HBV感染的動(dòng)物模型研究進(jìn)展

楊煒峰，苗振川，宋希軍，尹 明

北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司，北京 100012

HBV是一種嗜肝的DNA 病毒，會(huì)引起人類急性或慢性肝炎。慢性乙型肝炎(CHB)是導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化和肝癌的重要原因[1]。

1965年，Blumberg等[2]在澳大利亞土著人檢測(cè)到HBsAg，稱為“澳大利亞抗原”。1970年，Dane等[3]通過電鏡檢測(cè)到HBV完整的病毒顆粒，稱為“丹氏顆?！薄BV有嚴(yán)格的種屬特異性，它的自然宿主限制在人類和非人靈長類動(dòng)物身上，包括黑猩猩(chimpanzees)、大猩猩(gorillas)、長臂猿(gibbons)和猩猩(orangutans)。這些非人靈長類動(dòng)物的研究，受到倫理和飼養(yǎng)等限制，只有很少的實(shí)驗(yàn)室有條件開展，并且黑猩猩在歐洲已被禁止用于實(shí)驗(yàn)研究[4]。直到2012年，李文輝團(tuán)隊(duì)[5]發(fā)現(xiàn)HBV感染肝細(xì)胞的關(guān)鍵受體，是鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NTCP)；穩(wěn)定表達(dá)人NTCP的HepG2細(xì)胞系(HepG2-NTCP，自然狀態(tài)下HepG2不能感染HBV)可以感染HBV。2016年，Lempp等[6]發(fā)現(xiàn)，小鼠肝細(xì)胞轉(zhuǎn)入人NTCP后可以支持HBV的進(jìn)入，但不能轉(zhuǎn)錄、翻譯和形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)。2017年，Lempp等[7]將食蟹猴、恒河猴和豬的肝細(xì)胞表達(dá)hNTCP，這些細(xì)胞變得HBV易感，效率與人肝細(xì)胞相當(dāng)。以上研究表明，不同物種間的差異，如肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、微環(huán)境和(共)受體，或者血液中的可溶性因子，影響了HBV的易感性和感染效率。這也從側(cè)面表明，HBV侵入、修復(fù)、cccDNA形成(非必須)、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、組裝、釋放、慢性感染和再復(fù)發(fā)機(jī)制的復(fù)雜性，特別是還未弄清楚造成物種間差異的原因，需要進(jìn)行更深入的基礎(chǔ)研究。

目前CHB抗病毒治療通過口服核苷(酸)類似物(NUCs)可抑制HBV復(fù)制，安全性高，但很少發(fā)生HBsAg清除及血清學(xué)轉(zhuǎn)換，停藥無期；只能在不到10%的CHB患者中實(shí)現(xiàn)“功能性治愈”。皮下注射聚乙二醇干擾素α(PEG-IFNα)可使10%～30%的患者清除HBeAg，并發(fā)生HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，兼具免疫調(diào)節(jié)特性；但耐受性差，存在不良反應(yīng)[8]。在研的抗HBV藥物或者療法分為兩類：(1)抑制或者沉默病毒的復(fù)制，如HBV進(jìn)入抑制劑、cccDNA及其轉(zhuǎn)錄活性抑制劑、基因表達(dá)抑制劑、核衣殼組裝和pgRNA包裝抑制劑、HBsAg分泌抑制劑、RNAi和Crispr/Cas技術(shù)敲除等；(2)激活或者誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，如免疫調(diào)節(jié)劑、干擾素、Toll樣(病原體識(shí)別受體)受體激動(dòng)劑、免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑、治療性疫苗和改造HBV特異性T淋巴細(xì)胞等[8-9]。理想的臨床前動(dòng)物模型既需要模型中有較高的HBV病毒含量，也需要相應(yīng)的免疫環(huán)境。遺憾的是，至今還沒有建立一個(gè)有效的模型，能夠真實(shí)地再現(xiàn)HBV感染的免疫和發(fā)病機(jī)制。由于鴨子、土撥鼠和樹鼩是非標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[4]，而hNTCP轉(zhuǎn)基因的食蟹猴、恒河猴和豬等模型還沒有成功的報(bào)道，本文主要綜述小鼠HBV模型的最新進(jìn)展(表1)，為臨床前HBV藥效實(shí)驗(yàn)和HBV相關(guān)研究提供參考。

