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    菊葉香藜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中FPPS基因的挖掘與生物信息學(xué)分析

    2019-09-10 07:22:44付蘇宏雷鳴張勇群施靜郝豆豆
    廣西植物 2019年6期
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)錄組生物信息學(xué)

    付蘇宏 雷鳴 張勇群 施靜 郝豆豆

    摘 要:為深入了解菊葉香藜法尼基焦磷酸合酶基因,該研究對菊葉香藜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行挖掘,獲取了兩條FPPS基因序列(DsFPPS1和DsFPPS2),并對DsFPPS1和DsFPPS2編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能、系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:DsFPPS1和DsFPPS2基因分別包含1 029 bp和969 bp的開放閱讀框,分別編碼342個(gè)(DsFPPS1)和322個(gè)(DsFPPS2)氨基酸。DsFPPS1和DsFPPS2位于線粒體內(nèi),未發(fā)現(xiàn)信號肽和跨膜結(jié)構(gòu),DsFPPS1為穩(wěn)定蛋白,DsFPPS2為不穩(wěn)定蛋白。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)DsFPPS1和DsFPPS2序列相似性為60.53%,均含有5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域和2個(gè)天冬氨酸富集區(qū)域。DsFPPS1和DsFPPS2二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋構(gòu)成,三級結(jié)構(gòu)為由8個(gè)α-螺旋形成的α-螺旋束,但DsFPPS2的三級結(jié)構(gòu)中缺少一個(gè)α-螺旋A。系統(tǒng)進(jìn)化樹中DsFPPS1與藜科植物聚為一枝,與藜科植物遺傳距離較近,而DsFPPS2單獨(dú)聚為一枝。通過對菊葉香藜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中FPPS基因的挖掘與生物信息學(xué)分析,為菊葉香藜FPPS的功能研究及其倍半萜類化合物的生物合成研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:法尼基焦磷酸合酶, 轉(zhuǎn)錄組, 菊葉香藜, 基因挖掘, 生物信息學(xué)

    中圖分類號:Q943.2

    文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    文章編號:1000-3142(2019)06-0831-12

    Abstract:Dysphania schraderiana, in the Chenopodiaceae family, is widely distributed in Lhasa (Tibet, China) and used as a traditional medicine. The essential oil of Dysphania schraderiana? contains abundant sesquiterpenes compounds, appeared to possess potential medicinal value. Farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS) is a key branch-point enzyme in biosynthesis of terpene. In order to reveal D. schraderiana FPPS gene, the transcriptome database of D. schraderiana was mined and two gene sequences (DsFPPS1 and DsFPPS2) were obtained in this research. Subsequential protein physicochemical property, architectural feature, function and phylogeny relationship analysis of DsFPPSs were also predicted and analyzed. The results showed that DsFPPS1 and DsFPPS2 sequences contained an ORF span of 1 029 bp and 969 bp respectively, encoding 342 (DsFPPS1) and 322 (DsFPPS2) amino acids respectively. The analysis of amino acid composition showed that the dominant components of DsFPPS1 and DsFPPS2 were both nonpolar amino acids. The molecular weight of DsFPPS1 and DsFPPS2 were 39.68 kD and 36.76 kD, respectively. Isoelectric point were 5.11 and 5.65 for DsFPPS1 and DsFPPS2, respectively. Besides, DsFPPS1 protein was predicted to be a stable protein, but DsFPPS2 protein was predicted to be an unstable protein. The amino acid sequence analysis showed that DsFPPS1 and DsFPPS2 had no signal peptide and transmembrane region. The possible localization of DsFPPS1 and DsFPPS2 was both in mitochondria. DsFPPS1 and DsFPPS2 protein exhibited 60.53% sequence identity, and possessed five conserved domain (Ⅰ-Ⅴ) and two characteristic Asp-rich motifs (DDXXD). The amino acid sequence of DsFPPS1 had higher homology with Chenopodium quinoa, Spinacia oleracea and Beta vulgaris than DsFPPS2. In addition, the secondary structure of DsFPPS proteins mainly consisted of α-helixes, which resulted in a bundle of 8 α-helices in tertiary structure. However, tertiary structure analysis showed that DsFPPS2 protein missed an α-helix compared to DsFPPS1 protein. The result of phylogenetic analysis indicates that phylogenetic relationships of DsFPPS1 protein are close to Chenopodiaceae plants consistent with sequence alignment results, while DsFPPS2 protein is clustered alone in phylogenetic tree. In general, these results provides a certain reference for an insight to molecular function of DsFPPS and the synthetic biology of sesquiterpenes in D. schraderiana.

