無乳鏈球菌對羅非魚腸道菌群的影響

黎銘 馬春霞 黎建斌 雷愛瑩 李莉萍 李大列 陳福艷 陳明

黎銘（1980-），博士，副研究員，主要從事水產(chǎn)動物病害防治研究工作。主持完成siRNA感染抗對蝦白斑病毒研究、雞卵黃抗體抗對蝦白斑病毒研究等8項省部級項目，參與完成國家自然科學(xué)基金項目“白斑綜合癥病毒編碼的microRNA在病毒感染凡納濱對蝦過程中的作用”、廣西自然科學(xué)基金項目“香港牡蠣三倍體養(yǎng)殖性狀評估分析災(zāi)后恢復(fù)”等18項?，F(xiàn)主持、參與國家自然科學(xué)基金項目、廣西重點研發(fā)計劃項目、廣西自然科學(xué)基金項目等13項。獲廣西科學(xué)技術(shù)進步獎二等獎1項，水產(chǎn)新品種1項。在國內(nèi)外期刊上發(fā)表論文40余篇，其中SCI一區(qū)10篇，中文核心期刊25篇。申報國家專利8項，獲國家發(fā)明專利6項。研發(fā)的對蝦抗菌肽已轉(zhuǎn)企業(yè)生產(chǎn)，社會經(jīng)濟效益顯著。

摘要：【目的】分析無乳鏈球菌對羅非魚腸道菌群的影響，為揭示無乳鏈球菌與腸道菌群的相互作用機制提供參考依據(jù)。【方法】以無乳鏈球菌HN016強毒株的菌懸液經(jīng)口灌胃吉富羅非魚，采用實時熒光定量PCR及16S rRNA高通量測序技術(shù)分析無乳鏈球菌在羅非魚腸道中的定植情況及對羅非魚腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響?！窘Y(jié)果】口服無乳鏈球菌HN016菌懸液的羅非魚在24 h后出現(xiàn)鏈球菌病的典型癥狀，至口服后第3 d試驗組羅非魚全部死亡;口服12 h后羅非魚腸道內(nèi)的無乳鏈球菌HN016強毒株數(shù)量達峰值，但口服24 h后其數(shù)量顯著下降（P<0.05）?？诜o乳鏈球菌HN016菌懸液后羅非魚腸道樣品OTUs的數(shù)量和種類發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為口服12 h后引起羅非魚腸道菌群多樣性明顯降低，但口服24 h后出現(xiàn)反彈并高于初始水平，且腸道菌群多樣性與無乳鏈球菌HN016強毒株在腸道中的含量呈明顯負相關(guān)?？诜o乳鏈球菌HN016菌懸液引起羅非魚腸道菌群構(gòu)成比例發(fā)生明顯變化，門水平上排名前10位的變形菌門、擬桿菌門、廣古菌門、互養(yǎng)菌門和軟壁菌門細菌所占比例上升，厚壁菌門、梭菌門、放線菌門、奇古菌門和螺旋體門所占比例則呈下降趨勢;在屬水平上表現(xiàn)為羅非魚腸道菌群排名前10位的優(yōu)勢菌屬除了擬桿菌屬和不動桿菌屬呈上升趨勢外，其他菌屬如鯨桿菌屬、乳球菌屬和丙酸菌屬等均呈下降趨勢，即羅非魚大部分腸道優(yōu)勢菌群已受到無乳鏈球菌HN016強毒株的抑制?！窘Y(jié)論】無乳鏈球菌感染羅非魚后腸道菌群構(gòu)成及其多樣性明顯改變，可引起致病菌愛德華氏菌屬和假單胞菌屬細菌比例的增加，同時引起鯨桿菌屬、丙酸菌屬和乳球菌屬等腸道有益細菌比例的減少，故推測遲緩愛德華氏菌和熒光假單胞菌繼發(fā)感染在羅非魚鏈球菌病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

關(guān)鍵詞： 羅非魚;無乳鏈球菌;腸道細菌;菌群構(gòu)成;多樣性;16S rRNA高通量測序

中圖分類號： S965.125? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）08-1647-10

Effects of Streptococcus agalactiae on intestinal flora of tilapia

LI Ming1， MA Chun-xia2， LI Jian-bin1， LEI Ai-ying1， LI Li-ping1，LI Da-lie1，

CHEN Fu-yan1*， CHEN Ming1*

（1Guangxi Institute of Fisheries/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture， Nanning 530021， China; 2Guangxi Veterinary Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccines and New Technology， Nanning? 530001， China）