表1 HBV感染的小鼠模型特征

1 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型

在HBV啟動(dòng)子或者小鼠肝細(xì)胞特異啟動(dòng)子(如白蛋白啟動(dòng)子Alb)的控制下，將編碼HBV蛋白的基因序列通過原核注射轉(zhuǎn)入到小鼠中，獲得表達(dá)HBV蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，如病毒包膜(envelope，S基因)[10-12]、核心(core，C基因)[13]、前核心(precore，preC基因)[14]和X基因[15-16]。這些模型對(duì)HBV的特性驗(yàn)證提供了重要的數(shù)據(jù)支持。隨后，有兩個(gè)研究小組[17-18]用全長或者超長的HBV全基因序列制成轉(zhuǎn)基因小鼠，然而僅在少數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠的器官中檢測(cè)到病毒復(fù)制和蛋白表達(dá)，其血清中病毒的滴度很低。

在乙型肝炎抗病毒藥物篩選方面應(yīng)用較多的轉(zhuǎn)基因小鼠模型是Guidotti等[19]研發(fā)的，其在 HBV 全長序列 5′末端重復(fù)一個(gè)C基因和X基因及其增強(qiáng)子，構(gòu)建了1.3倍全長 HBV 基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠。該小鼠血清中可檢測(cè)到 HBsAg、HBeAg 和 HBcAg，在小鼠體內(nèi)也檢測(cè)到完整病毒顆粒的形成，且病毒顆粒具有感染性。該轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟和腎臟中有高水平的HBV表達(dá)，外周血清中的 HBV DNA 拷貝數(shù)高達(dá) 107IU/ml，其HBV 抗原轉(zhuǎn)錄水平與CHB患者相當(dāng)，已經(jīng)成功用于HBV合成、轉(zhuǎn)錄，病毒組裝和成熟的病毒分泌等抑制藥物的藥效實(shí)驗(yàn)[20-22]。然而，由于轉(zhuǎn)基因模型中HBV整合在小鼠基因組上，是組成型表達(dá)(在胚胎期即表達(dá))，因而對(duì)HBV有天然的免疫耐受性，不適宜于進(jìn)行免疫病理學(xué)方面的研究。另外，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中包含了rcDNA(relaxed circular DNA)合成、轉(zhuǎn)錄，病毒組裝及成熟的病毒分泌，但未檢測(cè)到cccDNA形成，尚不清楚不能形成cccDNA的原因[23]。

為了解決HBV抗原免疫耐受的問題，王軍等[1]綜述了不同的方案，比如用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠與免疫缺陷小鼠(如SCID、TCRα-/-，和RAG1-/-等)雜交，構(gòu)建了免疫缺陷背景的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。這些小鼠缺失T和B淋巴細(xì)胞，給該小鼠過繼輸入相同遺傳背景的野生型小鼠脾臟細(xì)胞(T和B淋巴細(xì)胞)，使表達(dá)HBV的小鼠肝臟細(xì)胞暴露在重建的免疫系統(tǒng)中，得到了類似于人類的HBV感染模型，但其操作過程比較復(fù)雜，且與人類感染HBV后引起肝臟炎癥的自然病程相比仍有較大差別，表明鼠肝臟中存在與人肝臟細(xì)胞不同的特征，如存在不易感HBV的微環(huán)境或者結(jié)構(gòu)等。另一種解決HBV抗原免疫耐受問題的方法是通過基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，如Tet-on系統(tǒng)，在特定的時(shí)間及部位(肝臟)誘導(dǎo)HBV基因表達(dá)，但該類模型同樣存在肝炎特征與人類肝炎差別較大的問題。