    Key words:farnesyl pyrophosphate synthase, transcriptome, Dysphania schraderiana, gene mining, bioinformatics

    菊葉香藜(Dysphania schraderiana)系藜科刺藜屬植物,全草入藥,具有平喘解痙、解毒、解表、止痛、止癢等功效,是我國傳統(tǒng)的藥用植物?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)菊葉香藜精油具有廣泛的生物活性,本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)菊葉香藜精油對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長具有顯著抑制作用,且呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性;此外菊葉香藜精油可濃度依賴性地抑制昆蟲玉米象的活力(雷鳴等, 2015);現(xiàn)已有利用菊葉香藜精油治理植物螨蟲的專利(劉志龍等, 2015)。本課題組前期研究中利用GC-MS檢測了菊葉香藜精油的化學(xué)成分,除了精油中大量的脂肪族化合物(54.232%)外,倍半萜類化合物占有較大的比例(26.846%)。

    倍半萜是一類包含有15個(gè)碳原子的天然化合物,即包含有3個(gè)異戊二烯單元,具有多種結(jié)構(gòu)類型,是新藥研發(fā)的主要來源之一(王佳等, 2012)。植物萜類化合物主要是由細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸(MVA)途徑和質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑合成,這兩條途徑生成萜類化合物的共同前體異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallylpyrophosphate,DMAPP),隨后一分子的IPP和一分子的DMAPP結(jié)合生成香葉基二磷酸(geranyl diphosphate,GPP),一分子的GPP和一分子的IPP在法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase, FPPS)的作用下生成倍半萜類化合物的前體物質(zhì)法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP),F(xiàn)PP再在多種倍半萜合酶的作用下生成結(jié)構(gòu)多樣的倍半萜化合物(孫麗超等, 2017)。

    植物FPPS由基因家族編碼,通常有多個(gè)FPPS亞型,如擬南芥含有FPPS1和FPPS2兩個(gè)基因,編碼3個(gè)FPPS亞型:FPPS1S、FPPS1L和FPPS2,同時(shí)敲除兩條FPPS基因會(huì)造成植物死亡,單個(gè)基因敲除不會(huì)對植物生長發(fā)育造成影響,這種多基因模式可保證某一基因受損時(shí)植物仍能正常生存,但不同的亞型仍然具有不同的表達(dá)模式與活性,擬南芥FPS1存在于植物整個(gè)生命周期,F(xiàn)PS2則主要在種子生長發(fā)育階段發(fā)揮作用(Closa et al., 2010;趙麗等,2018),且FPS2具有更強(qiáng)的催化活性和熱穩(wěn)定性,對氯化鈉的抑制作用更敏感(Keim et al., 2012)。