Abstract：【Objective】This study analyzed the influence of Streptococcus agalactiae on the intestinal flora of tilapia to provide reference for revealing the interaction mechanism between S. agalactiae and intestinal flora. 【Method】Experimental Tilapia mossambica were fed with bacterial suspension of S. agalactiae virulent strain HN016， and then real-time fluorescence quantitative PCR was used to analysis the amount of HN016 in gut and 16S rRNA high-throughput sequen-cing method was used to analyze the changes on structure and diversity of tilapia intestinal flora. 【Result】The results showed that the tilapia administrated with bacterial suspension of S. agalactiae virulent strain HN016 presented typical symptoms of streptococcal disease after 24 h， and all the tilapia in the positive group died on day 3 after oral administration. The amount of S. agalactiae virulent strain HN016 reached its peak in the intestinal tract after 12 h of oral administration and significantly decreased after 24 h（P<0.05）. Great changes on the OTUs number and species of the intestinal sample were showed after oral administration. The intestinal flora diversity of tilapia decreased after 12 h of oral administration of HN016， but the diversity rebounded and was higher than the initial level after 24 h. The diversity of intestinal flora of tilapia was negatively correlated with the content of S. agalactiae virulent strain HN016 in the intestinal tract. Oral administration of HN016 caused obvious changes in the composition of intestinal flora of tilapia. The composition of intestinal flora in the top 10 was analyzed and found that the proportion of Proteobacteria， Bacteroidetes， Euryarchaeota， Synergistetes， Tenericutes increased obviously，and the proportion of Firmicutes， Fusobacteria， Actinobacteria， Thaumarchaeota， Spirochaetes decreased observably. On genus level， among the top 10 dominant bacteria in tilapia intestine， except for the proportion of Edwardsiella， Pseudomonas increased， the proportion of other bacteria such as Cetobacterium， Lactococcus and Propionibacterium decreased. It indicated that most dominant intestinal flora were inhibited by S.agalactiae virulent strain HN016. 【Conclusion】Oral administration of S. agalactiae HN016 strains results in changes in intestinal flora composition and diversity of tilapia， it also increases the proportions of Edwardsiella， Pseudomonas， and decreases the proportions of intestinal beneficial bacteria such as Cetobacterium， Propionibacterium and Lactococcus. Therefore， it is inferred that E. tarda and P. fluorescens secondary infection plays an important role in tilapia S. agalactiae.

Key words： tilapia; Streptococcus agalactiae; intestinal bacteria; flora composition; diversity; high throughput sequencing of 16S rRNA

0 引言

【研究意義】羅非魚肉厚刺少、質(zhì)嫩味美，且兼具生長快、病害少、適應(yīng)力強的特點，現(xiàn)已發(fā)展成為全球廣泛養(yǎng)殖的魚類品種（林虹等，2013）。我國是全球最大的羅非魚養(yǎng)殖和加工出口國，據(jù)統(tǒng)計，2015年我國羅非魚產(chǎn)量達178萬t，出口量達39萬t。鏈球菌（Streptococcus）嚴重制約著羅非魚的健康養(yǎng)殖，其累積死亡率可達30%～80%（李莉萍等，2015）。自2009年以來，我國多個地區(qū)暴發(fā)羅非魚鏈球菌病，且呈全國蔓延趨勢，給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失，鏈球菌病已成為水產(chǎn)病害防控的重點對象（盧邁新，2010）。由于鏈球菌可在羅非魚腸道潛伏感染，在特定條件下能大量繁殖而促使鏈球菌病暴發(fā)，因此，研究鏈球菌在羅非魚腸道內(nèi)的定植、繁殖及其與腸道屏障和機體免疫系統(tǒng)的相互作用規(guī)律，對有效防控羅非魚鏈球菌病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】相關(guān)數(shù)據(jù)表明，90%以上羅非魚鏈球菌病臨床菌株為無乳鏈球菌（S. agalactiae）（馮東岳，2010;李莉萍等，2015）。無乳鏈球菌的感染與季節(jié)和溫度有關(guān)，熱帶地區(qū)高溫季節(jié)更易導(dǎo)致羅非魚鏈球菌病的暴發(fā)（林虹等，2013）。無乳鏈球菌主要通過胃腸道進入機體，其感染和致病過程一般可分為在盲腸或小腸內(nèi)定植→小腸上皮細胞穿越→宿主免疫防御逃避3個階段（黎源等，2017）。此外，無乳鏈球菌能在巨噬細胞內(nèi)存活并增殖，借以突破血腦屏障，進入血液和中央神經(jīng)系統(tǒng)，然后快速擴散至其他器官組織（祝璟琳等，2013，2014）。目前，抗生素仍是魚類細菌性疾病防治最有效的方法，但生產(chǎn)環(huán)節(jié)中過量使用抗生素極易導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生、食品質(zhì)量安全及生態(tài)環(huán)境污染等一系列問題（程世亮等，2016）。據(jù)報道，2009年前使用抗生素還可有效控制部分鏈球菌病的病情，但自2010年之后抗生素對鏈球菌幾乎不產(chǎn)生實際效果（李莉萍等，2013）。袁偉（2017）研究表明，我國羅非魚源無乳鏈球菌對氨基糖苷類藥物和磺胺類藥物的耐藥率均超過85.0%，對諾氟沙星的耐藥率為14.2%，對洛美沙星的耐藥率為82.8%，對依諾沙星的耐藥率高達98.2%。黃艷華等（2018）研究表明，廣西羅非魚源無乳鏈球菌的耐藥譜型呈多樣性，譜型豐富度較高，且因來源地不同和年際變化存在一定差異性。梁靜真等（2018）研究表明，廣西羅非魚源無乳鏈球菌存在tetM +tetO-tetL-tetS-和tetM-tetO-tetL-tetS-兩種耐藥基因型，攜帶tetM基因羅非魚源無乳鏈球菌經(jīng)體外誘導(dǎo)后對多西環(huán)素的耐藥性大幅度提高?！颈狙芯壳腥朦c】腸道細菌依賴宿主自身營養(yǎng)或分解腸道食物團而賴以生存，同時其代謝合成的維生素及胞外酶產(chǎn)物可被宿主利用，因此在宿主的營養(yǎng)消化吸收方面發(fā)揮著重要作用（Nayak，2010）;此外，腸道常在菌群對病原菌定居和增殖起屏障作用，在一定程度上可保護宿主免受病原菌侵害（Thursby and Juge，2017）。雖然腸道菌群屏障對病原菌具有排斥作用，但仍有不少病原菌能順利穿越腸道上皮細胞進入機體而導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展和普及應(yīng)用，使得腸道菌群的研究變得越來越方便，也為揭示病原菌與腸道菌群的相互作用機制提供了有利條件?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒于無乳鏈球菌對羅非魚危害的嚴重性，通過實時熒光定量PCR及高通量測序技術(shù)等分析無乳鏈球菌對羅非魚腸道菌群的影響，以期為揭示無乳鏈球菌與腸道菌群的相互作用機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）來自廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院國家級羅非魚良種場，其平均體重30.15±2.60 g/尾。經(jīng)腦組織和腎臟分離細菌，確認無細菌感染。羅非魚暫養(yǎng)于800 L的養(yǎng)殖容器中，（30±4）℃下養(yǎng)2周。羅非魚無乳鏈球菌HN016強毒株由廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室分離保存。