2 HDI小鼠模型

利用瞬態(tài)水動(dòng)力機(jī)械地(高壓)將HBV DNA擠入肝細(xì)胞，可以導(dǎo)致短暫的HBV復(fù)制以及蛋白質(zhì)合成。2002年，Yang等[24]首次建立了HBV水動(dòng)力注射小鼠模型。在小鼠尾部靜脈，通過注入大量生理鹽水，相當(dāng)于小鼠體質(zhì)量的8%～10%，其中含有1.3倍HBV基因組DNA的質(zhì)粒，在很短的時(shí)間內(nèi)(5～8 s)注射到小鼠靜脈內(nèi)。但是隨著小鼠體內(nèi)HBV特異性抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的出現(xiàn)，血液中的HBV抗原通常在第7天消失；而肝臟HBV轉(zhuǎn)錄物在轉(zhuǎn)染后第15天被清除，與抗病毒抗體和抗病毒CD8+T淋巴細(xì)胞的出現(xiàn)相吻合。在NOD/SCID小鼠中缺乏功能性T和B淋巴細(xì)胞、HBV基因表達(dá)和復(fù)制可以持續(xù)超過81天，表明宿主的免疫反應(yīng)，特別是病毒特異性CTL反應(yīng)可能在抗HBV中起重要作用。

HDI小鼠模型是一種方便、可行的方法，直接用于不同基因型、變異或突變的HBV模型構(gòu)建。而且HBV基因組沒有整合到宿主基因組中，為研究HBV免疫反應(yīng)和發(fā)病機(jī)制提供了可能。然而，水動(dòng)力注射程序?qū)е聡?yán)重的肝損傷，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋復(fù)雜化，尤其是在免疫反應(yīng)和發(fā)病原因方面造成混淆[25]。另外，低的轉(zhuǎn)染效率(5%～10%)和持續(xù)時(shí)間短也限制了該模型的使用[26-27]。另外，小鼠的遺傳背景、年齡、性別和免疫系統(tǒng)狀態(tài)等也會(huì)影響HDI小鼠模型中HBV在體內(nèi)的持久性[24,28]。

3 AAV-HBV 轉(zhuǎn)染小鼠模型

2001年，Sprinzl等[29]開發(fā)了腺病毒載體攜帶1.3倍的鴨HBV基因組(Ad-DHBV)，經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)的方法。采用類似的方法，von Freyend等[30]將含有1.3倍HBV基因組的腺病毒載體(Ad-HBV)注射到C57BL/6小鼠體內(nèi)，在小鼠肝臟中檢測(cè)到3個(gè)月以上的HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。由于腺病毒載體很大，同時(shí)編碼一些非HBV病毒產(chǎn)物，這些產(chǎn)物也可能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)來清除HBV[31]。

肝細(xì)胞靶向AAV載體具有低免疫原性的特點(diǎn)，將AAV-HBV通過小鼠尾靜脈注射，成功建立了AAV-HBV小鼠模型[32-33]。這類模型可以持續(xù)產(chǎn)生HBV病毒顆粒和HBV抗原且1年以上無血清轉(zhuǎn)化，重現(xiàn)了臨床CHB患者的部分免疫學(xué)特征。因而，AAV-HBV模型也被用于評(píng)估新的基于免疫的療法和抗病毒治療[34]。目前常用的rAAV8-1.3HBV病毒載體，經(jīng)尾靜脈注射到野生 C57BL/6小鼠體內(nèi)，其表達(dá)水平隨重組病毒注射劑量的增加而升高，高劑量注射時(shí)可造成超過40%的肝細(xì)胞感染HBV，血清中HBV DNA可達(dá)105IU/ml。但要注意不同小鼠品系HBV感染的表型存在差別。

2017年Lucifora等[35]報(bào)道通過Southern印跡分析可檢測(cè)到AAV-HBV中存在cccDNA，然而這些cccDNA，是不是通過小鼠肝細(xì)胞中的rcDNA前體產(chǎn)生的仍不清楚，目前也無新的研究報(bào)道。另外在這些模型中，HBV的復(fù)制不是由cccDNA直接驅(qū)動(dòng)的，而且重組AAV基因組進(jìn)入體內(nèi)后，一部分可以形成大的多聚體并整合到宿主基因組中，從而使得這些模型與cccDNA的相關(guān)性降低[36]。盡管如此，AAV-HBV模型仍是用于評(píng)估免疫療法和抗病毒治療的主要模型。