    FPPS是萜類化合物生物合成分支點(diǎn)的關(guān)鍵酶,催化生成重要的中間產(chǎn)物FPP進(jìn)而合成倍半萜類化合物。鑒于FPPS在倍半萜類化合物生物合成途徑中的重要性,而目前尚未見菊葉香藜FPPS基因的研究報(bào)道。因此,為了深入探討菊葉香藜的FPPS,本研究對菊葉香藜花和葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行挖掘以獲取菊葉香藜FPPS (DsFPPS)基因,并利用生物信息學(xué)的方法對該基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)特征、功能以及系統(tǒng)進(jìn)化方面進(jìn)行分析和預(yù)測,為今后深入研究該酶的結(jié)構(gòu)和功能奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    菊葉香藜的兩條FPPS基因來自于實(shí)驗(yàn)室前期菊葉香藜轉(zhuǎn)錄組研究,花組織轉(zhuǎn)錄組與葉組織轉(zhuǎn)錄組在SRA (Sequence Read Archive)數(shù)據(jù)庫中的登錄號分別為SRX3145242和SRX3145241,其余物種相關(guān)的FPPS蛋白序列均來自NCBI (National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫,物種及序列信息如下:藜麥(Chenopodium quinoa) (CqFPPS:XP_021740746.1)、菠菜(Spinacia oleracea) (SoFPPS:XP_021846881.1)、甜菜(Beta vulgaris) (BvFPPS:XP_010675977.1)、野茶樹(Camellia sinensis) (CsFPPS:ANA11766.1)、杧果(Mangifera indica) (MiFPPS:AFJ52720.1)、蓖麻(Ricinus communis)(RcFPPS:AMN82836.1)、橡膠樹(Hevea brasiliensis)(HbFPPS:ANJ77846.1)、大戟(Euphorbia pekinensis)(EpFPPS:ACN63187.1)、人參(Panax ginseng)(PgFPPS:AAY87903.1)、竹節(jié)參(P. japonicas)(PjFPPS:AKN52395.1)、三七(P. notoginseng)(PnFPPS:AGS79228.1)、常春藤(Hedera helix)(HhFPPS:APV45530.1)、西洋參(Panax quinquefolius)(PqFPPS:ADJ68004.1)、薄荷(Mentha x piperita)(MpFPPS:AAK63847.1)、撒爾維亞(Salvia officinalis)(SolFPPS:AQY54371.1)、丹參(S. miltiorrhiza)(SmFPPS:ABV08819.1)、狹葉薰衣草(Lavandula angustifolia)(LaFPPS:AGQ04160.1)、米團(tuán)花(Leucosceptrum canum)(LcFPPS:ALT07952.1)、黃芪(Astragalus membranaceus)(AmFPPS:AID51444.1)、甘草(Glycyrrhiza uralensis)(GuFPPS:ADE18770.1)、紫苜蓿(MsFPPS:ADC32809.1)、里氏木霉菌(Trichoderma reesei)(TrFPPS:AFX82678.1)、新月金孢子菌(Emmonsia crescens)(EcFPPS:POS87336.1)、地衣芽孢桿菌(E. crescens)(BlFPPS:ARC74194.1)、莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)(RHcFPPS:ADE44162.1)、牛(Bos taurus)(BtFPPS:AAL58886.1)、黑猩猩(Pan troglodytes)(PtFPPS:JAA28793.1)。

    1.2 分析方法

    1.2.1 蛋白基本性質(zhì)分析 開放閱讀框(ORF)通過GenBank的在線軟件ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進(jìn)行查找。獲取基因所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列后,運(yùn)用多種在線軟件分析、預(yù)測蛋白的相關(guān)信息:蛋白的理化性質(zhì)利用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行分析;蛋白的親/疏水性分析應(yīng)用在線軟件ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/);蛋白的信號肽分析應(yīng)用在線工具SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/);蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測應(yīng)用在線程序TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/);蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測運(yùn)用在線軟件Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)。

    1.2.2 蛋白結(jié)構(gòu)特征與功能分析 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)運(yùn)用在線SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)軟件進(jìn)行預(yù)測;蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)運(yùn)用Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)在線軟件進(jìn)行預(yù)測;利用在線數(shù)據(jù)庫CDD (Conserved Domain Database) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)進(jìn)行保守位點(diǎn)分析。

    1.2.3 蛋白氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 用NCBI中的BLASTP (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)模塊進(jìn)行不同物種FPPS氨基酸序列的在線搜索,用ClustalW進(jìn)行多條FPPS氨基酸序列比對。采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建FPPS氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹,使用自展值(Bootstrap)重復(fù)檢驗(yàn)1 000次,系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建和檢驗(yàn)通過本地軟件MEGA 7.0.14實(shí)施。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菊葉香藜FPPS基因挖掘