1. 2 特異性引物和探針

根據(jù)無乳鏈球菌保守基因cfb（GenBank登錄號3686873）設(shè)計特異性引物cfb-F/cfb-R及探針cfb-P probe（表1），擴增長度113 bp。以上引物及探針均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1. 3 羅非魚口服無乳鏈球菌

試驗羅非魚分為試驗組和對照組，每組3個養(yǎng)殖容器（3個重復(fù)），每個容器35尾。使用灌胃器給試驗組羅非魚經(jīng)口灌胃（口服）無乳鏈球菌HN016菌懸液，1.5×109 CFU/尾，對照組口服等量無菌PBS溶液?？诜笥^察和統(tǒng)計羅非魚死亡情況，并在口服后12 h、24 h和3 d、7 d、15 d分別從每個養(yǎng)殖容器中隨機挑選5尾羅非魚用于腸道菌群檢測。在無菌條件下采集被挑選羅非魚的全腸樣品，用鑷子擠壓方法清除腸道內(nèi)容物，然后以無菌生理鹽水沖洗腸道3遍。清理后的腸道按十二指腸、前腸、后腸和直腸剪斷后，分類保存于-80 ℃冰箱備用。取出羅非魚腸道樣品快速置于液氮預(yù)冷的研缽中，研磨成粉末狀，再加入溶菌酶溶液進行處理，然后按組織DNA抽提試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]說明進行DNA抽提，所得DNA以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和濃度，用于16S rRNA序列高通量測序分析及實時熒光定量PCR檢測。

1. 4 實時熒光定量PCR檢測無乳鏈球菌在羅非魚腸道中的定植情況

參照王瑞等（2015）的研究方法，對無乳鏈球菌DNA樣品進行10倍梯度稀釋，分別獲得濃度相當(dāng)于108～101個/mL的8個梯度無乳鏈球菌DNA樣品，然后測定實時熒光定量PCR擴增的最低模板濃度并建立標準曲線。按照 Real Time PCR/TaqMan檢測試劑盒操作說明進行實時熒光定量PCR擴增，反應(yīng)體系50.0 μL： DNA模板4.0 μL，cfb-F/cfb-R各1.0 μL，TaqMan探針（cfb-P probe）2.0 μL，Premix Ex Taq 25.0 μL，ROX Reference Dye II 0.5 μL，滅菌蒸餾水16.5 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)。每個樣品設(shè)3個平行樣，每次試驗均包括空白對照（DNA模板用ddH2O代替）。PCR產(chǎn)物送至深圳華大基因股份有限公司測序。參照王瑞等（2015）的研究方法，根據(jù)擴增Ct值計算無乳鏈球菌數(shù)量，并采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。

