蛹蟲草多糖抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用及機(jī)制研究

郭秀彩 賀周揚(yáng) 鄧英光 張紫萍

〔摘要〕 目的 研究蛹蟲草多糖抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制。方法 30只小鼠隨機(jī)分為3組，分別為模型組、蛹蟲草多糖低劑量組（20 mg/kg）和蛹蟲草多糖高劑量組（80 mg/kg），所有動(dòng)物采用尾靜脈接種4T1乳腺癌細(xì)胞建立乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型，后2組接種后連續(xù)腹腔注射給予蛹蟲草多糖15 d。以肺組織表面的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)、血清MMP-2和MMP-9含量、肺組織病理為檢測(cè)指標(biāo);采用CCK8法檢測(cè)蛹蟲草多糖對(duì)4T1細(xì)胞增殖的影響;采用Caspase-3/7檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 與模型組比較，蛹蟲草多糖高劑量組能夠明顯降低小鼠肺部的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)（P<0.01）;與模型組比較，蛹蟲草多糖高劑量組能夠顯著降低血清MMP-2和MMP-9的含量（P<0.01）;顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草多糖高劑量組的肺組織腫瘤轉(zhuǎn)移灶體積和數(shù)量均少于模型組。蛹蟲草多糖對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞增殖具有濃度依賴性趨勢(shì)的抑制作用，半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.092 mg/mL;與溶媒組比較，0.10 mg/mL和0.20 mg/mL的蛹蟲草多糖可以顯著增加Caspase-3/7的表達(dá)（P<0.01）。結(jié)論 蛹蟲草多糖可抑制乳腺癌肺轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能與抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)和直接的抗腫瘤作用有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 蛹蟲草多糖;乳腺癌;4T1乳腺癌細(xì)胞;腫瘤轉(zhuǎn)移;細(xì)胞凋亡;MMP-2;MMP-9

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R737.9? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.07.008

〔Abstract〕 Objective To study the effects and mechanisms of Cordyceps Militaris polysaccharide （CMP） on breast cancer metastasis. Methods A total of 30 mice were randomly divided into 3 groups， including a model group， CMP low dose （20 mg/kg） and high dose （80 mg/kg） groups. The model of lung metastasis from breast cancer was established after all of the animals were injected with 4T1 breast cancer cells via tail veins. After the inoculation， the mice were treated with intraperitoneal injection of CMP for 15 days. The tumor nodules on the surface of lung， the expression of MMP-2 and MMP-9 in serum， and pathology of lung tissue was observed. In vitro， the effect of CMP on the proliferation of 4T1 breast cancer cells was evaluated using cell counting kit-8 （CCK8） assay， and cell apoptosis was evaluated using Caspase-3/7 assay. Results In the CMP high dose group， the number of tumor nodules on the surface of lung and the expression of MMP-2 and MMP-9 in serum were significantly decreased compared with the model group （P<0.01）. Under the microscope， the volume and number of lung metastatic foci in the CMP high dose group were decreased compared with the model group. In vitro， the CMP could inhibit the proliferation of 4T1 cells in a concentration-dependent manner， with an IC50 of 0.092 mg/mL. Compared with the vehicle group， the CMP at concentrations of 0.1 mg/mL and 0.2 mg/mL could significantly increase the expression of Caspase-3/7 （P<0.01）. Conclusion CMP have the effect of inhibition of lung metastasis from breast cancer， and the mechanisms may be related with the inhibition of the expression of MMP-2 and MMP-9 and the effect of direct anti-tumor.

