樺褐孔菌誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡的研究

陳晨 李巖 卓勤 霍軍生 萬麗葵

摘 要：目的：研究樺褐孔菌誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡的作用，為樺褐孔菌在抗腫瘤方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。方法：將不同濃度的樺褐孔菌與人肺癌A549細(xì)胞共同培養(yǎng)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果：樺褐孔菌能夠抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)其凋亡。濃度為2、4mg/mL的樺褐孔菌液作用于A549細(xì)胞48h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率分別顯著下降至83.32%和69.27%（P<0.05，對(duì)照組為92.11%），早期凋亡率分別顯著增至6.47%和8.07%（P<0.01，對(duì)照組為1.98%），總凋亡率顯著增至14.27%和27.54%（P<0.05，對(duì)照組為5.91%），晚期凋亡率增至7.8%（P>0.05）和19.48%（P<0.01，對(duì)照組為3.94%）。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，4mg/mL樺褐孔菌與A549細(xì)胞孵育24h后，G2/M期細(xì)胞顯著增加至22.12%（P<0.01，對(duì)照組為12.5%）;孵育48h后，G0/G1期顯著增加至68.87%（P<0.01，對(duì)照組為59.87%）。結(jié)論：樺褐孔菌能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期以及G2/M期。

關(guān)鍵詞： 樺褐孔菌;A549細(xì)胞;凋亡;細(xì)胞周期

樺褐孔菌是藥用真菌，俗稱白樺茸。國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗氧化、降血壓等多種生物活性[1-7]，但是具體的作用機(jī)制并不清楚。本研究以人肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，探索樺褐孔菌對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞周期與凋亡的影響，為進(jìn)一步探討作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 細(xì)胞 樺褐孔菌樣品來源地為俄羅斯，粉末狀。

1.1.2 試劑 A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫;F-12K培養(yǎng)液，Invitrogen公司;胎牛血清，Gibco公司;AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，BD公司;碘化丙啶，PI，Biolegend公司;CCK-8試劑盒，日本同仁公司;0.25%胰酶，Gibco公司;青鏈霉素，Gibco公司。

1.1.3 儀器 倒置顯微鏡，Nikon公司;酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司;流式細(xì)胞儀，BD公司;低溫冷凍離心機(jī)，貝克曼公司;CO2培養(yǎng)箱，Heal Force公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清、100U/L青霉素、100μg/mL鏈霉素的F-12K完全培養(yǎng)液，于37℃恒溫、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d消化傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 樺褐孔菌溶液的配制 用100℃熱水配制濃度為100mg/mL樺褐孔菌溶液，放置2h冷卻后，用F-12K完全培養(yǎng)液稀釋成濃度為80、40、20、10、5mg/mL的溶液。

1.2.3 A549細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌A549細(xì)胞，用F-12K完全培養(yǎng)液將細(xì)胞調(diào)整為1×105/mL、5×104/mL、2.5×104/mL、1×104/mL濃度的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔100μL，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（100μL F-12K完全培養(yǎng)液），于12、24、48、72h使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)樺褐孔菌對(duì)人肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌A549細(xì)胞，用F-12K完全培養(yǎng)液將細(xì)胞調(diào)整為5×104/mL細(xì)胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入90μL，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h，待A549細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，分別加入不同濃度樺褐孔菌溶液10μL，使受試物最終濃度為10、8、4、2、1、0.5mg/mL，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組（加入10μL F-12K完全培養(yǎng)液）和空白對(duì)照組（90μL F-12K完全培養(yǎng)液+10uL F-12K完全培養(yǎng)基），每組設(shè)6個(gè)平行孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，每孔加入10μL CCK-8試劑，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1～4h，酶標(biāo)儀490nm測(cè)定各孔光密度值（OD）。按式（1）計(jì)算細(xì)胞抑制率，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

細(xì)胞抑制率（%）=（陰性對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%（1）

1.2.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及凋亡 用F-12K完全培養(yǎng)液將細(xì)胞調(diào)整為5×104/mL細(xì)胞懸液，取2mL接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分為4、2、1mg/mL劑量組和陰性對(duì)照組4個(gè)組，孵育過夜。樺褐孔菌用完全培養(yǎng)基稀釋成40、20、10mg/mL，吸去上層培養(yǎng)基，每孔加入1.8mL完全培養(yǎng)基，另加0.2mL相應(yīng)劑量的樺褐孔菌溶液，陰性對(duì)照組加入0.2mL F-12K完全培養(yǎng)基。

（1）細(xì)胞周期檢測(cè)：樺褐孔菌處理細(xì)胞24h和48h后，收集細(xì)胞，調(diào)整為106/mL，PBS洗2次，250r/min離心5min，盡可能去除上清，-20℃預(yù)冷的70%乙醇1mL固定細(xì)胞，逐滴加入，邊加邊振蕩，確保充分的固定又防止細(xì)胞成團(tuán)，4℃固定30min以上。用PBS洗2次，2 000/min離心5min，小心地棄上清，防止細(xì)胞損失。加入50μL 100μg/mL的RNase，37℃孵育30min，加入200μL 50μg/mL碘化丙啶（PI），充分振蕩，孵育15min后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。（2）細(xì)胞凋亡檢測(cè)：樺褐孔菌處理細(xì)胞48h后，收集上清液和底層全部細(xì)胞。加入5μL FITC Annexin V和5μL PI，輕微振蕩，室溫下孵育15min，加入400μL Binding Buffer，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)活細(xì)胞、壞死細(xì)胞、早期凋亡、晚期凋亡細(xì)胞百分比，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。3組以上數(shù)據(jù)的比較，若方差齊，則進(jìn)行方差分析，有顯著性差異時(shí)，使用Dunnet t檢驗(yàn)進(jìn)行各劑量組與對(duì)照組的比較;若方差不齊，使用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行多組比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