1. 5 基于16S rRNA序列分析口服無乳鏈球菌前后羅非魚腸道菌群變化

取適量DNA樣品用無菌水稀釋至1.0 ng/μL。以稀釋DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域（16S rRNA的V3～V4區(qū)）選擇，使用帶Barcode的特異引物及高保真酶進行PCR擴增。以2.0%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測;參照TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒說明構(gòu)建文庫，所得文庫經(jīng)Qubit和實時熒光定量PCR檢測合格后，使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。下機數(shù)據(jù)經(jīng)拆分后，對獲得的Tags進行過濾、去嵌合體序列，最后獲得Effective Tags。采用Uparse v7.0.1001（http：//drive5.com/uparse/）對全部Effective Tags進行聚類，按照97%的序列相似性將Effective Tags聚類成OTUs（Operational taxonomic units），篩選出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為代表序列。利用GreenGene數(shù)據(jù)庫（http：//greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi）和RDP Classifier v2.2（http：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）對OTUs代表序列進行物種注釋（閾值為0.8～1.0），并分別從界（Kingdom）、門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）和種（Species）分類水平統(tǒng)計各樣本的群落組成。試驗數(shù)據(jù)經(jīng)均一化處理后進行多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 無乳鏈球菌在羅非魚腸道的定植分布情況

口服無乳鏈球菌HN016菌懸液的羅非魚在24 h后出現(xiàn)鏈球菌病的典型癥狀：精神不振，游姿異常，體色發(fā)黑;至口服后第3 d試驗組羅非魚全部死亡，而對照組羅非魚在整個試驗周期均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。使用實時熒光定量PCR檢測口服0～24 h后羅非魚腸道內(nèi)的無乳鏈球菌HN016強毒株數(shù)量，結(jié)果（圖1）表明，口服12 h后羅非魚腸道內(nèi)的無乳鏈球菌HN016強毒株數(shù)量達峰值，但口服24 h后其數(shù)量顯著下降（P<0.05）。

2. 2 16S rRNA測序分析結(jié)果

通過HiSeq2500 PE250對12個羅非魚腸道樣品進行測序，結(jié)果共獲有效Tags數(shù)量為67067條，獲得注釋的Tags數(shù)量為65236條。每個樣品有效Tags數(shù)量為50992～67067條（圖2），平均長度為405～426 nt。利用Uparse v7.0.1001對樣品的有效Tags序列進行聚類分析，按照97%的序列相似性將這些序列聚類成OTUs，類聚和注釋結(jié)果表明，12個羅非魚腸道樣品OUTs數(shù)量介于510～984個，平均為753個（圖2）。

為了檢驗測序結(jié)果的合理性，對16S rRNA測序結(jié)果進行物種累積箱形圖分析，結(jié)果顯示，隨著羅非魚腸道樣本量的增加，箱形圖位置趨于平緩（圖3），表明12個腸道樣品測序結(jié)果已包含羅非魚腸道絕大部分腸道菌群物種，即抽樣充分。

2. 3 正常羅非魚腸道各部位優(yōu)勢菌群的構(gòu)成比例

對口服無乳鏈球菌HN016菌懸液前（0 h）羅非魚腸道菌群測序結(jié)果進行分析，結(jié)果（圖4）表明，在屬水平上正常羅非魚腸道排名前10位的菌屬分別為鯨桿菌屬（Cetobacterium，占15.3%）、乳球菌屬（Lactococcus，占5.6%）、Romboutsia（占7.9%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，5.2%）、地桿菌屬（Pedobacter，1.2%）、普氏菌屬（Prevotella_9，占1.0%）、擬桿菌屬（Bacteroides，1.0%）、Candidatus_Nitrosopumilus（占0.7%）、芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus，占0.7%）和嗜肽菌屬（Peptoniphilus，占0.6%），其他菌屬占60.5%。

2. 4 口服無乳鏈球菌后羅非魚腸道菌群多樣性的變化

為檢驗口服無乳鏈球菌是否會導(dǎo)致羅非魚腸道菌群變化，對不同時間段羅非魚腸道菌群進行比較分析。韋恩圖分析結(jié)果（圖5-A）表明，與口服無乳鏈球菌HN016菌懸液前（0 h）相比，口服無乳鏈球菌HN016菌懸液12和24 h后羅非魚腸道樣品的OTUs數(shù)量和種類發(fā)生明顯變化，口服無乳鏈球菌HN016菌懸液前（0 h）羅非魚腸道樣品特有OTUs為313個，口服無乳鏈球菌HN016菌懸液12 h的特有OTUs為330個，口服無乳鏈球菌HN016菌懸液24 h的特有OTUs為542個。測序結(jié)果中OTUs數(shù)量即代表物種的數(shù)量。稀釋曲線（圖5-B）顯示，口服無乳鏈球菌HN016菌懸液12 h后羅非魚腸道樣品菌群多樣性降低，但24 h后其多樣性呈上升狀態(tài)，且高于口服無乳鏈球菌HN016菌懸液前的初始水平。Shannon指數(shù)（圖5-C）和Simpson指數(shù)（圖5-D）與稀釋曲線結(jié)果一致，口服無乳鏈球菌HN016菌懸液12 h后羅非魚腸道樣品菌群多樣性降低，但24 h后多樣性呈上升趨勢。