4 cccDNA替代小鼠模型

HBV感染的人肝臟細(xì)胞中含有3.2 kb松弛環(huán)狀rcDNA，在細(xì)胞核中，rcDNA修復(fù)為cccDNA是病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制的起始模板。cccDNA轉(zhuǎn)錄的病毒前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)包裝入核衣殼，通過反轉(zhuǎn)錄起始病毒DNA合成，成熟的病毒核衣殼顆粒再次轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，完成細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制周期。HBV基因組高度壓縮，難以容納外源性序列[37]。已經(jīng)開發(fā)了多種途徑，通過體外重組生產(chǎn)cccDNA(recombinant cccDNA，rcccDNA)[38]，rcccDNA與野生病毒cccDNA具有較大相似性，能夠在細(xì)胞內(nèi)或體外系統(tǒng)大量誘導(dǎo)產(chǎn)生，是HBV研究的一類重要工具。

2014年Qi等[39]開發(fā)了一種基于HDI的重組cccDNA小鼠模型，通過Cre/loxP介導(dǎo)的DNA重組在體內(nèi)生成cccDNA。在HBV基因組兩側(cè)引入同向LoxP位點(diǎn)，由重組酶Cre 引發(fā)LoxP位點(diǎn)之間的DNA重組和環(huán)化，生成含有單拷貝LoxP位點(diǎn)的rcccDNA；LoxP位點(diǎn)則位于一段約90 bp的外源性內(nèi)含子中(HBsAg基因近5′端)，可在RNA轉(zhuǎn)錄過程中移除，實(shí)現(xiàn)所謂的無縫插入。然而，該模型中病毒復(fù)制水平較低，體內(nèi)持續(xù)時(shí)間較短，可能是由于轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Cre依賴性重組酶激活了免疫系統(tǒng)。另外兩個(gè)含DNA的細(xì)菌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，重組效率低，導(dǎo)致cccDNA轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞非常低。傳統(tǒng)的含有DNA的細(xì)菌質(zhì)粒，導(dǎo)致體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的快速轉(zhuǎn)錄沉默，即使載體DNA仍然保留在細(xì)胞中。Kay等[40]開發(fā)了一種PhiC31整合酶介導(dǎo)的分子內(nèi)重組技術(shù)，以制備無細(xì)菌主鏈的微型環(huán)載體DNA，可在體外和體內(nèi)表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)基因?；诖竽c桿菌PhiC31重組酶誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，建立了一種體外誘導(dǎo)rcccDNA attR微環(huán)產(chǎn)生和純化的策略，純化的rcccDNA attR微環(huán)具超螺旋結(jié)構(gòu)，能夠支持功能性的HBV復(fù)制和抗原表達(dá)。由于rcccDNA編碼中包含外源內(nèi)含子序列，應(yīng)用引物特異性PCR方法易于與HBV DNA復(fù)制中間體及從頭合成的新生cccDNA區(qū)分。最近，在采用復(fù)制缺陷腺病毒載體將rcccDNA轉(zhuǎn)入肝臟特異的Cre小鼠中檢測(cè)到HBV的時(shí)間超過62周[41]。在小鼠肝臟中，觀察到了持續(xù)壞死性炎癥反應(yīng)、纖維化和肝硬化等病理學(xué)特征，與臨床慢性肝炎相似。Yan等[42]發(fā)表的文章中，將39 bp的attR位點(diǎn)設(shè)計(jì)插入在HBV多聚酶基因的spacer區(qū)(PreS1起始密碼子前)，顯示并不影響病毒復(fù)制。通過免疫正常的小鼠尾靜脈HDI注射rcccDNA，可短期誘導(dǎo)HBV抗原血癥(平均5～7周)，與急性HBV感染相似。他們比較了C3H/HeN、FVB/N和CBA/J三種小鼠，其中C3H/HeN小鼠感染率最高，半數(shù)以上小鼠體內(nèi)HBV復(fù)制持續(xù)1年以上。cccDNA替代模型可用于研究慢性病的免疫反應(yīng)和發(fā)病機(jī)制，這也有助于評(píng)估cccDNA靶向抗病毒藥物策略。然而，由于這類模型仍是小鼠的肝臟細(xì)胞，不涉及HBV的入侵、擴(kuò)散和再傳染的過程，仍不能替代人鼠嵌合肝臟人源化小鼠模型。