〔Keywords〕 Cordyceps Militaris; breast cancer; 4T1 breast cancer cells; tumor metastasis; cell apoptosis; MMP-2; MMP-9

在全球范圍內(nèi)，乳腺癌是目前女性中最常見的惡性腫瘤，也是女性最主要的死亡原因。乳腺癌在我國的發(fā)病率占全部惡性腫瘤的7%～10%，且其發(fā)病率有逐漸增高的趨勢(shì)[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因[2]，雖然早期診斷的標(biāo)記物和藥物治療取得了很大的進(jìn)展，并降低了乳腺癌患者的死亡率，但目前仍然缺乏針對(duì)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的治療藥物，因此亟需開發(fā)有效的抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的藥物。近年來，中醫(yī)藥的抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面的研究逐漸增多，尤其是補(bǔ)益類中藥在這一領(lǐng)域的作用逐漸受到重視[3]。本研究擬探討傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥蛹蟲草的主要活性成分蛹蟲草多糖對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的影響，為開發(fā)抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 藥物與試劑

蛹蟲草購自上海食用菌有限公司，蛹蟲草粉碎后參照文獻(xiàn)方法[4]制備蛹蟲草多糖，苯酚-硫酸法測(cè)得制備的蛹蟲草多糖樣品的多糖含量為42.1%。4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所?；|(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9 ELISA測(cè)定試劑盒購自美國R&D公司，CCK8檢測(cè)試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，Caspase-3/7檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司。

1.2? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性BABL/C正常小鼠，18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于聚丙烯鼠盒中，動(dòng)物自由采食，自由飲水。飲水瓶中動(dòng)物飲用水每天更換。

1.3? 儀器

MultiskanSpectrum酶標(biāo)儀、Sorvall ST16R臺(tái)式冷凍離心機(jī)均購自Thermo公司。

1.4? 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1? 蛹蟲草多糖的制備及含量測(cè)定[5]? 蛹蟲草粉碎后加入10倍體積的水，100 ℃水浴提取2 h，過濾，濾渣用5倍體積的水100 ℃提取2 h后過濾（重復(fù)2次），合并全部濾出液，然后離心濃縮脫蛋白，加3倍體積95%乙醇進(jìn)行醇沉，4 ℃靜置過夜，棄去上清，將沉淀離心，凍干即為蛹蟲草多糖。取蛹蟲草多糖0.1 g用水溶解，定容轉(zhuǎn)移至10 mL，作為樣品儲(chǔ)備溶液測(cè)定其吸光度后，將其稀釋制成適當(dāng)濃度的樣品溶液以備測(cè)定。取供試液/對(duì)照液1 mL，加入1 mL苯酚溶液，再加入濃硫酸7 mL，搖勻，測(cè)定吸光度。使用改良苯酚-硫酸法測(cè)得制備的蛹蟲草多糖樣品的多糖含量為42.1%。

1.4.2 4T1乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型建立[6]? 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞，腫瘤接種當(dāng)天，所有小鼠尾靜脈接種4T1乳腺癌細(xì)胞懸液建立乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型，接種密度為1×106/mL，每只接種100 μL細(xì)胞懸液，密切觀察接種腫瘤后的動(dòng)物狀態(tài)。

1.4.3? 動(dòng)物分組及給藥[7]? 30只小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，分別為模型組、蛹蟲草多糖低劑量組和蛹蟲草多糖高劑量組，每組10只動(dòng)物。接種當(dāng)天，模型組和給藥組動(dòng)物均尾靜脈接種4T1細(xì)胞。接種當(dāng)天即開始腹腔注射給藥，模型組腹腔注射給予生理鹽水，給藥組分別給予20 mg/kg和80 mg/kg的蛹蟲草多糖，每日給藥1次，共給藥15 d。

1.4.4? 蛹蟲草多糖對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的抑制作用? 接種后第15天，摘眼球采全血，頸椎脫臼處死動(dòng)物，解剖取出肺臟，用生理鹽水漂洗后，計(jì)數(shù)肺表面的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)，計(jì)數(shù)完后稱量肺臟質(zhì)量。

1.4.5? 小鼠血清MMP-2和MMP-9含量測(cè)定? 全血離心取血清，ELISA試劑盒檢測(cè)金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2和MMP-9的含量。