2. 5 口服無乳鏈球菌后羅非魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化

為檢驗組間差異是否顯著大于組內(nèi)差異，對試驗組和對照組羅非魚腸道菌群構(gòu)成進行單因素相似性（ANOSIM）分析，結(jié)果表明，各組間的R值均大于0（圖 6），說明各組間羅非魚腸道菌群構(gòu)成差異顯著，且組間差異大于組內(nèi)差異。

口服無乳鏈球菌HN016菌懸液后羅非魚腸道菌群中排名前10位的菌門（圖7）分別是變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、廣古菌門（Euryarchaeota）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、軟壁菌門（Tenericutes）、厚壁菌門（Firmicutes）、梭菌門（Fusobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、奇古菌門（Thaumarchaeota）和螺旋體門（Spirochaetes），其中變形菌門、擬桿菌門、廣古菌門、互養(yǎng)菌門和軟壁菌門的占比呈上升趨勢，而其他菌門呈下降趨勢。

在屬水平上，口服無乳鏈球菌HN016菌懸液12 h后可引起羅非魚腸道菌群中擬桿菌屬（Bacteroides）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、Romboutsia、不動桿菌屬（Acinetobacter）、愛德華氏菌屬（Edwardsiella）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈球菌屬（Streptococcus）、臨單胞菌屬（Plesiomonas）和梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）的相對豐度上升，同時引起鯨桿菌屬（Cetobacterium）、丙酸菌屬（Propionibacterium）、芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）、Candidatus_Nitrosopumilus、乳球菌屬（Lactococcus）、地桿菌屬（Pedobacter）、Peptoniphilus、普氏菌屬（Prevotella_9）和Blautia的相對豐度下降（圖8-A）;口服24 h后主要引起疣微菌屬（Ruminococcaceae_UCG-014）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、Allobaculum、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、毛螺菌屬（Lachnospiraceae_UCG-005）、vadinBC27_ was-tewater-sludge_group、羅斯氏菌屬（Roseburia）、厭氧棒菌屬（Anaerobaculum）、優(yōu)桿菌屬（[Eubacterium]_coprostanoligenes_group）、unidentified_WCHB1-69、甲烷絲菌屬（Methanosaeta）、疣微菌屬（Ruminococcaceae_UCG-014）和熱桿菌屬（Methanothermobacter）的相對豐度上升，同時引起擬桿菌屬（Bacteroides）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、Romboutsia、鯨桿菌屬（Cetobacterium）和丙酸菌屬（Propionibacterium）的相對豐度下降（圖8-B）。

3 討論

在長期的進化過程中，魚類腸道形成其固有的菌群結(jié)構(gòu)，而這些固有菌群除了參與宿主的營養(yǎng)代謝、輔助消化外，還具有屏障及免疫功能（Gómez and Balcázar，2008;Kelly，2010;Sommer and B?ckhed，2013;Xia et al.，2014）。本研究通過16S rRNA高通量測序技術(shù)對羅非魚腸道菌群進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常羅非魚腸道菌群在屬水平上以鯨桿菌屬、乳球菌屬、Romboutsia、不動桿菌屬、地桿菌屬、普氏菌屬、擬桿菌屬、Candidatus_Nitrosopumilus、芽孢乳桿菌屬和嗜肽菌屬為優(yōu)勢菌群，而其他細菌占腸道菌群總量的60.5%。在種水平上，正常羅非魚腸道也含有無乳鏈球菌（占腸道總菌種數(shù)量的0.32%）。說明無乳鏈球菌是羅非魚的條件性致病菌，在正常情況下由于受機體免疫機能及其他腸道菌群的制衡而無法暴發(fā)致病。根據(jù)已有的文獻報道可知，羅非魚鏈球菌病多流行于高溫季節(jié)，尤其水溫在32 ℃以上時極易暴發(fā)流行（盧邁新，2010;陳家長等，2011;鄧永強和汪開毓，2016）。在本研究中，羅非魚在口服無乳鏈球菌HN016菌懸液后第3 d全部死亡，說明無乳鏈球菌HN016強毒株對羅非魚具有很強的毒力。

