超高效液相色譜法分析蒲地藍(lán)消炎口服液的化學(xué)成分

陳世雄　翟青　袁平川　柳春燕

摘要?目的：通過超高效液相色譜法分析蒲地藍(lán)消炎口服液的化學(xué)成分。方法：采用Waters C18色譜柱（型號為Xbridge），該色譜柱填料顆粒直徑為5 μm，色譜柱的長度為250 mm，色譜柱內(nèi)經(jīng)為4.6 mm，柱溫30 ℃。進(jìn)樣量為10 μL，流動相采用乙腈（A相）和0.2%磷酸水溶液（B相）的二元體系進(jìn)行梯度洗脫，超高效液相色譜法方法嚴(yán)謹(jǐn)性考察，包括線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收試驗考察，基于超高效液相色譜法方法具有嚴(yán)謹(jǐn)性的前提下，對蒲地藍(lán)消炎口服液中成分的含量進(jìn)行測定。結(jié)果：1）線性考察結(jié)果顯示回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍分別是：結(jié)果表明黃芩苷在90.59～1 449.36 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y=17 465X+22 879（r=0.999 9）;菊苣酸得回歸方程Y=39 728X+15 520（r=0.999 8），在5.48～54.85 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。2）精密度試驗結(jié)果顯示，黃芩苷峰面積的RSD=0.18%，菊苣酸峰面積的RSD=0.16%，結(jié)果表明超高效液相儀器精密度良好。3）穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示黃芩苷峰面積的RSD=0.96%，菊苣酸峰面積的RSD=0.87%，符合色譜峰相對峰面積的RSD<3%則說明穩(wěn)定性良好，提示蒲地藍(lán)消炎口服液供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。4）重復(fù)性試驗研究結(jié)果顯黃芩苷峰面積的RSD=0.99%，菊苣酸峰面積的RSD=1.06%，符合色譜峰相對峰面積的RSD<3%表示重復(fù)性良好，提示蒲地藍(lán)消炎口服液供試品溶液的重復(fù)性良好。5）加樣回收試驗結(jié)果顯示黃芩苷對照品溶液、菊苣酸對照品溶液平均回收率分別為105.887%、99.033%，RSD分別為1.03%、1.11%，提示高相液相檢測方法所測加樣回收率結(jié)果可靠。6）3個不同批次的蒲地藍(lán)消炎口服液中黃芩苷成分和菊苣酸成分的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，另外3批蒲地藍(lán)消炎口服液的相似度檢測結(jié)果也比較相近。結(jié)論：超高效液相色譜法的操作簡單，方法嚴(yán)謹(jǐn)性強(qiáng)，可作為蒲地藍(lán)消炎口服液質(zhì)量控制的有效方法，而不同批次蒲地藍(lán)消炎口服液中有效成分含量未見明顯差異，且相似度高。

關(guān)鍵詞?超高效液相色譜法;蒲地藍(lán)消炎口服液;黃芩苷;菊苣酸;精密度;穩(wěn)定性;重復(fù)性;專屬性

Analysis of the Chemical Composition of Pudilan Xiaoyan Oral Liquid by Ultra High Performance Liquid Chromatography

Chen Shixiong1，Zhai Qing1，Yuan Pingchuan2，Liu Chunyan2

（1 Department of Pharmacy，The Second People`s Hospital of Wuhu，Wuhu 241000，China; 2 Drug Research & Development Center，Wannan Medical College，Wuhu 24100，China）

