超聲波輔助提取天麻總酚工藝的研究

田孟華，楊新周，張國(guó)美，周瑞，丁培超，馬勛靜

（1.昭通市天麻研究院，云南昭通657000；2.德宏師范高等專科學(xué)校民族醫(yī)藥研究所，云南德宏678400；3.昭通市天麻特產(chǎn)局，云南昭通657000）

天麻（Gastrodia elata Blume）為蘭科天麻屬真菌異養(yǎng)型多年生草本植物，其干燥塊莖入藥。是我國(guó)常用名貴的中藥材和出口創(chuàng)匯的主要藥材品種之一，主產(chǎn)于四川、云南、貴州、陜西等省[1]。臨床多用于頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風(fēng)、癲癇、抽搐、破傷風(fēng)等癥，現(xiàn)代藥理研究表明，天麻還具有增智健腦、清除自由基、延緩衰老的作用，并對(duì)老年性癡呆具有一定療效。文獻(xiàn)研究表明[2-5]，天麻中主要含有酚及其苷類，如天麻素、對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷等；有機(jī)酸類，如琥珀酸、棕桐酸、檸檬酸等；甾醇類，如β-谷甾醇、胡蘿卜苷；含氮類，如氨基酸、天麻多肽、天麻羥胺；多糖類等多種化合物?！吨袊?guó)藥典》2015年版中天麻質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定也主要以天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量作為重要的參考指標(biāo)。

隨著化學(xué)成分和藥理研究的深入，更多的報(bào)道顯示，天麻的酚類成分是天麻主要活性物質(zhì)。對(duì)天麻的鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、擴(kuò)張平滑肌、抗血小板聚集的藥理作用強(qiáng)度與天麻素含量比較發(fā)現(xiàn)，兩者并未呈現(xiàn)正相關(guān)[6]。此外，張維明等從昭通天麻中提取的5個(gè)酯溶性酚性成分，并且明確了天麻的血管平滑肌松弛作用是這5個(gè)成分共同作用的結(jié)果[7]。云南大學(xué)的陶云海指出天麻的藥理作用不能等同于天麻素，其他酚性成分對(duì)于其藥效的發(fā)揮也是不可或缺的[8]。另外，以天麻素、對(duì)羥基苯甲醇及其衍生物與檸檬酸在不同羧基位點(diǎn)酯合形成的巴利森苷類化合物，是天麻中占比最大的一類物質(zhì)之一，目前已經(jīng)鑒定的巴利森苷類化合物就有33個(gè)[9-10]?，F(xiàn)代藥理研究表明，在改善空間學(xué)習(xí)記憶能力、抗精神病效應(yīng)和抗細(xì)胞衰老作用方面，parishin和parishin C都要強(qiáng)于天麻素[11]。因此用天麻中酚類成分指標(biāo)來衡量天麻的質(zhì)量可能更為合理，也可能是鑒別天麻道地性的重要依據(jù)。

本試驗(yàn)通過福林酚（Folin-Ciocaieu）比色法測(cè)定天麻總酚，采用超聲醇提法對(duì)影響天麻中總酚提取的因素進(jìn)行了單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，旨在為天麻中總酚提取條件的優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

沒食子酸（純度98.5%）、福林酚試劑（生化試劑）、無水Na2CO3（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水。

UV-1750型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；CP1502C、CP124C電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SK250LHC型（35/53 kHz超聲清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；FST-PE-UP型普利菲爾超純水機(jī)：上海富詩(shī)特儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 天麻粉樣品制備

天麻采于云南省昭通市彝良縣小草壩鄉(xiāng)烏葩嶺天麻科技示范園，經(jīng)昭通市天麻研究院田孟華鑒定為天麻。鮮天麻清洗、蒸制、烘干，取天麻干燥塊莖，粉碎，過篩，備用。

1.2.2 超聲波提取總酚工藝

精密稱取2 g天麻粉（精確到0.000 1 g），置于具塞三角瓶中，精密加入一定量的乙醇溶液，稱重，浸泡24 h，超聲提?。?5 kHz，250 W），冷卻至室溫，再稱重，用乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，濾過，取上清液，得待測(cè)液，備用。

1.2.3 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，用水溶解并定容至250 mL，搖勻，制成0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別移取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL于25 mL容量瓶中，分別加水5.0 mL，混勻，加福林酚試劑1.5 mL，混勻，室溫放置6 min，加20%碳酸鈉溶液1.5 mL，用水稀釋至25 mL，定容，30℃水浴加熱30 min，取出，搖勻，在765 nm處測(cè)定吸光度值（A），以A為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 總酚測(cè)定

Folin-Ciocaieu比色法[12-13]。取0.5 mL待測(cè)液于25 mL容量瓶中，加入5.0 mL水，混勻，加入1.5 mL福林酚試劑，混勻，室溫放置6 min，加20%碳酸鈉溶液1.5 mL，用水稀釋至25 mL，定容，30℃水浴加熱30 min，取出，搖勻，冷卻至室溫，待測(cè)。采用Folin-Ciocaileu比色法，于765 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算樣品中的天麻總酚含量。

1.2.5 單因素試驗(yàn)條件選擇

1.2.5.1 粒徑大小對(duì)天麻總酚含量的影響

分別精密稱取粒徑為 20、40、60、80、100 目的干燥天麻粉2 g（精確到0.000 1 g）于具塞三角瓶中，按液料比15∶1（mL/g）加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇水溶液，稱重，浸泡 24 h，超聲提取 30 min（35 kHz，250 W），冷卻至室溫，再稱重，用乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，濾過，取上清液，測(cè)定總酚含量。