雖然魚類腸道固有菌群對病原微生物起屏障作用，但魚類腸道菌群常因品種、年齡、環(huán)境、食物及疾病等因素的影響而發(fā)生改變（Gómez Balcázar，2008;Roeselers et al.，2010;Sommer and B?ckhed，2013）。在菌群失衡的情況下，某些病原菌得到過量繁殖，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生，因此研究病原菌與腸道固有菌群的相互作用機制對防控條件性致病菌具有重要意義。本研究通過對正常羅非魚經(jīng)口灌胃無乳鏈球菌HN016菌懸液，發(fā)現(xiàn)口服12 h 后羅非魚腸道內(nèi)的無乳鏈球菌HN016強毒株數(shù)量達峰值，但口服24 h后其數(shù)量顯著下降，說明此時已有部分口服菌株進入機體其他部位或通過腸道排除。此外，羅非魚口服無乳鏈球菌HN016菌懸液后，其腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生明顯變化，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)及稀釋曲線均顯示口服12 h后羅非魚腸道菌群多樣性降低，但至口服24 h后菌群多樣性上升且高于初始水平，說明此時羅非魚腸道菌群已失衡。類似案例在其他動物也有報道，如大熊貓感染犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）后其腸道內(nèi)菌群構(gòu)成發(fā)生改變，且微生物多樣性呈升高趨勢（Zhao et al.，2017）。人類的胃腸炎和糖尿病也與腸道細菌的豐度及多樣性降低有關(guān)（Nishino et al.，2017;Jandhyala et al.，2017）。可見，菌群結(jié)構(gòu)及其多樣性改變是腸道菌群失衡的重要標志。

隨著高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，魚類疾病對其胃腸道菌群的影響越來越受到關(guān)注。張正等（2015）通過研究皮膚潰瘍病和腹水病發(fā)生對半滑舌鰨腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)皮膚潰瘍病的發(fā)生對半滑舌鰨腸道菌群結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響，但腹水病對半滑舌鰨腸道的優(yōu)勢細菌組成及相對豐度均產(chǎn)生明顯影響。李東亮（2016）研究表明，當(dāng)草魚受到嗜水氣單胞菌感染時，其腸道菌群中的主要優(yōu)勢菌門——厚壁菌門和變形菌門所占比例均隨致病菌感染量的升高而降低，梭桿菌門所占比例則呈上升趨勢;在屬水平上，主要優(yōu)勢菌屬——芽孢桿菌屬和氣單胞菌屬所占比例隨致病菌感染量的升高而降低，而鯨桿菌屬所占比例呈上升趨勢。本研究結(jié)果表明，羅非魚口服無乳鏈球菌HN016菌懸液后其腸道菌群中的變形桿菌門、擬桿菌門、廣古菌門、互養(yǎng)菌門和軟壁菌門所占比例呈上升趨勢，而厚壁菌門、梭菌門、放線菌門、奇古菌門和螺旋體門呈下降趨勢?？梢?，細菌性疾病對魚類腸道菌群的影響作用因病因或品種差異而不同。

口服無乳鏈球菌HN016菌懸液后羅非腸道菌群的變化還體現(xiàn)在屬水平上，表現(xiàn)為正常羅非魚腸道菌群排名前10位的優(yōu)勢菌屬除了擬桿菌屬和不動桿菌屬呈上升之外，其他菌屬如鯨桿菌屬、乳球菌屬和丙酸菌屬等均呈下降趨勢，說明羅非魚腸道內(nèi)大部分優(yōu)勢菌群已受到無乳鏈球菌HN016強毒株的抑制，但同時一些病原菌如鏈球菌屬、愛德華菌屬和假單胞菌屬的構(gòu)成比例呈上升趨勢。劉志剛等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，感染無乳鏈球菌尼羅羅非魚腸道菌群中的鏈球菌屬、分枝桿菌屬和曼氏桿菌屬等致病菌群相對豐度顯著高于健康尼羅羅非魚，而乳球菌屬、鯨桿菌屬和紅球菌屬等益生菌相對豐度顯著低于健康尼羅羅非魚。說明無乳鏈球菌的感染能改變魚類腸道優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)，引起腸道內(nèi)潛在致病菌數(shù)量的增加。由于遲緩愛德華氏菌和熒光假單胞菌的感染癥狀與羅非魚鏈球菌病典型癥狀極為相似，故推測遲緩愛德華氏菌和熒光假單胞菌繼發(fā)感染在羅非魚鏈球菌病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

4 結(jié)論

無乳鏈球菌感染羅非魚后腸道菌群構(gòu)成及其多樣性發(fā)生明顯改變，可引起致病菌愛德華氏菌屬、假單胞菌屬細菌比例的增加，同時引起鯨桿菌屬、丙酸菌屬、乳球菌屬等腸道有益細菌比例的減少，故推測遲緩愛德華氏菌和熒光假單胞菌繼發(fā)感染在羅非魚鏈球菌病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

參考文獻：

陳家長，臧學(xué)磊，胡庚東，瞿建宏，范立民，宋超. 2011. 氨氮脅迫下羅非魚（GIFT Oreochromis niloticus）機體免疫力的變化及其對海豚鏈球菌易感性的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報，20（4）：629-634. [Chen J C，Zang X L，Hu G D，Qu J H，F(xiàn)an L M，Song C. 2011. The immune response of GIFT Oreochromis niloticus and its susceptibility to Streptococcus iniae under stress in different ammonia[J]. Eco-logy and Environmental Sciences，20（4）：629-634.]

