不同比例附子配黃連在Caco-2細胞模型中跨膜轉(zhuǎn)運研究*

周旺洋 賀秀云 劉夢婷 呂秋菊 秦海燕 李越蘭 宋捷民△

（1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院，浙江 杭州 310005；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州310053）

不同比例附子配黃連在Caco-2細胞模型中跨膜轉(zhuǎn)運研究*

周旺洋1賀秀云2劉夢婷2呂秋菊2秦海燕2李越蘭2宋捷民2△

（1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院，浙江 杭州 310005；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州310053）

目的 通過Caco-2細胞模型，研究不同比例的附子配黃連在Caco-2細胞中主要成分的吸收和轉(zhuǎn)運情況。方法 利用Caco-2細胞模型和高效液相色譜法，研究附子配黃連比例為1∶1、1∶2、2∶1時的吸收和轉(zhuǎn)運，計算跨膜轉(zhuǎn)運量和表觀滲透系數(shù)，3種比例藥物配伍對吸收和轉(zhuǎn)運的影響。結果 附子∶黃連比例為1∶1、1∶2、2∶1時，鹽酸小檗堿在150min時的跨膜轉(zhuǎn)運量AP→BL側(cè)分別為0.625，0.161，0.055μg，BL→AP側(cè)分別為1.308，0.178，0.064μg，表觀滲透系數(shù)分別為2.095，1.107，1.172μg，次烏頭堿在150min時的跨膜轉(zhuǎn)運量AP→BL側(cè)分別為0.634，0.401，0.204μg，BL→AP側(cè)分別為0.534，0.108，0.067μg，表觀滲透系數(shù)分別為0.842，0.268，0.328。結論 附子配黃連1∶1用量比優(yōu)于1∶2、2∶1的用量比，證明臨床用量比的最佳性。

附子配黃連 比例 Caco-2細胞 跨膜轉(zhuǎn)運

附子配黃連，出自《傷寒論》附子瀉心湯。后世醫(yī)家在治寒熱錯雜的方劑中每每用之，附子黃連，一熱一寒，寒溫并用。臨床上常用于寒熱互結所致的心下痞滿，寒熱夾雜之瀉痢，上熱下寒之口瘡足冷等證。但在諸方劑中，二藥配伍比例各不相同。有文獻報道，黃連與附子不同配伍比例對小鼠胃腸運動影響各異［1］。為此本研究選用目前應用最佳的體外吸收Caco-2細胞模型，測定二藥不同配伍的吸收、轉(zhuǎn)運特征，以研究附子配黃連之間的相互作用和生物利用度?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與試藥 Caco-2細胞株購自上海細胞庫，傳代數(shù)為25～50代。RPMI-1640細胞培養(yǎng)液（吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司，產(chǎn)品型號：GNM31800-S）；0.25%胰酶（凱基生物醫(yī)藥技術有限公司，產(chǎn)品型號：KGM27250）；D-Hanks緩沖液（吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司，產(chǎn)品型號：GNM14175）；胎牛血清（產(chǎn)品型號：Gibco，16000044）；MEMNEAA非必需氨基酸溶液100X（產(chǎn)品型號：Gibco，11140050）；L-谷氨酰胺 （杭州昊天生物技術有限公司，產(chǎn)品型號：PYG21051）；堿性磷酸酶ALP/AKP試劑盒 （南京建成生物工程研究所）；MTT（產(chǎn)品型號：Amresco 0793）；二氯甲烷（天津市永大化學試劑有限公司）；次烏頭堿標準品 （中國食品藥品檢定研究院，110798-201106）；鹽酸小檗堿（中國藥品生物制品檢定所，批號：110713-200911）。藥材附子選自四川綿陽市江油恒源藥業(yè)有限公司附子GAP基地，黃連購自重慶市石柱縣黃水鎮(zhèn)黃連GAP基地，藥材經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室張水利教授鑒定，附子為毛莨科植物烏頭（AconiLum carmichaeli Debx.）的子根的加工品，黃連為毛茛科植物黃連（Coptis chinensis Franch）的干燥根莖。經(jīng)學院制劑室提取得附子提取物 （自制，13011706，烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的含量分別為2.29、2.76、2.02mg/g）、黃連提取物（自制，12122110）。分別精密稱取黃連自制品、附子自制品適量，折合藥材質(zhì)量比例，制得附子∶黃連分別為1∶1（藥對1），1∶2（藥對2），2∶1（藥對3）的溶液，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，存于4℃冰箱待用。