    通過對菊葉香藜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中核酸序列進(jìn)行比對和功能注釋,挖掘得到兩條編號分別為c13053_g1和c12747_g1的FPPS候選基因,分別重命名為DsFPPS1和DsFPPS2。DsFPPS1長度為1 257 bp,其互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄翻譯為FPPS蛋白,開放閱讀框?yàn)? 029 bp,開放閱讀框?qū)?yīng)到DsFPPS1的位置為1 185~155 bp,編碼342個(gè)氨基酸,編碼蛋白命名為DsFPPS1;DsFPPS2長度為1 667 bp,包含一個(gè)969 bp的開放閱讀框,位置從296~1 264 bp,編碼322個(gè)氨基酸,編碼蛋白命名為DsFPPS2(圖1,圖2)。

    2.2 DsFPPS蛋白的理化性質(zhì)分析

    用在線軟件ProtParam分析DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白以及3種藜科植物的FPPS蛋白(藜麥CqFPPS;菠菜SoFPPS;甜菜BvFPPS)的理化性質(zhì),結(jié)果如表1所示。DsFPPS1蛋白與藜科植物FPPS蛋白較相似,氨基酸長度均為342 aa;分子量在39.67~39.74之間;等電點(diǎn)(pI值)在5.01~5.12;酸性氨基酸比例在15.5%~16.4%之間,堿性氨基酸比例在13.8%~14.7%之間,極性中性氨基酸比例在25.3%~26.5%之間,非極性氨基酸比例在42.4%~44.4%之間,差異均較小;不穩(wěn)定系數(shù)值均小于40,屬于穩(wěn)定蛋白。而DsFPPS2蛋白與DsFPPS1蛋白以及藜科植物FPPS蛋白差異較大,氨基酸個(gè)數(shù)為322 aa,長度短于其他FPPS蛋白;分子量為36.76;等電點(diǎn)(pI值)為5.65;堿性氨基酸和極性中性氨基酸的比例與其他FPPS蛋白差異較小,比例分別為13.1%和27.3%,酸性氨基酸的比例低于其他FPPS蛋白,為13.1%,非極性氨基酸的比例高于其他FPPS蛋白,為46.5%;不穩(wěn)定系數(shù)值大于40,為不穩(wěn)定蛋白。

    運(yùn)用在線軟件ProtScale分析DsFPPS蛋白的親/疏水性,蛋白的每一位氨基酸的親/疏水性用分值表示,正值則表示疏水,負(fù)值則表示親水,絕對值越大則表示其親/疏水性越強(qiáng)。DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白的親/疏水性預(yù)測結(jié)果如圖3所示,在DsFPPS1蛋白氨基酸序列的第202位處有最高分值2.611,表明其疏水性水性較強(qiáng);第101位有最小分值-2.733,表明其親水性較強(qiáng);在DsFPPS2蛋白氨基酸序列的第68位處有最高分值2.800,表明其疏水性水性較強(qiáng);第118位有最小分值-2.578,表明其親水性較強(qiáng)。

    2.3 DsFPPS蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析

    采用NCBI中的CDD工具、本地軟件ClustalW以及相關(guān)文獻(xiàn)(Chen et al., 1994; Guo et al., 2015; 李永波等, 2012)尋找FPPS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域,結(jié)果顯示FPPS家族蛋白共包含5個(gè)保守區(qū)域(Ⅰ~Ⅴ),以及分別位于保守區(qū)域Ⅱ和Ⅴ的兩個(gè)天冬氨酸富集區(qū)域(DDXXD,X為任意氨基酸):FARM (First Aspartic Rich Motif)和SARM (Second Aspartic Rich Motif),如圖4所示。DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白均屬于FPPS家族,序列比對結(jié)果顯示DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白具有60.53%的相似性,均具有FPPS家族蛋白特征的兩個(gè)天冬氨酸富集區(qū)域FARM和SARM,以及序列保守區(qū)域Ⅰ~Ⅴ。天冬氨酸富集區(qū)域(DDXXD)是金屬離子Mg2+結(jié)合位點(diǎn),Mg2+再與底物的磷酸基團(tuán)結(jié)合,從而發(fā)揮催化作用(Christianson, 2017)。DsFPPS1蛋白對應(yīng)的五個(gè)保守區(qū)域序列分別為GGKLNR (45~50, Ⅰ)、EWLQAYFLVLDDIMDNSHTRRG (83~104,Ⅱ)、GQMIDL (160~165,Ⅲ)、KT (190~191,Ⅳ)、GIYFQVQDDYLDCFGDPEFIGKIGTDIEDFK (225~255,Ⅴ),F(xiàn)ARM為DDIMD (93~97),SARM為DDYLD (232~236)。DsFPPS2蛋白對應(yīng)的五個(gè)保守區(qū)域分別為SRKLNR (25~30,Ⅰ)、QWLVGCVLVLDDLLDASHTRRG (63~84,Ⅱ)、GEMIDL (140~145,Ⅲ)、KT (170~171,Ⅳ)、GIYFQAQDDYLDCFGDPKKSGKIGSDIEDFK (205~235,Ⅴ),F(xiàn)ARM為DDLLD (73~77),SARM為DDYLD (212~216)。