1.4.6? 腫瘤病理組織觀察? 將肺組織浸泡在4%的多聚甲醛中固定，常規(guī)制作病理切片。顯微鏡下觀察肺組織中的腫瘤轉(zhuǎn)移程度。

1.4.7? 蛹蟲草多糖對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞增殖的影響? 體外傳代培養(yǎng)乳腺癌4T1細(xì)胞，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/mL，接種100 μL每孔于96孔板。在37 ℃、5% CO2 條件下孵育24 h，待細(xì)胞貼壁后，按100 μL/孔加入一系列濃度梯度的蛹蟲草多糖藥物溶液，溶媒組僅加入等體積的培養(yǎng)基。加完藥之后，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，孵育72 h。加入CCK-8，每孔20 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)吸光度（A）值。

抑制率=（A溶媒-A藥物）/A溶媒×100%

1.4.8? 蛹蟲草多糖對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞凋亡的影響? 體外傳代培養(yǎng)乳腺癌4T1細(xì)胞，調(diào)整乳腺癌4T1細(xì)胞濃度至2×105/mL，接種100 μL每孔于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，孵育24 h后，按100 μL/孔加入不同濃度的蛹蟲草多糖藥物溶液，溶媒組僅加入等體積的培養(yǎng)基。加完藥之后，繼續(xù)孵育48 h，將Caspase-3/7底物溶液用緩沖液稀釋100倍，混合均勻后得到Caspase-3/7試劑溶液，取100 μL試劑溶液加入經(jīng)過處理的細(xì)胞中，混勻后，繼續(xù)室溫孵育2 h，于激發(fā)波長(zhǎng)485 nm和發(fā)射波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定熒光值。

1.5? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用“x±s”表示，采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1? 蛹蟲草多糖對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的抑制作用

對(duì)肺組織進(jìn)行大體觀察發(fā)現(xiàn)，全部動(dòng)物發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移。與模型組比較，蛹蟲草多糖高劑量組能明顯降低肺轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)（P<0.01）。另外，與模型組比較，蛹蟲草多糖高劑量組還能顯著降低肺組織質(zhì)量（P<0.05）。見表1。

2.2? 蛹蟲草多糖對(duì)血清MMP-2和MMP-9含量的影響

與模型組比較，蛹蟲草多糖高劑量組能明顯降低血清MMP-2和MMP-9的含量（P<0.01），而低劑量組無明顯降低作用。見表2。

2.3? 腫瘤病理組織觀察

小鼠肺組織病理切片結(jié)果顯示，模型組肺組織出現(xiàn)較大的腫瘤轉(zhuǎn)移灶，而蛹蟲草多糖中高劑量治療組肺組織腫瘤轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和體積均少于模型組。見圖1。

2.4? 蛹蟲草多糖對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞增殖的影響

在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，蛹蟲草多糖對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞增殖具有濃度依賴性的抑制作用，半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.092 mg/mL，結(jié)果提示蛹蟲草多糖對(duì)4T1細(xì)胞的增殖具有直接的抑制作用。見圖2。

2.5? 蛹蟲草多糖對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞凋亡的影響

Caspase-3/7的表達(dá)與細(xì)胞凋亡程度呈正相關(guān)，因此其含量可以反映細(xì)胞凋亡的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蛹蟲草多糖具有濃度依賴性的增加乳腺癌4T1細(xì)胞中Caspase-3/7表達(dá)量的作用，且0.10 mg/mL和0.20 mg/mL的蛹蟲草多糖較溶媒組可以顯著增加Caspase-3/7的含量，結(jié)果提示蛹蟲草多糖可促進(jìn)乳腺癌4T1細(xì)胞的凋亡。見圖3。