5 人鼠嵌合肝臟小鼠模型

通過小鼠的脾臟異種移植人原代肝細(xì)胞(primary human hepatocytes，PHH)，可以整合到免疫缺陷的肝損傷小鼠的肝實(shí)質(zhì)中。這樣獲得的人鼠嵌合肝臟小鼠可以更好的模擬HBV自然感染和cccDNA復(fù)制過程。目前，文獻(xiàn)報(bào)道或商品化的主要有5種人源化肝臟小鼠模型(表2)。

表2 人鼠嵌合肝臟小鼠(人源化肝臟模型)模型

5.1 uPA-SCID小鼠 尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)在細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程中發(fā)揮重要作用。uPA系統(tǒng)包括uPA、uPA受體和它的2種抑制劑——纖維蛋白溶酶原激活質(zhì)抑制物PAI-1和PAI-2。纖溶酶通過直接或間接激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)來降解細(xì)胞外基質(zhì)和層黏連蛋白、纖維連接蛋白、纖維蛋白聚糖、Ⅳ型膠原等基膜成分。uPA 參與多種生理和病理過程，在肝臟再生過程中uPA 通過激活纖溶酶清除壞死的細(xì)胞，并且能夠降解胞外基質(zhì)促進(jìn)肝小葉結(jié)構(gòu)的重建。早在1991年Sandgren等[43]就做出了Alb-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠，由于uPA的肝毒性，Alb-uPA小鼠在出生4天就會(huì)出現(xiàn)出血癥狀。2000年Weglarz等[44]作了改進(jìn)，制作了MUP-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠，使用MUP增強(qiáng)子/啟動(dòng)子在肝細(xì)胞中特異性表達(dá)uPA，用來研究肝細(xì)胞移植。與Alb-uPA類似，由于基因丟失，uPA的表達(dá)會(huì)逐漸降低；不同的是MUP-uPA小鼠要到2～4周之后才會(huì)開始表達(dá)uPA，從而降低新生小鼠的病死率。MUP-uPA小鼠的人源化肝臟重建水平比較低。2004年，Tateno等[45]報(bào)道了uPA-SCID小鼠，可以高水平人源化重建小鼠肝臟。uPA-SCID小鼠需要在出生后2周內(nèi)重建肝臟，繁殖比較困難，屬于不能調(diào)控的肝損傷模型。

5.2 FRG小鼠 2007年，Azuma等[46]報(bào)道了FRG小鼠，即將延胡索乙酰乙酸水解酶基因(fumarylacetoacetate hydrolase，F(xiàn)ah)敲除小鼠回交到Rag2-/-&Il2rg-/-敲除的高度免疫缺陷背景，可以實(shí)現(xiàn)高水平的人源化重建。小鼠Fah基因敲除后，酪氨酸在體內(nèi)代謝障礙，造成延胡索乙酰乙酸(fumaryl acetoacetate，F(xiàn)AA)積累，從而引起肝細(xì)胞的損傷。NTBC是4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶的抑制劑，可以阻止FAA的積累，服用NTBC可以有效地改善酪氨酸血癥的癥狀。FRG小鼠繁育時(shí)喂飼低酪氨酸日糧或者飲水補(bǔ)充NTBC。若需要肝損傷重建時(shí)，可以逐步撤去NTBC，屬于可調(diào)控肝損傷模型。