1.2 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱 Thermo scientific；SWCJ-ZFD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；TE-2000-S倒置顯微鏡，日本尼康；LDZ5-2低速自動平衡醫(yī)用離心機，北京醫(yī)用離心機廠；R502B SENCO恒溫水浴，上海森信實驗儀器有限公司；YXQ-280SD型蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；680型酶標儀，Thermo scientific；十萬分之一天平，Mettler Toledo；DGG 9240B型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；跨膜電阻儀，Millicell-ERS，Millipore corporation，USA；24孔Transwell小室，Greiner；24孔貼壁細胞培養(yǎng)板，Greiner；96孔細胞培養(yǎng)板，Corning；25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，Corning；0.22μm微孔濾器，Corning；島津LC高效液相色譜儀（日本島津公司）；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm× 150mm，5μm）。

1.3 確定附子黃連的配伍比例 從轉(zhuǎn)化醫(yī)學角度出發(fā)，附子配黃連用量比例應來自于臨床。筆者整理研究了歷代著名方書中129張含有附子、黃連的方劑，分析研究后，結果表明：有59張方附子配黃連用量比是為1∶1；10張方附子配黃連為2∶1；16張方附子配黃連為1∶2。確定臨床使用較多的3種附子配黃連用量比例1∶1、1∶2、2∶1，作為在Caco-2細胞模型中吸收和轉(zhuǎn)運情況用藥配伍比例。

1.4 建立細胞單層模型 在接種細胞前1 d將24孔Transwell小室置于4.5%CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化一夜。取對數(shù)生長期細胞按細胞傳代的方法消化離心，加培養(yǎng)液稀釋成細胞混懸液，按1×105個/mL，300μL接種到Transwell聚酯（PET）上，另取RPMI-1640細胞培養(yǎng)液1500μL于24孔板中。接種后前14 d每隔1 d換1次液，以后每天換液，培養(yǎng)21 d左右［2-3］。

1.5 轉(zhuǎn)運實驗 待Caco-2細胞在Transwell培養(yǎng)板上形成緊密、完整的單細胞層后，吸去培養(yǎng)液。各孔貼壁加入37℃的D-Hanks液，在不破壞細胞層的條件下，蕩洗細胞3次，吸干各孔內(nèi)D-Hanks液。當研究藥物從AP側(cè)→BL側(cè)轉(zhuǎn)運時，在24孔Transwell培養(yǎng)板上AP側(cè)加入0.3mL藥物，BL側(cè)加入1.5mLD-Hanks緩沖液；當研究藥物從BL側(cè)→AP側(cè)轉(zhuǎn)運時，在AP側(cè)加入0.3 mL D-Hanks緩沖液，BL側(cè)加入1.5 mL藥物；然后把Transwell培養(yǎng)板放在37℃，4.5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，分別在90、120、150min從接收側(cè)（加D-Hanks緩沖液一側(cè)）吸取0.1mL接收液于EP管中，并放置于-80℃冰箱待測，每次補足相應量的D-Hanks緩沖液［4］。

HPLC檢測各成分含量。色譜條件為，色譜柱：A-gilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×150mm，5μm），流動相：甲醇（B相）-0.1%甲酸（A相），總流速：1.00mL/min，檢測波長：237 nm，柱溫：（25±1）℃，進樣量：20μL。見表1。

表1 色譜條件

轉(zhuǎn)運試驗中加入空白轉(zhuǎn)運液的一側(cè)為接收室，接收室的藥量視為吸收量（Qri）。AP-BL轉(zhuǎn)運試驗中，BL室藥量為吸收量；BL-AP轉(zhuǎn)運試驗中，AP室藥量為吸收量，由于雙向轉(zhuǎn)運空白轉(zhuǎn)運液體積不同，累計吸收量的計算公式略有差異。每個時間點取樣后，樣品不再返還Transwell系統(tǒng)，但要補加相同體積的空白轉(zhuǎn)運液，以保持溶液體積不變。具體計算方法見以下公式：

