茶多酚對(duì)脊髓損傷大鼠急性期氧自由基與炎癥因子的影響

鄧?guó)P君　曾婭玲　龔勇珍　廖端芳

〔摘要〕 目的 研究茶多酚（tea polyphenols， TP）對(duì)大鼠脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）急性期抗氧化與抗炎的作用。方法SD雌性大鼠隨機(jī)分為6組，每組6只，建立大鼠脊髓半切SCI模型，分為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性藥組（甲基強(qiáng)的松龍100 mg/kg）、TP高劑量組（100 mg/kg）、TP中劑量組（50 mg/kg）、TP低劑量組（25 mg/kg）。術(shù)后5 min，假手術(shù)組和模型組灌胃生理鹽水（10 mL/kg），其他組別灌胃相應(yīng)藥物。24 h后取受損脊髓局部組織，HE染色觀察脊髓組織形態(tài)學(xué)變化，測(cè)定脊髓組織中·O2-、NO水平及誘導(dǎo)型-化氮合酶（iNOS）蛋白含量、抗氧化酶系統(tǒng)SOD與MDA活性以及血清中炎癥因子IL-1β、IL-6與IL-8的含量。結(jié)果 HE染色圖像顯示，TP各劑量組脊髓形態(tài)好于模型組;同時(shí)，與模型組比較，TP降低了SCI大鼠脊髓組織中活性氧（ROS）的水平、增加了SOD活性、降低了MDA含量（P<0.05），亦減少了血清炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8的含量（P<0.05）。結(jié)論 茶多酚能減少SCI大鼠急性期氧自由基與炎癥因子的表達(dá)。

〔關(guān)鍵詞〕 脊髓損傷;茶多酚;活性氧簇;白細(xì)胞介素-1β;白細(xì)胞介素-6;白細(xì)胞介素-8

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5;R651.2? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.09.006

Effects of Tea Polyphenols on Oxygen Free Radicals and Inflammatory Factors in

Acute Phase of Rats with Spinal Cord Injury

DENG Fengjun1，2， ZENG Yaling2， GONG Yongzhen2*， LIAO Duanfang2

（1. Yiyang Medical College， Yiyang， Hunan 413000， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine，

Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To study the anti-oxidation and anti-inflammatory effect of tea polyphenols （TP） in acute phase of rats with spinal cord injury （SCI）. Methods SD female rats were randomly divided into 6 groups， with 6 rats in each group. SCI rat model was established by hemisection at spinal cord. SCI rats were divided into a sham operation group， a model group， a positive drug group （methylprednisolone 100 mg/kg）， a TP high dose group （100 mg/kg）， a TP middle dose group （50 mg/kg） and a TP low dose group （25 mg/kg）. After 5 min of finishing the operation， the sham operation group and the model group were given normal saline （10 mL/kg） by gavage， and the other groups were given corresponding drugs by gavage. After 24 h， local tissue of damaged spinal cord was taken. Morphological changes of spinal cord tissue were observed by HE staining. Contents of O·2-， NO， and iNOS protein in spinal cord tissue， the activity of SOD and MDA in antioxidase system， and contents of inflammatory factors IL-1β， IL-6 and IL-8 in serum were determined. Results HE staining showed that the morphology of spinal cord in the TP groups was better than that in the model group. Compared with the model group， TP decreased the level of reactive oxygen species （ROS） in spinal cord tissue， increased the SOD activity， decreased the MDA content （P<0.05）， and also decreased the contents of inflammatory factors IL-1β， IL-6 and IL-8 in serum of SCI rats （P<0.05）. Conclusion TP can reduce the expressions of oxygen free radicals and inflammatory factors in acute phase of SCI rats.

〔Keywords〕 spinal cord injury （SCI）; tea polyphenols （TP）; reactive oxygen species （ROS）; interleukin-1β （IL-1β）; interleukin-6 （IL-6）; interleukin-8 （IL-8）

脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）作為目前最嚴(yán)重的災(zāi)難性損傷給患者家庭與社會(huì)造成了沉重負(fù)擔(dān)。SCI病理病機(jī)復(fù)雜，迄今為止尚無(wú)特別有效的治療方法。SCI包括不可逆難治療的原發(fā)性損傷和可逆性治療手段可介入的繼發(fā)性損傷[1]。藥物治療是預(yù)防繼發(fā)性損傷的有效方式。研究表明，抗氧化劑白藜蘆醇等通過(guò)抑制氧自由基、激活抗氧化酶系統(tǒng)，在SCI后修復(fù)受損脊髓組織，促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)[2]。茶多酚（tea polyphenols，TP）亦是高效天然抗氧化劑，源自于綠茶，是綠茶中最主要活性成分，能高效清除自由基，亦能抑制與自由基有關(guān)的酶，產(chǎn)生顯著的抗炎抗氧化作用[3]。TP能透過(guò)血腦屏障，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，減少氧自由基所致神經(jīng)細(xì)胞損傷，具有潛在治療神經(jīng)損傷疾病的價(jià)值[4]。但是TP對(duì)脊髓損傷作用的研究還少見(jiàn)報(bào)道。本文擬研究TP對(duì)SCI大鼠急性期抗炎與抗氧化作用，期探討TP對(duì)SCI急性期氧自由基與炎癥因子的作用。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠36只，SPF級(jí)，健康雌性，二月齡，質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)、清潔、安靜，22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，飼養(yǎng)一周待動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境后造模給藥處理，每日按時(shí)供給水和飼料。