5.3 TK-NOG小鼠 TK-NOG小鼠是另一種誘導(dǎo)性肝損傷模型，由白蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)單純皰疹病毒肝特異性表達(dá)病毒1型胸苷激酶(HSVtk)，然后回交到NOD/Shi scid小鼠背景[47]。因?yàn)殛栃孕凼蟛挥@個(gè)模型擴(kuò)繁困難。

5.4 AFC8小鼠 2011年，Washburn等[48]報(bào)道了一種在Alb啟動(dòng)子之后表達(dá)融合蛋白FK506結(jié)合蛋白(FKBP)和caspase8的轉(zhuǎn)基因小鼠(AFC8)，該小鼠模型受到AP20187(一種二聚體FKBP)選擇性調(diào)控，然后通過回交的方式獲得了Balb/C Rag2-/-&Il2rg-/-背景的AFC8小鼠。這個(gè)模型的人源化肝重建水平比較低(約30%)。

5.5 URG?小鼠 該模型是國內(nèi)最早的人源化肝臟小鼠模型。URG小鼠由4種基因修飾動(dòng)物模型交配獲得，包含2個(gè)轉(zhuǎn)基因和2個(gè)基因敲除。其核心模型源于2009年Song等[49]構(gòu)建了TRE-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠和Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠，然后交配獲得了Alb-rtTA/TRE-uPA雙陽性小鼠；通過Dox誘導(dǎo)，在該小鼠中檢測(cè)到uPA表達(dá)和肝損傷。北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司的研發(fā)人員將Alb-rtTA/TRE-uPA雙陽性小鼠連續(xù)8代回交到NRG(NOD背景Rag2null/ Il2rgnull小鼠)背景，2012年獲得Alb-rtTA/ TRE-uPA/Rag2null/Il2rgnull小鼠。作為新一代的可調(diào)控肝損傷人源化肝臟小鼠模型，人源肝臟細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)高達(dá)95%整肝重建，滿足HBV藥物的藥效、藥代和藥動(dòng)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)需要。使用該模型，也發(fā)表了一系列高水平研究論文[50-53]。

宿主免疫應(yīng)答在HBV感染中起著至關(guān)重要的作用，然而上面5種人鼠嵌合肝臟小鼠，均為高度免疫缺陷背景，無法直接用于HBV特定的免疫和炎性反應(yīng)研究。Washburn等[48]開發(fā)了一種人源化小鼠模型(AFC8-hu-HSC/Hep小鼠)，共移植人CD34+造血干細(xì)胞(HSC)與肝細(xì)胞祖細(xì)胞進(jìn)入新生(出生后第1周內(nèi))的轉(zhuǎn)基因小鼠，同時(shí)具有人類免疫系統(tǒng)和人的肝細(xì)胞。但是這個(gè)模型人肝細(xì)胞重建水平低，也未檢測(cè)到抗原特異性B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。2014年，這個(gè)小組建立了A2/NSG/Fas hu-HSC/Hep雙人源化小鼠模型(人HLA-A2轉(zhuǎn)基因的NSG小鼠)，人HLA-A2轉(zhuǎn)基因促進(jìn)人MHC限制性T淋巴細(xì)胞的發(fā)育；小鼠特異性抗Fas激動(dòng)劑治療抗體(JO2)支持人體免疫細(xì)胞和肝細(xì)胞的再增殖[54]。A2/NSG/Fas hu-HSC/Hep小鼠可支持持續(xù)性HBV感染(>4個(gè)月)與HBV特異性人類免疫有關(guān)的肝纖維化；而且在HBV感染的嵌合肝臟中，觀察到活化的人M2樣巨噬細(xì)胞聚集，這與HBV引起的急性和慢性感染相似。但是，該模型移植的細(xì)胞來源于流產(chǎn)胎兒組織，存在倫理問題的限制。2015年,Strick-Marchand等[55]報(bào)道，使用BRGS-uPA小鼠(BALB/c Rag2-/-&Il2rg-/-NOD.sirpa uPAtg/wt)實(shí)現(xiàn)了更高水平的雙人源化重建。在BRGS-uPA小鼠出生后(<1周齡)輻照并移植CD34+造血干細(xì)胞重建人源性免疫系統(tǒng)；在4～8周時(shí)移植成年人肝細(xì)胞重建肝臟。嵌合肝臟重建水平可以達(dá)到20%～50%，且在嵌合肝臟中檢測(cè)到了多種免疫細(xì)胞亞群，可以檢測(cè)到幼稚的T淋巴細(xì)胞(CD45RA+)和成熟的B淋巴細(xì)胞，以及人源的Igs抗體。盡管人類HSC和人肝細(xì)胞的HLA不匹配，但未觀察到任何移植物排斥反應(yīng)。由于肝細(xì)胞移植是在HSC注射后4～8周內(nèi)進(jìn)行，即在成熟T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)在外周器官之前，研究人員推測(cè)肝細(xì)胞產(chǎn)生的同種異體抗原，呈現(xiàn)給發(fā)育中的胸腺細(xì)胞，使其具有耐受性；另一個(gè)解釋是肝臟微環(huán)境的耐受性，肝內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞可以將免疫應(yīng)答向免疫調(diào)節(jié)表型傾斜，從而保護(hù)肝細(xì)胞免受免疫攻擊。在HBV肝細(xì)胞感染期間，免疫反應(yīng)在介導(dǎo)病毒根除或持續(xù)存在中起著重要作用。這種新型的雙人源化模型可能是研究單感染和共感染免疫反應(yīng)的一個(gè)合適的平臺(tái)，可以應(yīng)用于測(cè)試新的治療策略或候選疫苗。2019年Yuan等[56]使用FRGS小鼠(Fah-/-Rag2-/-IL-2R-/-SCID)移植了人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)，可以轉(zhuǎn)分化為雙人源化小鼠模型(hBMSC-FRGS)，但重建水平比較低。盡管肝臟和免疫雙人源化小鼠模型理論上是完美的模型，目前仍受到生產(chǎn)困難、高成本和一系列倫理等因素限制。