AP→BL QrB=0.1（Qr1+Qr2+……+Qr（i-1））+1.5Cri，

BL→AP QrA=0.1（Qr1+Qr2+……+Qr（i-1））+0.3Cri，

上式中，1.5、0.3分別為接收室所加D-Hanks液體積（mL），0.1為取樣體積（mL），Cri為接受室第i個時間點實測藥物濃度（i=1～3）。

藥物透過Caco-2細胞單層的表觀穿透系數(shù)用Papp（cm/s）值作為參考，按下式進行藥物轉(zhuǎn)運率計算：

其中△Q（μg）為△t（s）內(nèi)的轉(zhuǎn)運量，A（0.33 cm2）為細胞單層膜面積，Co（μg/mL）為供給室藥物初濃度。兩側(cè)轉(zhuǎn)運率比值Pratio的計算公式：

其中Papp（BL-AP）和Papp（AP-BL）分別為雙向表觀滲透系數(shù)［5］。

1.6 方法學考察

1.6.1 線性關系考察［6］精密稱取鹽酸小檗堿標準品0.21mg于10mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解稀釋至刻度，用D-Hanks緩沖液稀釋成13.12，26.25，52.5，105，210 ng/mL的溶液；精密稱取次烏頭堿標準品1.05mg于10mL容量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，再用DHanks分別稀釋成65.62，131.25，262.5，525，1050 ng/mL的溶液；其中二氯甲烷的濃度小于0.5%將不會影響單細胞層的完整性。進行HPLC色譜分析，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，分別做標準曲線。鹽酸小檗堿的標準曲線為：y=473.89x-473.08（r=0.9997），次烏頭堿的標準曲線為：y=220.75x-1648.8（r=0.9991）。鹽酸小檗堿在13.125～210 ng/mL，次烏頭堿在65.625～1050 ng/mL的范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關系。

1.6.2 穩(wěn)定性考察［7］精密吸取鹽酸小檗堿、次烏頭堿標準溶液20μL，分別于0、2、4、6、8、10 h進行測定，計算各峰面積標準偏差。鹽酸小檗堿、次烏頭堿標準偏差分別為2.76%、1.19%。

1.6.3 精密度考察［8］分別精密吸取鹽酸小檗堿、次烏頭堿標準溶液20μL，各重復進樣6次，計算各峰面積標準偏差。鹽酸小檗堿、次烏頭堿標準偏差分別為1.80%、0.42%。

1.6.4 專屬性實驗［9］分別精密吸取D-Hanks緩沖液（含0.25%二氯甲烷）、鹽酸小檗堿標準品、次烏頭堿標準品20μL，進行HPLC分析，考察分析方法專屬性。結果溶劑對成分檢測無干擾。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用方差分析和t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MTT實驗結果 藥對1、藥對2、藥對3分別在2.18～34.80、4.44～71.00、1.15～18.4（μg/mL，以鹽酸小檗堿計）內(nèi)對Caco-2細胞為非細胞毒性計量，選取安全濃度進行吸收與轉(zhuǎn)運實驗，分別為34.80、71.00、18.4μg/mL。

2.2 3個比例藥對在各個時間段的跨膜轉(zhuǎn)運量 見表2～4。利用HPLC方法測定3個比例藥對在各個時間段的跨膜轉(zhuǎn)運量。結果顯示鹽酸小檗堿和次烏頭堿的跨膜轉(zhuǎn)運量隨時間的增加而不斷增加。在不同時間點，藥對1中鹽酸小檗堿和次烏頭堿的轉(zhuǎn)運量大于另外兩個藥對。

表2 藥對1主要成分在不同時間的跨膜轉(zhuǎn)運量△Q（μg，±s）

表2 藥對1主要成分在不同時間的跨膜轉(zhuǎn)運量△Q（μg，±s）

藥物 轉(zhuǎn)運方向 90min 120min 150min鹽酸小檗堿AP→BL 0.039±0.006 0.540±0.186 0.625±0.170（n=3）BL→AP 0.033±0.012 0.862±0.059 1.308±0.613次烏頭堿AP→BL 0.241±0.029 0.546±0.014 0.634±0.031（n=3）BL→AP 0.060±0.012 0.382±0.006 0.534±0.033