3 討論

乳腺癌是女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，而腫瘤轉(zhuǎn)移是造成乳腺癌患者死亡的主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細(xì)胞通過各種方式，脫離原發(fā)腫瘤組織，經(jīng)過血管或淋巴管達(dá)到繼發(fā)組織后得以繼續(xù)生長(zhǎng)，形成繼發(fā)性腫瘤的全過程[8]。乳腺癌是伴有遠(yuǎn)端組織轉(zhuǎn)移的最常見的惡性腫瘤之一，其中最常見的轉(zhuǎn)移組織為骨、肺、肝及腦[9]。目前，尚缺乏抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的藥物，因此尋找阻斷乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療藥物具有重要意義。

蛹蟲草又稱北冬蟲夏草，是珍貴的中草藥，在我國已被使用近千年。蛹蟲草中含有多種具有生物活性的成分[10]，包括蛹蟲草多糖、腺苷衍生物、麥角固醇等有效成分。現(xiàn)代藥理研究表明，蛹蟲草在體外和體內(nèi)均有明顯的抗腫瘤作用[11-12]，臨床研究也證實(shí)在放化療的過程中其對(duì)晚期腫瘤患者具有明顯的扶正減毒作用[13]。蛹蟲草多糖是蛹蟲草的主要活性成分之一，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道其增強(qiáng)免疫力和抗腫瘤作用[4，14]，但對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用的報(bào)道較為少見，因此，本研究擬對(duì)蛹蟲草多糖的抗乳腺癌轉(zhuǎn)移活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

4T1乳腺癌細(xì)胞在BALB/c小鼠中的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移特性與人乳腺癌細(xì)胞在人體中十分接近，是模擬人IV期乳腺癌的理想動(dòng)物模型[15]。乳腺癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型可通過原位、靜脈和皮下接種的方法建立，原位接種的乳腺癌轉(zhuǎn)移模型最為接近人體內(nèi)真實(shí)的腫瘤轉(zhuǎn)移環(huán)境，但耗時(shí)較長(zhǎng)，難以用于藥效評(píng)價(jià)。靜脈接種的乳腺癌轉(zhuǎn)移模型具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短和易于定量評(píng)價(jià)腫瘤轉(zhuǎn)移程度的優(yōu)點(diǎn)，而且靜脈造模后通過轉(zhuǎn)移形成的肺部腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)譜與原位造模無明顯差異[16]，故本研究采用靜脈接種4T1乳腺癌細(xì)胞的方法建立乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草多糖高劑量能夠降低4T1乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型動(dòng)物肺部的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)，表明蛹蟲草多糖具有明顯的抑制4T1乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的作用。

腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制極其復(fù)雜，受多種不同的因素調(diào)節(jié)。在多種影響腫瘤轉(zhuǎn)移的因素中，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP家族與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MMP-2和MMP-9是MMP家族中的重要成員，二者的高表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[17]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草多糖高劑量能夠降低血清中MMP-2和MMP-9的表達(dá)，提示蛹蟲草多糖對(duì)4T1乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的抑制作用可能與抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞的增殖、分化異常有關(guān)，還與細(xì)胞凋亡的異常有關(guān)。細(xì)胞凋亡是乳腺癌治療及預(yù)后研究中的重要領(lǐng)域[18]。Caspase是一組細(xì)胞凋亡過程中的重要的調(diào)控因子，Caspase-3是Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，又是多種凋亡途徑共同作用的關(guān)鍵因子，其活性的高低決定著細(xì)胞凋亡程度[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草對(duì)4T1細(xì)胞的增殖具有直接抑制作用，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)蛹蟲草多糖能夠增加乳腺癌4T1細(xì)胞中Caspase-3/7活性，提示蛹蟲草多糖可通過上調(diào)Caspase-3/7的活性來誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮抑制乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。

綜上所述，本研究利用靜脈接種4T1細(xì)胞建立的小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移評(píng)價(jià)了蛹蟲草多糖抗乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的作用，結(jié)果表明，蛹蟲草多糖具有明顯的抗乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的作用，其作用機(jī)制可能與抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)和直接的抗腫瘤作用有關(guān)。本研究說明蛹蟲草多糖抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用較明顯，具有潛在的治療乳腺癌轉(zhuǎn)移的臨床價(jià)值。

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