雜交蘭無菌播種及根狀莖培養(yǎng)技術(shù)研究

林榕燕 陳藝荃 林兵

摘 要：以雜交蘭品種臺(tái)北小姐與小葉虎頭蘭雜交果莢、臺(tái)北小姐自交果莢作為材料，比較了不同活性炭濃度對(duì)其種子萌發(fā)的影響，以及二者種子萌發(fā)形成的根狀莖在同一種培養(yǎng)基中的增殖與分化情況。結(jié)果表明：添加活性炭1.0 g·L-1的培養(yǎng)基較適宜臺(tái)北小姐自交組合種子無菌萌發(fā)，而臺(tái)北小姐與小葉虎頭蘭雜交組合種子無菌萌發(fā)較適宜的培養(yǎng)基則為不添加活性炭;在1/2 MS+6

BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1培養(yǎng)基中，臺(tái)北小姐自交組合根狀莖的增殖效果較好，而臺(tái)北小姐與小葉虎頭蘭雜交組合根狀莖分化較好。

關(guān)鍵詞：雜交蘭; 無菌播種; 根狀莖; 增殖; 分化

Abstract： By taking the hybrid fruit pod of Taibeixiaojie and Cymbidium hookerianum a kind of cymbidium hybrid， and the self-pollinated fruit pod of Taipeixiaojie as the materials， the effects of different concentrations of activated carbon on the seed germination were compared. And the proliferation and differentiation of rhizomes formed by their seed germination in the same culture medium were also compared. The results showed that the culture medium with 1.0 g·L-1 activated carbon was suitable for the sterile germination of the seeds of self-pollinated combination of Taibeixiaojie， while the culture medium with no activated carbon was suitable for the sterile germination of the seeds of hybrid combination of Taibeixiaojie and Cymbidium hookerianum. Moreover， the culture medium with 1/2 MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+no activater carbon 1.0 g·L-1 had better effect on the rhizome proliferation of self-pollinated combination of Taibeixiaojie， while it had better effect on the rhizome differentiation of hybrid combination of Taibeixiaojie and Cymbidium hookerianum.

Key words： Cymbidium hybrid; Sterile sowing; Rhizome; Proliferation; Differentiation

雜交蘭Cymbidium hybrid是由國蘭與大花蕙蘭雜交培育而成的蘭花新品種，兼有國蘭的清新花香和大花蕙蘭的花大色艷、花期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，具有較高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。近年來，一些品質(zhì)優(yōu)良的雜交蘭品種，如臺(tái)北小姐、韓國桃花、黃金小神童等，在市場(chǎng)交易中都有著不俗的表現(xiàn)[2]。然而雜交蘭的種子細(xì)小，雜種胚經(jīng)常發(fā)育不良、幾乎無胚乳，自然條件下種子萌發(fā)困難[2-3]。傳統(tǒng)的分株繁殖速度較慢，難以滿足市場(chǎng)需求，現(xiàn)階段多采用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)雜交蘭進(jìn)行快速繁殖[4-7]，但不同品種、不同發(fā)育階段所需的培養(yǎng)基配方存在明顯差異。因此，開展不同品種雜交蘭無菌播種、根狀莖增殖與分化的研究，可為雜交蘭新品種選育奠定理論基礎(chǔ)。為此，本研究以雜交蘭臺(tái)北小姐自交獲得的成熟果莢，臺(tái)北小姐與小葉虎頭蘭雜交獲得的成熟果莢為材料，通過組織培養(yǎng)手段，對(duì)雜交蘭進(jìn)行種子無菌播種，促使種子萌發(fā)獲得根狀莖，并探討根狀莖增殖、分化培養(yǎng)條件，以期探究雜交蘭誘導(dǎo)、增殖與分化效果的最適宜條件。

1 材料與方法

1.1 材料

以雜交蘭臺(tái)北小姐Cymbidium hybrid Mrs.Tai-bei自交獲得的成熟果莢（授粉后198 d）、臺(tái)北小姐與小葉虎頭蘭雜交獲得的成熟果莢（授粉后196 d）為供試材料，從其蒴果中收集種子作為外植體進(jìn)行種子無菌萌發(fā)（圖1）。材料來源于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所蘭花種質(zhì)資源圃，試驗(yàn)在福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心花卉育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 將采收的未開裂果莢先用無菌水沖洗2次，在超凈工作臺(tái)中用手術(shù)刀削除柱頭及表皮病蟲斑，再用70%酒精浸泡45 s，隨后放入0.1%升汞溶液中浸泡消毒10 min（浸泡過程中要不時(shí)搖晃容器，使消毒更充分），緊接著用無菌水沖洗4次，再用無菌紙吸干水分，在接種盤上切開果莢，將種子均勻撒播在培養(yǎng)基表面。