表3 藥對2主要成分在不同時間的跨膜轉(zhuǎn)運量△Q（μg，±s）

表3 藥對2主要成分在不同時間的跨膜轉(zhuǎn)運量△Q（μg，±s）

藥物 轉(zhuǎn)運方向 90min 120min 150min鹽酸小檗堿AP→BL 0.027±0.006 0.119±0.009 0.161±0.026（n=3）BL→AP 0.074±0.010 0.146±0.006 0.178±0.008次烏頭堿AP→BL 0.335±0.042 0.339±0.056 0.401±0.044（n=3）BL→AP 0.045±0.006 0.081±0.011 0.108±0.007

表4 藥對3主要成分在不同時間的跨膜轉(zhuǎn)運量△Q（μg，±s）

表4 藥對3主要成分在不同時間的跨膜轉(zhuǎn)運量△Q（μg，±s）

藥物 轉(zhuǎn)運方向 90min 120min 150min鹽酸小檗堿AP→BL 0.037±0.002 0.048±0.005 0.055±0.007（n=3）BL→AP 0.024±0.007 0.039±0.008 0.064±0.015次烏頭堿AP→BL 0.152±0.015 0.176±0.004 0.204±0.036（n=3）BL→AP 0.034±0.001 0.046±0.005 0.067±0.003

2.3 鹽酸小檗堿和次烏頭堿的表觀轉(zhuǎn)運系數(shù)（Papp）和雙向轉(zhuǎn)運率（Pratio） 見表5，表6。根據(jù)公式計算鹽酸小檗堿和次烏頭堿的Papp和Pratio。結果鹽酸小檗堿在藥對1中以主動轉(zhuǎn)運為主，而在藥對2和藥對3中則表現(xiàn)為以被動轉(zhuǎn)運為主。次烏頭堿表現(xiàn)為以被動轉(zhuǎn)運為主。

表5 鹽酸小檗堿的Papp和Pratio比較（±s）

表5 鹽酸小檗堿的Papp和Pratio比較（±s）

藥對n Papp（AP→BL）Papp（BL→AP）Pratio（×10-6cm/s） （×10-6cm/s） （BL→AP/AP→BL）藥對1 3 6.043±1.640 12.659±5.9352.095藥對2 3 0.765±0.125 0.846±0.0401.107藥對3 3 0.998±0.122 1.169±0.2781.172

表6 次烏頭堿的Papp和Pratio比較（±s）

表6 次烏頭堿的Papp和Pratio比較（±s）

藥對n Papp（AP→BL）Papp（BL→AP）Pratio（×10-6cm/s） （×10-6cm/s） （BL→AP/AP→BL）藥對1 3 15.705±0.759 13.216±0.8260.842藥對2 3 9.925±1.094 2.662±0.1620.268藥對3 3 5.069±0.880 1.663±0.0640.328

3 討 論

Caco-2細胞于1977年由Fogh等首次分離自人類結腸腺癌細胞，其結構和功能類似于分化的小腸上皮細胞，具有微絨毛，緊密連接等結構，并含有與小腸刷狀緣上皮相關的酶系和一定程度的蛋白表達，因此Caco-2細胞模型的跨膜轉(zhuǎn)運實驗，可以用來模擬藥物在體內(nèi)的經(jīng)小腸上皮吸收過程。本研究采用Caco-2單細?？稍诩毎缴咸峁┧幬锓肿油高^小腸黏膜的吸收、分布、代謝、轉(zhuǎn)運以及毒性的綜合信息。

中醫(yī)臨床上不少急癥處方有寒性熱性藥物合用，如治蛔厥腹痛的烏梅丸，治肝火內(nèi)郁、胃脘劇痛、嘔吐酸水的連附六一湯等，中藥“寒熱并用”在機體內(nèi)的作用機制如何，尚不完全清楚。本實驗借助寒熱藥性有代表性的附子配黃連為載體，通過建立Caco-2細胞模型，研究不同比例附子黃連配伍后在Caco-2細胞中的吸收與轉(zhuǎn)運機制，以探究的寒藥熱藥配伍后對機體的影響。附子味辛、甘，大熱，有毒，功效回陽救逆、補火助陽、散寒止痛。其中烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿被證實是附子發(fā)揮強心、抗炎、鎮(zhèn)痛功效的有效成分。黃連味苦性寒，能清熱燥濕，瀉火解毒，含有多種生物堿，其中主要生物堿為小檗堿。其具有廣譜抗生素的作用，在臨床上長期以來用于降熱鎮(zhèn)痛、抗腸道細菌感染。目前關于附子黃連配伍在細胞層面研究尚未見報道。鑒于二者配伍之主治多在胃腸，而Caco-2細胞又能模擬小腸上皮細胞之功能，故利用其研究甚為合適。