    2.4 DsFPPS蛋白的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域與亞細(xì)胞定位分析個(gè)氨基酸殘基的短肽,在分泌蛋白合成結(jié)束后將其切除,因此可以通過分析蛋白的氨基酸序列是否具有分泌肽來判斷蛋白是否為分泌蛋白。利用在線軟件SignalP 4.1對DsFPPS基因所編碼的蛋白進(jìn)行分析,結(jié)果顯示DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白均不具有信號肽,屬于非分泌蛋白(圖5:A,B)。然后,我們利用TMHMM在線軟件分析DsFPPS基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白均不具有跨膜結(jié)構(gòu)(圖6:A,B)。此外,Cell-PLoc 2.0在線軟件的亞細(xì)胞定位分析表明,DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白均存在于細(xì)胞的線粒體內(nèi)。

    2.5 DsFPPS蛋白的結(jié)構(gòu)特征分析

    蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和預(yù)測,結(jié)果表明(圖7) DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成類似,都是主要由α-螺旋組成,其比例分別為59.36%和64.29%,此外,DsFPPS1蛋白的二級結(jié)構(gòu)由19.88%的無規(guī)則卷曲、11.70%的延伸鏈以及9.06%的β-轉(zhuǎn)角組成,DsFPPS2蛋白的二級結(jié)構(gòu)由15.53%的無規(guī)則卷曲、10.87%的延伸鏈以及9.32%的β-轉(zhuǎn)角組成。

    利用在線軟件Phyre2對DsFPPS基因所編碼的DsFPPS1蛋白和DsFPPS2蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,以Artemisia spiciformis的FPPS蛋白(PDB ID:4KK2)為模板,采用線串法同源建模構(gòu)建DsFPPS1蛋白(79%相似性)和DsFPPS2蛋白(63%相似性)的三級結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖8所示。與大多數(shù)的FPPS蛋白類似,DsFPPS1蛋白的空間結(jié)構(gòu)中總共包含有13個(gè)α-螺旋,其中有10個(gè)長α-螺旋(A~J),α-螺旋A和α-螺旋B形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu),α-螺旋C至α-螺旋J共8個(gè)α-螺旋則形成α-螺旋束,圍繞形成一個(gè)中央腔;此外還包含有3個(gè)小α-螺旋(α-1、α-2、α-3),嵌入到α-螺旋H和α-螺旋I之間,酶的催化反應(yīng)則發(fā)生在α-螺旋腔底。DsFPPS2蛋白的三級結(jié)構(gòu)與DsFPPS1蛋白類似,但只包含有12個(gè)α-螺旋,9個(gè)長α-螺旋(B~J)和3個(gè)小α-螺旋(α-1,α-2,α-3),不包含α-螺旋A,因此缺少α-螺旋A和α-螺旋B形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

    2.6 DsFPPS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

    采用本地軟件MEGA 7.0.14對DsFPPS1蛋白、DsFPPS2蛋白和來自于GenBank數(shù)據(jù)庫的24條FPPS蛋白序列進(jìn)行分子系統(tǒng)進(jìn)化分析,N-J法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖9結(jié)果表明,F(xiàn)PPS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類分為植物、真菌、動(dòng)物和細(xì)菌4個(gè)類群,具有較顯著的種族特異性。細(xì)菌單獨(dú)聚為一大枝,動(dòng)物、真菌和植物聚為一大枝,該分枝中植物單獨(dú)聚為一枝,另一枝又分化為動(dòng)物和真菌兩大枝。在植物分枝中,唇形科、五加科、藜科、蝴蝶花科、大戟科植物各自聚為一枝,菊葉香藜的DsFPPS1蛋白分布于藜科植物分枝中,說明其與藜科植物的親緣關(guān)系較近,而菊葉香藜的DsFPPS2蛋白單獨(dú)聚為一枝。