6 小結(jié)

不清楚造成HBV嚴(yán)格種屬特異性的原因，因而HBV動(dòng)物模型都存在各自的優(yōu)勢(shì)和不足。盡管如此，這些模型可以部分模擬HBV感染患者的特征，合理的選擇這些模型，將有助于加快藥篩進(jìn)程、驗(yàn)證新療法和更快解決HBV生物學(xué)發(fā)病機(jī)制等方面的問題。由于HBV發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，已經(jīng)有研究表明，宿主因素影響HBV的感染。如許多基因(如HLA和IL-4)的遺傳多態(tài)性會(huì)影響抗原呈遞或細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而影響抗體的產(chǎn)生，導(dǎo)致對(duì)疫苗接種的反應(yīng)程度不同。NTCP的多態(tài)性可能決定HBV進(jìn)入的過程。宿主因素也可能影響先天性和適應(yīng)性免疫，包括巨噬細(xì)胞的激活和吞噬、APCs的抗原呈遞以及HBV特異性T淋巴細(xì)胞的啟動(dòng)和功能，從而影響HBV的清除和持續(xù)性。人類相關(guān)基因的遺傳多態(tài)性可以直接或間接地決定這些免疫功能。例如，目前的人源化NTCP轉(zhuǎn)基因或者定點(diǎn)敲入KI模型，只能實(shí)現(xiàn)HDV的瞬時(shí)感染，不能實(shí)現(xiàn)HBV的感染。如果，通過人源化導(dǎo)入HBV的受體和HBV關(guān)鍵易感基因，實(shí)現(xiàn)小鼠肝細(xì)胞對(duì)HBV的易感性并產(chǎn)生cccDNA，必將促進(jìn)HBV小鼠模型臨床前模型質(zhì)的飛躍。相信隨著研究的進(jìn)一步突破，將會(huì)有更理想的HBV臨床前模型出現(xiàn)，為最終治愈乙型肝炎提供幫助。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：楊煒峰、苗振川、宋希軍負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)論文框架，起草論文，整理數(shù)據(jù)和修訂論文；尹明負(fù)責(zé)終審論文。