程世亮，劉新風(fēng)，鄭文，黃藝丹，張君，鄭建. 2016. 魚類無乳鏈球菌病[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展，37（2）：105-109. [Cheng S L，Liu X F，Zheng W，Huang Y D，Zhang J，Zheng J. 2016. Streptococcus agalactiae infection in fish[J]. Progress in Veterinary Medicine，37（2）：105-109.]

鄧永強，汪開毓. 2016. 魚類無乳鏈球菌病的研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，43（9）：2490-2495. [Deng Y Q，Wang K Y. 2016. Research progress on fish Streptococcus agalactiae disease[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，43（9）：2490-2495.]

馮東岳. 2010. 羅非魚鏈球菌病研究概況[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖，（11）：43-44. [Feng D Y. 2010. Overview of research on streptococcus disease of tilapia[J]. Journal of Aquaculture，（11）：43-44.]

黃艷華，馬沙，韓書煜，黃偉德，韋慕蘭，蒙蘭麗，呂小麗，覃惠明，李德壯，梁靜真，黃鈞. 2018. 2011—2016年廣西羅非魚源無乳鏈球菌的耐藥譜型分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，49（5）：1023-1031. [Huang Y H，Ma S，Han S Y，Huang W D，Wei M L，Meng L L，Lü X L，Qin H M，Li D Z，Liang J Z，Huang J. 2018. Antibiogram types of Streptococcus agalactiae strains isolated from Oreochromis spp. in Guangxi during 2011-2016[J]. Journal of Southern Agriculture，49（5）：1023-1031.]

黎源，王蓓，汪志文，蔡小輝，湯菊芬，魯義善，簡紀常. 2017. 羅非魚無乳鏈球菌傳播途徑與逃避宿主免疫防御策略[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，44（7）：132-140. [Li Y，Wang B，Wang Z W，Cai X H，Tang J F，Lu Y S，Jian J C. 2017. Transmission routes of Streptococcus agalactiae and the stra-tegy of immune evasion in tilapia[J]. Guangdong Agricultural Sciences，44（7）：132-140.]

李東亮. 2016. 感染嗜水氣單胞菌草魚腸道菌群結(jié)構(gòu)研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué). [Li D L. 2016. Study of the intestinal flora structure of grass carp infection with Aeromonas hydrophila[D]. Yangling：Northwest Agriculture & Forestry University.]

李莉萍，王瑞，黃婷，黃維義，梁萬文，李健，黃彥，雷愛瑩，甘西，陳明. 2013. 廣西羅非魚鏈球菌病流行菌株P(guān)CR鑒定和PFGE基因型分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，37（6）：927-935. [Li L P，Wang R，Huang T，Huang W Y，Liang W W，Li J，Huang Y，Lei A Y，Gan X，Chen M. 2013. PCR detection and PFGE genotype analyses of streptococcal clinical isolates from tilapia in Guangxi[J]. Journal of Fisheries of China，37（6）：927-935.]

李莉萍，王瑞，梁萬文，黃婷，羅永巨，雷愛瑩，甘西，陳明. 2015. 羅非魚無乳鏈球菌弱毒株與其母源株部分生物學(xué)特性及免疫原性比較研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，28（5）：2316-2322. [Li L P，Wang R，Liang W W，Huang T，Luo Y J，Lei A Y，Gan X，Chen M. 2015. Biological characteris-tics and immunization of live attenuated Streptococcus agalactiae strain for tilapia with parent[J]. Southeast China Journal of Agricultural Sciences，28（5）：2316-2322.]

梁靜真，黃立春，韋慕蘭，馬沙，黎姍梅，文衍紅，蒙蘭麗，黃維，黃松，黃鈞. 2018. 廣西羅非魚源無乳鏈球菌耐藥性及其四環(huán)素耐藥基因檢測[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，49（10）：2077-2086. [Liang J Z，Huang L C，Wei M L，Ma S，Li S M，Wen Y H，Meng L L，Huang W，Huang S，Huang J. 2018. Detection of antibiotics resistance and tetracycline resistance genes in Streptococcus agalactiae from tilapia in Guangxi[J]. Journal of Southern Agriculture，49（10）：2077-2086.]

林虹，孫九峰，談宇菲，鄧小玲. 2013. 感染羅非魚的無乳鏈球菌對人致病性的研究進展[J]. 華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，39（6）：57-60. [Lin H，Sun J F，Tan Y F，Deng X L. 2013. Advan-ces in the research on human pathogenicity of Streptococcus agalactiae which also infected with tilapia[J]. South China Journal of Preventive Medicine，39（6）：57-60.]

劉志剛，盧邁新，可小麗，王淼，張德鋒. 2018. 尼羅羅非魚腸道及養(yǎng)殖環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)與鏈球菌病的相關(guān)性研究[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，42（10）：1635-1647. [Liu Z G，Lu M X，Ke X L，Wang M，Zhang D F. 2018. Correlation between microflora structure in intestinal tract and aquaculture environment of tilapia（Oreochromis niloticus） and streptococcicosis[J]. Journal of Fisheries of China，42（10）：1635-1647.]