1.2.5.2 液料比對(duì)天麻總酚含量的影響

精密稱取60目的干燥天麻粉2g（精確到0.0001g），按液料比 15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35 ∶1（mL/g），加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，稱重，浸泡24 h，超聲提取30 min（35 kHz，250 W），冷卻至室溫，再稱重，用乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，濾過，取上清液，測(cè)定總酚含量。

1.2.5.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)天麻總酚含量的影響

精密稱取60目的干燥天麻粉2g（精確到0.0001g），按照液料比 30∶1（mL/g）分別加入 40%、50%、60%、70%和80%的乙醇溶液，稱重，浸泡24 h，超聲提取30 min（35 kHz，250 W），冷卻至室溫，再稱重，用乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，濾過，取上清液，測(cè)定總酚含量。

1.2.5.4 提取時(shí)間對(duì)天麻總酚含量的影響

精密稱取60目的干燥天麻粉2g（精確到0.0001g），按照液料比30∶1（mL/g）加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇60 mL，稱重，浸泡 24 h，分別按 10、20、30、40、50 min超聲提?。?5 kHz，250 W），冷卻至室溫，再稱重，用乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，濾過，取上清液，測(cè)定總酚含量。

1.2.6 正交試驗(yàn)

選取粒徑、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，考察各因素對(duì)總酚含量的影響，因素水平變見表1。

表1 因素和水平Table 1 Levels and factors of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

繪制沒食子酸吸光度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在2 μg/mL~8 μg/mL范圍內(nèi)，吸光值與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，擬合線性回歸方程為：y=8.390 8x（y為質(zhì)量濃度，x為質(zhì)量濃度），r=0.999 5。

天麻總酚含量按下式計(jì)算：

式中：X為測(cè)定樣品的天麻總酚含量，mg/g；A為測(cè)定液吸光值；A0為空白吸光值；V1為樣品提取液體積，mL；50 為稀釋倍數(shù)；V2為測(cè)定用樣液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 粒徑大小對(duì)天麻總酚含量的影響

天麻粉粒徑對(duì)總酚含量的影響見圖1。

圖1 天麻粉粒徑對(duì)總酚含量的影響Fig.1 Effect of particle size on content of total phenol

由圖1可知，在20目～100目的粒徑大小范圍內(nèi)天麻總酚含量隨天麻粉粒徑減小而增大，20目～60目范圍內(nèi)總酚含量增幅相對(duì)較大，60目時(shí)為3.74 mg/g，粒徑目數(shù)大于60目以后總酚含量增幅較小，80目時(shí)達(dá)到最大值3.86 mg/g。但天麻粒徑目數(shù)大于60目時(shí)提取液粘度增大，操作困難，因此選擇天麻粉粒徑60目作為最佳天麻粉粒徑大小。

2.2.2 液料比對(duì)天麻總酚含量的影響

液料比對(duì)天麻總酚含量的影響見圖2。

圖2 液料比對(duì)天麻總酚含量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on content of total phenol

由圖2可知，隨著液料比的增大，天麻總酚含量逐漸增加，當(dāng)液料比為30∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最大值4.13 mg/g，因此選擇液料比 30∶1（mL/g）作為最佳天麻總酚提取液料比條件。

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)天麻總酚含量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)天麻總酚含量的影響見圖3。

圖3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)天麻總酚含量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on content of total phenol

由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%之間，總酚含量呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)達(dá)到最大值4.38 mg/g。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%，總酚含量呈明顯下降，這可能是由于部分天麻酚性成分親水性較好造成，因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%作為最佳提取條件。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)天麻總酚含量的影響

提取時(shí)間對(duì)天麻總酚含量的影響見圖4。

由圖4可知，超聲提取時(shí)間在10 min～30 min之間，天麻總酚含量呈小幅遞增趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，含量最大，為4.38 mg/g，超聲時(shí)間大于30 min，總酚含量呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢(shì)。整個(gè)提取時(shí)間對(duì)天麻總酚含量影響較小，這可能和樣品在超聲前浸泡24 h處理有關(guān)，主要部分已經(jīng)在浸泡過程中已經(jīng)提取出來，因此選擇30 min作為最佳的超聲提取時(shí)間。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)天麻總酚含量的影響Fig.4 Effect of extraction time on content of total phenol

2.3 天麻總酚提取工藝優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表2結(jié)果可以看出，以天麻總酚含量為指標(biāo)，4個(gè)影響因子的極差R大小順序?yàn)椋篊＞A＞B＞D。以極小值D因素為誤差列進(jìn)行方差分析（表3），C和A因素影響極顯著，B因素影響顯著。確定最佳提取工藝組合為：A2B3C1D2，即 60 目天麻粉，液料比 40 ∶1（mL/g），乙醇溶液濃度40%，超聲提取30 min（35 kHz、250 W）。

2.4 優(yōu)化工藝驗(yàn)證

按照優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明總酚平均含量為4.47 mg/g，RSD為1.24%，表明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定性好，方法可行。

表3 總酚提取工藝方差分析Table 3 Variance analysis of extraction process on total polyphenols

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助提取和Folin－Ciocalteu比色法測(cè)定了天麻總酚含量。通過單因素和正交試驗(yàn)獲得超聲波輔助提取天麻總酚最佳工藝為：粒徑大小為60目的天麻粉，液料比為40∶1（mL/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，超聲提取30 min（35kHz、250 W）。在此條件下天麻總酚提取效率高，工藝穩(wěn)定性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，工藝簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)，是天麻總酚的理想提取方法。

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