Abstract?Objective：To analyze the chemical composition of Pudilan Xiaoyan oral liquid by ultra-high performance liquid chromatography.Methods：Waters C18 column （model Xbridge） was used.The diameter of the column filler particle was 5 μm，and the length of the column was 250 mm.The inner diameter of the column was 4.6 mm，and the temperature of the column was 30 °C.The sample intake was 10 μL.The flow phase used a binary system of acetonitrile （phase A） and 0.2 % phosphate aqueous solution （phase B） for gradient elution.The ultra-high performance liquid chromatography method was rigorous，including linear relationship，precision，repeatability，stability，and sample recovery.Based on the rigorous method of ultra-high performance liquid chromatography，the content of Pudilan Xiaoyan oral liquid was determined.Results：1） The linear results showed that the regression equation，the correlation coefficient，and the linear range were：the results showed that baicalin had a good linear relationship with the peak area in the range of 90.59 to 1 449.36 μg.Its regression equation was Y=17 465 X+22 879 （r=0.999 9）; The regression equation Y=39 728X+15 520 （r=0.999 8） of Chicory acid had a good linear relationship with the peak area integral value in the range of 5.48 to 54.85 μg.2） The results of the precision test showed that the RSD=0.18 in the peak area and the RSD=0.16% in the peak area of Chicory acid.The results showed that the ultra-high liquid phase instrument had good precision.3） The stability test results showed that the RSD=0.96 in the peak area of Astragalin，and the RSD=0.87 % in the peak area of Chicory acid，which was in line with the RSD<3% in the peak area of the chromatographic peak，which showed good stability，suggesting that the stability of the Pudilan Xiaoyan oral liquid for the test solution was good within 24 h.4） The results of repetitive experiments showed that the RSD=0.99 in the peak area of scutellaria，the RSD=1.06 % in the peak area of Chicory，and the RSD<3% in the relative peak area of the peak of the spectrum，which indicated good repeatability，suggesting that the Pudilan Xiaoyan oral liquid had good repeatability for trial solution.5） The results of the sample recovery test showed that the average recovery rates of baicalin reference solution and Chicory acid reference solution were 105.887 % and 99.033 %，respectively，and RSD was 1.03 % and 1.11 %，respectively.It was suggested that the sample recovery rate measured by high phase liquid detection method was reliable.6） The content of baicalin and Chicory acid in 3 different batches of Pudilan Xiaoyan oral liquid was not significantly different，and the similarity test results of three batches of Pudilan Xiaoyan oral liquid were similar.Conclusion：The high performance liquid chromatography （HPLC） method is simple and strict.It can be used as an effective method to control the quality of Pudilan Xiaoyan oral liquid，but there is no significant difference in the content of active ingredients in different batches of Pudilan Xiaoyan oral liquid，and the similarity is high.

Key Words?Ultra-high performance liquid chromatography; Pudilan Xiaoyan oral liquid; Astragalin; Chicory acid; Precision; Stability; Repetition; Specificity

中圖分類號：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.011

蒲地藍(lán)消炎口服液的藥物組成主要有蒲公英、苦地丁、板藍(lán)根、黃芩等4味中藥，四味藥經(jīng)過現(xiàn)代化提取工藝制備而成中藥口服制劑，具有清熱解毒涼血，消腫散結(jié)利咽的功效，臨床上對咽炎[1]、扁桃體炎[2]具有治療效果，近來也有現(xiàn)代藥理研究表明[3-4]，蒲地藍(lán)消炎口服液具有抗菌、抗病毒、提高免疫力、抗炎、抗氧化等作用，對于“脾常不足”的小兒更適用，對小兒手足口病[5-6]也具有良好的臨床治療效果。蒲地藍(lán)消炎口服液方中有效成分眾多，蒲公英為君藥，專入肝經(jīng)、胃經(jīng)，善清泄熱毒，朱丹溪指出;“蒲公英花味胃甘屬土，入太陰陽明經(jīng)”，不僅有利濕泄毒之功，可使熱邪從小便而泄，但氣性甘平，而不損脾土;而且蒲公英可去陽明之熱兼可消腫散結(jié)，疏肝散滯。菊苣酸為方中君藥蒲公英中的一種酚酸類化合物，集抗炎、抗菌、抗病毒、解熱和促免疫等作用于一體[7]。黃芩既能消腫，又能入血分而清熱解毒，尤善瀉上中焦之熱，黃芩可入肺胃經(jīng)，在蒲地藍(lán)消炎口服液中可作為引經(jīng)藥引藥直達(dá)病所，其中含量較高的活性成分為黃芩苷，具有抗菌、抗病毒、清除氧自由基、解熱、鎮(zhèn)靜、調(diào)節(jié)免疫等作用[8];2015年版《中華人民共和國藥典》中記載了方法對產(chǎn)品中的黃芩苷、菊苣酸的含量進(jìn)行了測定[9]，該方法由于檢測耗時較長，不利于生產(chǎn)過程中對產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制，本文采用超超高效液相色譜法對蒲地藍(lán)消炎口服液進(jìn)行質(zhì)量評價與控制，以縮短中間體檢測時間，提高檢測效率。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?Waters超高效液相（型號：2695型），其中Waters氘燈（PDA，型號：2998型）。購買于上海卓精電子科技有限公司的電子分析天平（型號：BSA-220型）和超聲波清洗器（型號：AS3120）;購買于上海摩速科學(xué)器材有限公司的超純水系統(tǒng)（型號：Milli-Q型）。