盧邁新. 2010. 羅非魚鏈球菌病研究進展[J]. 南方水產(chǎn)，6（1）：75-79. [Lu M X. 2010. Review of research on Streptococcusis in tilapia[J]. South China Fisheries Science，6（1）：75-79.]

王瑞，李莉萍，黃婷，梁萬文，梁聰，雷愛瑩，陳明. 2015. 羅非魚組織內(nèi)無乳鏈球菌實時熒光定量PCR檢測方法建立[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué)，11（3）：41-46. [Wang R，Li L P，Huang T，Liang W W，Liang C，Lei A Y，Chen M. 2015. Real-time quantitative PCR for detection of Streptococcus agalactiae from tilapia tissue[J]. South China Fishe-ries Science，11（3）：41-46.]

袁偉. 2017. 中國羅非魚源無乳鏈球菌流行特征及耐藥性[D]. 上海：上海海洋大學(xué). [Yuan W. 2017. Epidemiologi-cal characteristics and drug resistance of Streptococcus agalactiae isolated from tilapia in China[D]. Shanghai：Shanghai Ocean University.]

張正，李彬，王印庚，廖梅杰，王嵐，榮小軍. 2015. 基于高通量測序的池塘養(yǎng)殖半滑舌鰨消化道菌群的結(jié)構(gòu)特征分析[J]. 水生生物學(xué)報，39（1）：38-45. [Zhang Z，Li B，Wang Y G，Liao M J，Wang L，Rong X J. 2015. The microflora structure in digestive tract of half-smooth tongue sole（Cynoglossus semilaevis Günther） cultured in outdoor pond basing on high-through sequencing technique[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，39（1）：38-45.]

祝璟琳，柒壯林，李大宇，鄒芝英，肖煒，樂貽榮，韓玨，楊弘. 2014. 羅非魚海豚鏈球菌病的病理學(xué)觀察[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，38（5）：722-730. [Zhu J L，Qi Z L，Li D Y，Zou Z Y，Xiao W，Yue Y R，Han J，Yang H. 2014. Pathological changes in tilapia（Oreochromis niloticus） naturally infec-ted by Streptococcus iniae[J]. Journal of Fisheries of China，38（5）：722-730.]

祝璟琳，楊弘. 2013. 魚源無乳鏈球菌致病機理研究進展[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，33（6）：92-96. [Zhu J L，Yang H. 2013. Review on pathogenesis of Streptococcus agalactiae from fish[J]. Journal of Guangdong Ocean University，33（6）：92-96.]

Gómez G D，Balcázar J L. 2008. A review on the interactions between gut microbiota and innate immunity of fish[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology，52（2）：145-154.

Jandhyala S M，Madhulika A，Deepika G，Rao G V，Reddy D N，Subramanyam C，Sasikala M，Talukdar R. 2017. Altered intestinal microbiota in patients with chronic pancreatitis：Implications in diabetes and metabolic abnorma-lities[J]. Scientific Reports，7：43640. doi：10.1038/srep4 3640.

Kelly P. 2010. Nutrition，intestinal defence and the microbio-me[J]. The Proceeding of the Nutrition Society，69（2）：261-268.

Nayak S K. 2010. Role of gastrointestinal microbiota in fish[J]. Aquaculture Research，41（11）：1553-1573.

Nishino K，Nishida A，Inoue R，Kawada Y，Ohno M，Sakai S，Inatomi O，Bamba S，Sugimoto M，Kawahara M，Naito Y，Andoh A. 2017. Analysis of endoscopic brush samples identified mucosa-associated dysbiosis in inflammatory bowel disease[J]. Journal of Gastroenterology，53（1）：95-106.

Roeselers G，Mittge E K，Stephens W Z，Parichy D M，Cavanaugh C M，Guillemin K，Rawls J F. 2010. Evidence for a core gut microbiota in the zebrafish[J]. The ISME Journal，5（10）：1595-1608.

Sommer F，B?ckhed F. 2013.The gut microbiota—masters of host development and physiology[J]. Nature Reviews. Microbiology，11（4）：227-238.

Thursby E，Juge N. 2017. Introduction to the human gut microbiota[J]. Biochemical Journal，474：1823-1836.

Xia J H，Lin G，F(xiàn)u G H，Wan Z Y，Lee M，Wang L，Liu X J，Yue G H. 2014. The intestinal microbiome of fish under starvation[J]. BMC Genomics，15：266. doi： 10.1186/1471-2164-15-266.

Zhao N，Li M，Luo J，Wang S，Liu S，Wang S，Lyu W，Chen L，Su W，Ding H，He H. 2017. Impacts of canine distemper virus infection on the giant panda population from the perspective of gut microbiota[J]. Scientific Reports，7：39954. doi： 10.1038/srep39954.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）