等功能（Dyszynski et al，2006）。無論在未補(bǔ)鹽或補(bǔ)鹽實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)獐消化道和糞便中擬桿菌門含量較高，擬桿菌門可能也會(huì)在獐的消化道中對糖代謝、膽汁酸及類固醇的代謝和維持腸道正常生理等方面起到了一定的積極作用。