1.2? 實(shí)驗(yàn)試劑

TP：質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，江西綠康天然產(chǎn)物公司，批號(hào)F14079501，生理鹽水現(xiàn)用現(xiàn)配。甲基強(qiáng)的松龍（MPSS）：比利時(shí)，批號(hào)141267，生理鹽水現(xiàn)用現(xiàn)配。

MDA、SOD、超氧自由基（·O2-）、NO試劑盒（南京建成）。白細(xì)胞介素（IL-1β、IL-6、IL-8）ELISA試劑盒（批號(hào)依次為301330023113EIA、301330011112EIA、301330101213EIA， ADL公司，USA）。

兔抗iNOS多克隆抗體：ab15323，Abcam，USA，1∶200（V/V）。兔抗GAPDH多克隆抗體：sc137179，Santa Cruz，USA，1∶10 000（V/V）。山羊抗兔 IgG：二抗，sc-2004，Santa Cruz，USA，1∶10 000（V/V）。

1.3? 儀器設(shè)備

752型紫外分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器一廠），XDS-1B倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）;TGL-16A低溫離心機(jī)（長(zhǎng)沙平凡儀器儀表公司），DY89-II型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），BP121S電子天平（德國(guó)Sartorious公司）;G42電泳儀、Fastblot B31蛋白質(zhì)快速半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)均購(gòu)于德國(guó)Biometra公司。

2 方法

2.1? 脊髓半切模型建立

選T10節(jié)段（T8椎板）作損傷節(jié)段，右側(cè)半切脊髓[5]。大鼠以水合氯醛（300 mg/kg，i.p.）麻醉，俯臥四肢伸展固定于自制鼠臺(tái)。在T10節(jié)段右側(cè)橫行切斷脊髓，切斷脊髓后，可見(jiàn)大鼠右后肢抽搐數(shù)次后軟癱。明膠海綿填塞斷端間隙，逐層縫合肌肉、筋膜、皮膚，皮下注射5 mL生理鹽水預(yù)防半切術(shù)后脫水。

2.2? 分組與干預(yù)

SD雌性大鼠分為6組，每組6只，第一組為假手術(shù)組，采用與模型組一致的手術(shù)過(guò)程，打開(kāi)椎管暴露脊髓，但不進(jìn)行半切;其余各組脊髓進(jìn)行右側(cè)半切，分為模型組、陽(yáng)性藥組（甲基強(qiáng)的松龍100 mg/kg）、TP高劑量組（100 mg/kg）、TP中劑量組（50 mg/kg）、TP低劑量組（25 mg/kg）。術(shù)后5 min，假手術(shù)組和模型組灌胃生理鹽水（10 mL/kg），其他組別灌胃生理鹽水配制的藥物。

2.3? 取材與檢測(cè)

2.3.1? 心臟灌流? 干預(yù)24 h后取材。水合氯醛（0.3 g/kg，i.p.）麻醉后心臟灌流，從左心室注入，右心耳流出。37 ℃生理鹽水快速推注150 mL，后滴注200 mL（60滴/min），灌注直至右心耳流出的生理鹽水變清亮，肺和肝變白。

2.3.2? HE病理組織染色? 心臟灌流后，4%多聚甲醛10 min內(nèi)緩慢推注60 mL后，再滴注200 mL（30滴/min），原切口處剪下4 cm脊柱，以損傷處為中心取下2 cm脊髓，預(yù)冷的生理鹽水洗凈組織，濾紙吸干水分，放入EP管中（內(nèi)有4%多聚甲醛溶液1 mL）避光保存待做病理切片。

2.3.3? 活性氧簇水平測(cè)定? 心臟灌流后原切口處剪下4 cm脊柱，剝離取下4 cm脊髓，冰冷的生理鹽水洗凈組織，濾紙吸干水分。精準(zhǔn)稱(chēng)重組織，冰上操作加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，3 000 r/min，離心10 min，取上清加入生理鹽水按1∶9稀釋成1%的組織勻漿，根據(jù)試劑盒測(cè)定·O2-、NO水平。