如圖1所示，5×104/mL濃度細(xì)胞接種于96孔板后孵育48h即達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 樺褐孔菌對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響

如圖2～3所示，樺褐孔菌孵育A549細(xì)胞48h，隨著樺褐孔菌濃度增加，450nm OD值下降，細(xì)胞抑制率升高，IC50為4.73mg/mL。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

如表2所示，2mg/mL和4mg/mL樺褐孔菌孵育A549細(xì)胞48h后，A549細(xì)胞的活細(xì)胞率顯著下降（P<0.05），早期凋亡率和總凋亡率顯著升高（P<0.01、P<0.05）。4mg/mL劑量組晚期凋亡和壞死細(xì)胞率顯著升高（P<0.01）。如圖4所示，隨著樺褐孔菌濃度升高，晚期凋亡和壞死細(xì)胞率亦升高。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布

如表3所示，樺褐孔菌孵育A549細(xì)胞處理24h后4mg/mL劑量組A549細(xì)胞G2/M期細(xì)胞顯著升高（P<0.01），12mg/mL劑量組A549細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞顯著升高（P<0.05、P<0.01），1、2、4mg/mL劑量組S期細(xì)胞顯著降低（P<0.05、P<0.01、P<0.01）。如表4所示，處理48h后各劑量組A549細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞顯著升高（P<0.01），S期細(xì)胞顯著降低（P<0.05），4mg/mL劑量組G2/M期細(xì)胞顯著升高（P<0.05）。

3 討論

研究表明，樺褐孔菌對(duì)乳腺癌、胃癌、皮膚癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞有抑制作用，其抗腫瘤機(jī)制主要可能是通過影響腫瘤細(xì)胞周期、抑制其增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮作用[8-11]。目前肺癌缺乏有效的治療手段，在中藥中找到能夠抑制腫瘤的高效低毒性的藥物成為研究的熱點(diǎn)之一。CCK-8法是一種操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、步驟少、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好的細(xì)胞活性檢測(cè)方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)者和環(huán)境危害低[12-13]。本研究使用人肺癌A549細(xì)胞，運(yùn)用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，評(píng)價(jià)樺褐孔菌誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡和周期阻滯的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌可降低A549細(xì)胞活力，進(jìn)而由流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。肺腺癌主要與腫瘤細(xì)胞周期紊亂進(jìn)而引起細(xì)胞過度生長(zhǎng)、增殖有關(guān)。細(xì)胞周期依賴性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)展，在細(xì)胞有絲分裂周期不同時(shí)段起重要作用，可引起細(xì)胞周期失衡，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、分化障礙，后導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖，腫瘤隨之發(fā)生[14]。Youn等[15]研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌提取物使肝癌HepG2細(xì)胞阻滯于G0 /G1期，并通過抑制CDK6、CDK4、CDK2、CyclinE、CyclinD1、CyclinD2抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。王文娟[16]等研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌提取物能夠顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，樺褐孔菌提取物使腫瘤細(xì)胞阻滯在G2期，使細(xì)胞增殖受到抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，4mg/mL樺褐孔菌與A549細(xì)胞孵育24h后，G2/M期細(xì)胞顯著增加至22.12%（P<0.01，對(duì)照組為12.5%）;孵育48h后，G0/G1期顯著增加至68.87%（P<0.01，對(duì)照組為59.87%），使細(xì)胞周期阻滯于G2/M和G0/G1期。

本研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌對(duì)人肺癌細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡和周期阻滯作用，使A549細(xì)胞產(chǎn)生G2/M期和G0/G1期阻滯，為樺褐孔菌成為抗肺癌的物質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)，為下一步作用機(jī)制研究打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Abstract：Objective To study apoptosis and cycle arrest of lung cancer cells induced by Inonotus obliquus，and provide new evidence for anti-tumor therapy of Inonotus obliquus.MethodHuman lung cancer cell line A549 was incubated with different concentrations of Inonotus obliquus.Cell viability was measured by CCK-8 method.Apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry.Result Inonotus obliquus inhibitted the growth and induced apoptosis of A549 cells.The results of the Inonotus obliquus groups on the concentrations of 2 mg/mL and 4 mg/mL were compared with control group.Viable cell percentages were significantly decreased to 83.32% and 69.27%，respectively （P<0.05，92.11% in the control group），the early apoptotic rate significantly increased to 6.47% and 8.07% （P<0.01，1.98% in control group），the total apoptotic rate significantly increased to 14.27% and 27.54% （P<0.05，5.91% in control group），the late apoptosis rate significantly increased to 7.8% （P>0.05）and 19.48% （P<0.01，3.94% in control group）.Compared with the control group，the cells in G2/M phase increased significantly to 22.12% after incubating A549 cells with 4mg/mL Inonotus obliquus for 24h （P<0.01，12.5% ?in control group），the cells in G0/G1 phase increased significantly to 68.87% after incubating A549 cells for 48h （P<0.01，59.87% in control group）.Conclusion Inonotus obliquus can induce the apoptosis of A549 cells，and arrest cells in G0/G1 phase and G2/M phase.

Keywords：Inonotus obliquus;A549 cells;apoptosis;cell cycle

（責(zé)任編輯 唐建敏）