本文首次報道關于利用Caco-2細胞模型研究附子黃連不同配伍后的成分吸收變化。通過建立Caco-2細胞模型，研究不同比例附子黃連配伍后在Caco-2細胞中的吸收與轉(zhuǎn)運機制。實驗結果提示：鹽酸小檗堿、次烏頭堿作為附子黃連配伍后的主要有效成分，性質(zhì)穩(wěn)定，建立的檢測方法穩(wěn)定可靠，可作為檢測指標說明實驗結果。其次，小檗堿和次烏頭堿的轉(zhuǎn)運量大小依次為1∶1＞1∶2＞2∶1。結果顯示附子配黃連比例為1∶1最有利于有效成分的吸收及利用。與歷代方書中1∶1使用最多相合，證明了中醫(yī)歷代以來附子配黃連1∶1配伍的科學性，為臨床中附子黃連配伍比應用提供了實驗室依據(jù)。有實驗表明，單用黃連，其所含的小檗堿在胃腸道吸收不好［10］。在Caco-2細胞模型中藥物分子的Papp與口服吸收相關聯(lián)，因為Papp的大小直接反映藥物經(jīng)腸道的吸收能力。吸收良好藥物的Papp大于1×10-6cm/s，而吸收差的藥物，其Papp小于1×10-7cm/s［11］。本實驗中不同配比的附子配黃連中，小檗堿和次烏頭堿的Papp均大于1×10-6cm/s，說明附子配黃連用量比例1∶1、1∶2、2∶1均具有良好的口服吸收性。鹽酸小檗堿在藥對1∶1中表現(xiàn)為以主動轉(zhuǎn)運為主，在藥對1∶2、2∶1表現(xiàn)以被動轉(zhuǎn)運為主。提示附子配黃連的寒熱偏性對物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運方式有一定的影響，具體機制有待更深入研究。

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Research of Transmembrane Transport of Different Proportions of Fuzi（Aconitum carmichaeli debx.）with Huanglian（Coptis chinensis）in Caco-2 Cells Model

ZHOU Wangyang1，HE Xiuyun2，LIU Mengting2，et al. 1 The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310005，China；2 Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China

Objective：To study the absorption and transport condition of the main components of different proportions of Fuzi（Aconitum carmichaeli debx.）with Huanglian（Coptis chinensis）in Caco-2 cells model.Methods：The Caco-2 cells model and high performance liquid chromatography （HPLC）method were establish to study the absorption and transport condition when the aconite-coptis ratio was 1∶1，1∶2，2∶1.The transmembrane transport amount and the apparent permeability coefficients were calculated the influence of the 3 ratios of the two drugs on absorption and transport.Results：When the aconite-coptis ratio was 1∶1，1∶2，2∶1，respectively，the transmembrane transport amounts（μg）at 150min of berberine hydrochloride on AP→BL side are 0.625，0.161，0.055.On BL→AP side were 1.308，0.178，0.064，and the apparent permeability coefficients were 2.095，1.107，1.172，the transmembrane transport amounts（μg）at 150min of hypaconitine on AP→BL side were 0.634，0.401，0.204，on BL→AP side were 0.534，0.108，0.067，and the apparent permeability coefficients were 0.842，0.268，0.328.Conclusion：The aconite-coptis ratio of 1∶1 was better than the ratio of 1∶2 and 2∶1.It is proved the best clinical ratio.

Fuzi（Aconitum carmichaeli debx.）with Huanglian （Coptis chinensis）；Ratio；Caco-2 cell；Trans-membrane transport

R289.5

A

1004-745X（2015）05-0753-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.05.001

2015-02-01）

國家自然科學基金面上項目（81073067）

△通信作者（電子郵箱：ssc3631@163.com）