1.2?試藥?于中國藥品生物制品檢定所購買黃芩苷對照品和菊苣酸對照品，批號分別為110715-201016、111752-200902。廣州丹旺貿(mào)易有限公司購買色譜純乙腈和甲醇，批號分別為：A998-4、67-56-1。于山東佰仟化工有限公司購買的磷酸分析純（AR級，批號：7664-38-2）。

1.3?分析藥品?蒲地藍(lán)消炎口服液由濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20030095，選擇1311263、1311218、1311285，3個不同批次。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件?采用Waters C18色譜柱（型號為Xbridge），該色譜柱填料顆粒直徑為5 μm，色譜柱的長度為250 mm，色譜柱內(nèi)經(jīng)為4.6 mm，柱溫30 ℃。進(jìn)樣量為10 μL，流動相采用乙腈（A相）和0.2%磷酸水溶液（B相）的二元體系進(jìn)行梯度洗脫，具體的梯度洗脫程序和流速見表1。

2.2?對照品溶液配制?精密稱取48.18 mg黃芩苷對照品，放置于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度定容，充分搖晃均勻，即得已知濃度黃芩苷對照品溶液;精密稱取13.7 mg菊苣酸對照品，放置于100 mL量瓶中，加20 mL乙腈和80 mL水定容并，充分搖晃均勻，既得已知濃度菊苣酸對照品溶液。

2.3?供試品溶液配制

精密量取5 mL蒲地藍(lán)消炎口服液，放置于50 mL量瓶中，加12.5 mL乙腈和37.5 mL水定容，搖勻，即得蒲地藍(lán)消炎口服液供試品溶液。

2.4?專屬性試驗?取10 μL黃芩苷對照品溶液、菊苣酸對照品溶液，根據(jù)2.1的色譜條件進(jìn)行專屬性試驗，結(jié)果顯示黃芩苷對照品溶液菊苣酸對照品溶液具有良好的專屬性。

2.5?線性關(guān)系考察?精密量取已知濃度黃芩苷對照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、8 mL，分別置10 mL量瓶中，用甲醇依次稀釋成不同濃度的黃芩苷對照品溶液，按照“2.1”項下色譜方法進(jìn)樣。以峰面積積分值（Y）的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量的自然對數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。精密量取已知濃度菊苣酸對照品溶液10 mL、7.5 mL、4 mL、2 mL、1 mL，分別置25 mL量瓶中，用比例為20∶80乙腈和水依次稀釋成不同濃度的菊苣酸對照品溶液，方法同黃芩苷進(jìn)行線性回歸。見表2。

2.6?精密度試驗?精密吸取同一蒲地藍(lán)消炎口服液供試品溶液，在2.1色譜條件和室溫儀器等相同的情況下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果顯示，黃芩苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）=0.18%，菊苣酸峰面積的RSD=0.16%，結(jié)果表明超高效液相儀器精密度良好。

2.7?穩(wěn)定性試驗?取同一批號供試品溶液以檢驗供試品溶液的穩(wěn)定性，分別室溫放置0、3、6、9、12、18、24 h后進(jìn)行HPLC檢測，并記錄峰面積，本研究穩(wěn)定性結(jié)果顯示黃芩苷峰面積的RSD=0.96%，菊苣酸峰面積的RSD=0.87%，符合色譜峰相對峰面積的RSD<3%則說明穩(wěn)定性良好，提示蒲地藍(lán)消炎口服液供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見表3、表4。

2.8?重復(fù)性試驗?精密量取6份同一批號供試品溶液，進(jìn)行短時間內(nèi)的HPLC連續(xù)重復(fù)性測試，連續(xù)進(jìn)樣，并根據(jù)已知濃度的黃芩苷和菊苣酸，本研究結(jié)果顯黃芩苷峰面積的RSD=0.99%，菊苣酸峰面積的RSD=1.06%，符合色譜峰相對峰面積的RSD<3%表示重復(fù)性良好，提示蒲地藍(lán)消炎口服液供試品溶液的重復(fù)性良好。