    3 討論與結(jié)論

    倍半萜類化合物作為植物的次級代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的生物活性(樸英花和樸惠順, 2012),例如青蒿素(Artemisinin, C15H22O5)為倍半萜內(nèi)酯藥物,是有效的抗瘧疾特效藥(Tu, 2011);吉馬酮(Germacrone, C15H22O)具有抗?jié)儭⒖鼓[瘤、抗炎、抗菌、止咳、利膽等多種功效(Wu et al., 2017);β-桉葉醇(β-Eudesmol, C15H26O)可通過作用于瞬態(tài)受體電位錨蛋白1 (TRPA1)和自主神經(jīng)系統(tǒng)從而刺激食欲(Ohara et al., 2017);雪松醇(Cedrol, C15H26O)可劑量依賴性地加速纖維母細(xì)胞生長以及增加1型膠原蛋白和彈性蛋白的生成(Mu et al., 2012);纈草烯酸(Valerenic acid, C15H22O2)可變構(gòu)調(diào)節(jié)GABA-A受體從而發(fā)揮抗焦慮活性(Becker et al., 2014)。

    FPPS是植物萜類化合物生物合成途徑中分支點(diǎn)上的關(guān)鍵酶,經(jīng)FPPS的催化可生產(chǎn)倍半萜類化合物的前體,菊葉香藜精油中倍半萜類的生物合成需要此酶的參與。目前,隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的崛起,我們從包含有海量信息的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘FPPS候選基因,獲得了兩條FPPS基因:FPPS1和FPPS2,并對這兩條基因的開放閱讀框進(jìn)行了預(yù)測并進(jìn)行了進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示,F(xiàn)PPS1蛋白和FPPS2蛋白序列相似度達(dá)60.53%,均含有FPPS蛋白特征的5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(Ⅰ~V)以及兩個(gè)天冬氨酸富集區(qū)域(FARM和SARM)。然而,F(xiàn)PPS1蛋白和FPPS2蛋白的穩(wěn)定性存在差異,F(xiàn)PPS2蛋白為不穩(wěn)定蛋白,且FPPS2蛋白結(jié)構(gòu)中缺少α-螺旋A,因此其三級結(jié)構(gòu)中缺少由α-螺旋A和α-螺旋B組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)可能會(huì)影響其穩(wěn)定性。在分子進(jìn)化分析樹的植物分枝中,F(xiàn)PPS2蛋白與其他植物分開,單獨(dú)聚為一枝,F(xiàn)PPS2蛋白可能是一類新的FPPS亞型。植物FPPS通常由基因家族編碼,含有多個(gè)FPPS亞型,不同亞型在植物不同的生長階段和組織中發(fā)揮作用,擬南芥種子中FPS2的缺失可升高HMGR(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase,3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶)活性(Closa et al., 2010),從而調(diào)節(jié)植物中“碳流”的流向,控制類異戊二烯種類的比例。

    在前期的菊葉香藜轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn),F(xiàn)PPS1在花和葉組織中的表達(dá)均高于FPPS2,且FPPS1蛋白的穩(wěn)定性優(yōu)于FPPS2蛋白。由此可推測,F(xiàn)PPS1蛋白廣泛且長期存在于菊葉香藜植物中,而FPPS2的出現(xiàn)則具有“時(shí)-空”特異性,但菊葉香藜FPPS各亞型的功能、活性、表達(dá)以及調(diào)節(jié)機(jī)制仍需要更進(jìn)一步的研究??偟膩碚f,該研究對菊葉香藜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的FPPS基因進(jìn)行了挖掘與生物信息學(xué)分析,為菊葉香藜FPPS基因今后的基礎(chǔ)研究和開發(fā)應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

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