1.2.2 種子萌發(fā)培養(yǎng) 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，通過添加不同濃度的活性炭，設(shè)置3個(gè)水平，分別為0、0.5和1.0 g·L-1，每個(gè)處理3次重復(fù)，并附加6BA 2.0 mg·L-1、NAA 1.0 mg·L-1、白糖20 g·L-1、瓊脂粉6.0 g·L-1，pH 5.8，對(duì)種子進(jìn)行無菌萌發(fā)，接種120 d后觀察種子的萌發(fā)情況。

1.2.3 根狀莖增殖與分化培養(yǎng) 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)相近的種子萌發(fā)形成的根狀莖，在無菌條件下分切成長(zhǎng)0.6～0.8 cm的切段，接種于1/2 MS+6BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂8.0 g·L-1+活性炭1.0 g·L-1的增殖和分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)50 d后觀測(cè)根狀莖增殖與分化情況，計(jì)算增殖系數(shù)和芽分化率（%）。計(jì)算公式：增殖系數(shù)=新長(zhǎng)出根狀莖數(shù)量/接種根狀莖數(shù)量，芽分化率=（分化出芽體的根狀莖數(shù)/接種根狀莖數(shù)）×100%。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子無菌萌發(fā)

臺(tái)北小姐自交組合種子在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)4個(gè)月后陸續(xù)有綠色芽點(diǎn)出現(xiàn)，芽點(diǎn)似球狀突起。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，球狀突起不斷伸長(zhǎng)，形成了根狀莖（圖2A）。從表1可以看出，采用不同培養(yǎng)基配方，萌發(fā)效果各異，隨著活性炭濃度的增加，種子萌發(fā)效果越好，添加活性炭1.0 g·L-1的培養(yǎng)基較有利于種子萌發(fā)。

臺(tái)北小姐與小葉虎頭蘭雜交組合種子在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)4個(gè)月后同樣有綠色芽點(diǎn)出現(xiàn)，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)育成根狀莖（圖2B），同時(shí)出現(xiàn)部分分化成苗的現(xiàn)象（圖2C）。從表2可以看出，培養(yǎng)基中活性炭添加濃度越高，種子萌發(fā)效果越弱，未添加活性炭的培養(yǎng)基對(duì)其種子萌發(fā)的效果較好。

2.2 根狀莖增殖與分化培養(yǎng)

將無菌萌發(fā)階段獲得的根狀莖作為增殖培養(yǎng)材料，利用1/2 MS+6BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂8.0 g·L-1+活性炭1.0 g·L-1培養(yǎng)基，研究其對(duì)臺(tái)北小姐自交組合、臺(tái)交小姐與虎頭蘭雜交組合根狀莖增殖與分化的影響。從表3可以看出，對(duì)于根狀莖增殖效果來說，臺(tái)北小姐自交組合根狀莖增殖效果較好（圖3A），增殖系數(shù)可達(dá)4.73;而對(duì)根狀莖分化效果來說，臺(tái)北小姐與小葉虎頭蘭雜交組合根狀莖分化效果較好（圖3B），芽分化率可達(dá)88.3%。

3 小結(jié)

蘭科植物雜交種子通過無菌播種，在短期內(nèi)獲得其后代植株，是目前蘭屬雜交育種過程中應(yīng)用較為廣泛的一種快速繁殖方式。建立經(jīng)濟(jì)有效的離體培養(yǎng)體系是蘭屬雜交育種成功的關(guān)鍵途徑之一。本試驗(yàn)篩選出臺(tái)北小姐自交組合種子無菌萌發(fā)較適宜的培養(yǎng)基配方1/2MS+6BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+活性炭1.0 g·L-1;臺(tái)北小姐與小葉虎頭蘭雜交組合種子無菌萌發(fā)較適宜的培養(yǎng)基為1/2MS+6BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1，說明雜交蘭臺(tái)北小姐自交組合、臺(tái)北小姐與虎頭蘭雜交組合種子萌發(fā)適宜的培養(yǎng)基配方不同。通過比較臺(tái)北小姐自交組合、臺(tái)北小姐與虎頭蘭雜交組合在同一培養(yǎng)基中根狀莖增殖和分化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1/2MS+6BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂8.0 g·L-1+活性炭1.0 g·L-1培養(yǎng)基更有利于臺(tái)北小姐自交組合的增殖，更適合用于臺(tái)北小姐與小葉虎頭蘭雜交組合根狀莖分化。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）