2.9?回收率試驗?精密吸取已知含量的蒲地藍(lán)消炎口服液供試品溶液6份，每份均為5 mL，分別置于50 mL容量瓶中，每一份均精密加入等量已知濃度的黃芩苷對照品溶液、菊苣酸對照品溶液，加入超純水稀釋至刻度定容混合均勻后，進(jìn)行加樣回收試驗的檢測，根據(jù)2.1的色譜條件進(jìn)行檢測并計算加樣回收率。結(jié)果顯示黃芩苷對照品溶液、菊苣酸對照品溶液平均回收率分別為105.887%、99.033%，RSD分別為1.03%、1.11%，提示高相液相檢測方法所測加樣回收率結(jié)果可靠。見表5。

2.10?樣品檢測結(jié)果?取1311263、1311218、1311285等3個不同批次號的蒲地藍(lán)消炎口服液，根據(jù)2.2供試品溶液配制，每批樣品都根據(jù)2.1的色譜條件進(jìn)行重復(fù)測試3次，蒲地藍(lán)消炎口服液中成分的含量取3次測定的平均值，結(jié)果顯示如表5所示，3個不同批次的蒲地藍(lán)消炎口服液中黃芩苷成分和菊苣酸成分的含量未見明顯差異。另外3批蒲地藍(lán)消炎口服液的相似度檢測結(jié)果也比較相近。見表6。

3?討論

蒲地藍(lán)消炎口服液的超高效液相色譜法檢測的過程中，分別采用紫外-可見分光光度計及二極管陣列檢測器在210～400 nm波長范圍內(nèi)分析黃芩苷對照品和菊苣酸對照品和蒲地藍(lán)消炎口服液供試品溶液，發(fā)現(xiàn)當(dāng)檢測波長是326 nm時菊苣酸有最大吸收峰，而檢測波長為278 nm和315 nm時，黃芩苷均可見最大吸收峰，為了同時檢測到高含量的黃芩苷和菊苣酸，參閱文獻(xiàn)得[10]，由于黃芩苷在蒲地藍(lán)消炎口服液樣品中含量較高，而菊苣酸在蒲地藍(lán)消炎口服液樣品中含量偏低，有研究表明在326 nm處測定黃芩苷與原方法選定的315 nm測定結(jié)果基本一致。因此為提高菊苣酸的檢測靈敏度，只能選擇326 nm波長，因為在這個波長處可同時獲得2種成分最大吸收峰并測定2種成分的含量。

在蒲地藍(lán)消炎口服液高效液相檢測時間方面，根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版中蒲地藍(lán)消炎口服液關(guān)于黃芩（黃芩苷）的基礎(chǔ)檢測指標(biāo)不變的同時，增加了其中蒲公英（菊苣酸）含量指標(biāo)的檢測，但在《中華人民共和國藥典》中蒲公英（菊苣酸）的檢測采用的是長達(dá)65 min的單針進(jìn)樣分析。因此，僅在蒲地藍(lán)消炎口服液配制液的檢測過程，單批次的4針檢測時間就長達(dá)260 min[11-13]，這大大的增加了產(chǎn)品的制備和檢測的周期，所以本研究中使用的檢測方法對此進(jìn)行了優(yōu)化，可同時對黃芩苷、菊苣酸含量進(jìn)行檢測分析，還大大的縮短了檢測時間，故而有利于減少蒲地藍(lán)消炎口服液中間體配置液在待檢測時的污染風(fēng)險，降低生產(chǎn)、分析成本，提高產(chǎn)品生產(chǎn)的控制力度。

研究建立的超高效液相色譜法同時測定黃芩苷及菊苣酸的含量，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，適用于蒲地藍(lán)消炎口服液生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。本文以3批蒲地藍(lán)消炎口服液的超高液相色譜圖建立共有模式，相似度>0.99，采用圖譜聚類分析方法，所有樣品聚為一類，聚類趨勢與相似度計算結(jié)果一致[14]，符合超高效液相色譜圖要求，可以作為評價蒲地藍(lán)消炎口服液質(zhì)量的方法。中藥超高效液相色譜法技術(shù)是中藥質(zhì)量控制的成熟方法，中藥復(fù)方成分多、靶點多，對具有多種有效成分，且相互間可發(fā)生直接影響，單一或幾個成分不能體現(xiàn)整體復(fù)方的特點，在中成藥生產(chǎn)、檢驗和研究過程中起到重要作用[15-16]。本文采用超高效液相色譜法法對蒲地藍(lán)消炎口服液質(zhì)量進(jìn)行評價，從整體上判斷和控制蒲地藍(lán)消炎口服液質(zhì)量，在控制工藝穩(wěn)定性、確保不同批次產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定方面具有現(xiàn)實意義。

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