2.3.4? iNOS蛋白含量測(cè)定? 脊髓組織100 mg加入0.5 mL RIPA裂解液4 ℃裂解1 h。12 000 r/min、 4 ℃離心20 min，取上清。加入上樣緩沖液，煮5 min讓蛋白變性。每孔上樣總蛋白8 μL，15% SDS-聚丙烯凝膠濃縮膠電壓80 V，分離膠120 V電泳2 h，80 mA轉(zhuǎn)膜30 min。室溫下封閉2 h（用50 g/L牛血清白蛋白的TBST緩沖液），然后分別加入一抗：兔抗iNOS多克隆抗體（1∶200）、兔抗GAPDH多克隆抗體（1∶10 000），4 ℃過(guò)夜。再分別加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h[山羊抗兔 IgG （H+L）/HRP，1∶10 000]。ECL發(fā)光試劑盒顯影，用Image-Pro軟件分析條帶吸光值。

2.3.5? 抗氧化酶系統(tǒng)活性測(cè)定? 根據(jù)試劑盒測(cè)定1%的組織勻漿中SOD、MDA水平，方法同“2.3.3”。

2.3.6? 血清IL-1β、IL-6與IL-8含量測(cè)定? 給藥24 h后摘右眼球取血5 mL。血液22 ℃靜置2 h，4 ℃冰箱放置18～22 h，2 000 r/min 離心20 min，取上清，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行血清炎癥因子含量測(cè)定。

2.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”表示。SPSS 17.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，各組之間多重比較方差齊性采用LSD法，方差不齊采用Dunnett’s法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? TP對(duì)脊髓組織病理形態(tài)的影響

HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察，假手術(shù)組大鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜完整，神經(jīng)細(xì)胞分布均勻、形態(tài)正常，神經(jīng)纖維排列整齊，細(xì)胞間基質(zhì)均勻。模型組脊髓組織在損傷區(qū)中央見(jiàn)大片血細(xì)胞，出現(xiàn)囊腔樣變化，細(xì)胞腫脹、空泡變性，并有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。TP高劑量組組織結(jié)構(gòu)排列較完整，神經(jīng)纖維排列整齊，細(xì)胞間基質(zhì)較均勻，偶見(jiàn)炎性水腫。TP中、低劑量組脊髓組織空泡減輕，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但低于模型組。見(jiàn)圖1。

3.2? TP對(duì)SCI大鼠脊髓中活性氧簇的影響

大鼠脊髓右側(cè)半切24 h后，與假手術(shù)組相比，脊髓組織對(duì)·O2-活性抑制能力下降，NO水平與iNOS蛋白表達(dá)上升（P<0.01）。TP高、中、低3個(gè)劑量組給藥24 h后，與模型組相比，脊髓組織對(duì)·O2-活性抑制能力增加，NO水平與iNOS蛋白表達(dá)均下降（P<0.05或P<0.01）。與高劑量組相比，TP中、低劑量抑制·O2-活性能力低于高劑量，TP低劑量降低NO水平能力低于高劑量（P<0.05），其余指標(biāo)3個(gè)劑量TP組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。iNOS蛋白表達(dá)條帶灰度值越小，說(shuō)明iNOS蛋白表達(dá)量越少，見(jiàn)圖2。

3.3? TP對(duì)SCI大鼠抗氧化酶系統(tǒng)的影響

脊髓組織右側(cè)半切24 h后，與假手術(shù)組相比，組織中SOD活性下降，MDA水平增加（P<0.01，表2）。TP高、中、低3個(gè)劑量給藥24 h后，與模型組比較，脊髓組織中SOD活性增加，MDA含量減少（P<0.05或P<0.01，表2）。3個(gè)劑量TP組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3.4? TP對(duì)血清炎癥因子的影響

大鼠脊髓半切24 h后，與假手術(shù)組相比，血清炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8含量均增加（P<0.01，表3）。TP高、中、低3個(gè)劑量給藥24 h后，與模型組相比，血清IL-1β、 IL-6、IL-8含量均減少（P<0.05或P<0.01，表3）。與高劑量組相比，TP低劑量組對(duì)IL-6、IL-8含量的影響低于高劑量（P<0.05或P<0.01，表3）;其余指標(biāo)3個(gè)劑量TP組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

4 討論

SCI是一種后果嚴(yán)重、災(zāi)難性的神經(jīng)損傷，其中具有可逆性并可被調(diào)控的繼發(fā)性損傷急性期主要表現(xiàn)為氧自由基損傷、炎癥因子聚集等，因而具有抗氧化抗炎的藥物成為治療SCI的重要手段，如被美國(guó)FDA唯一批準(zhǔn)治療SCI的藥物MPSS，以及臨床常用的神經(jīng)節(jié)苷脂。但是這兩種藥物或者毒副作用明顯，或者療效不穩(wěn)定。高效抗氧化劑成為了SCI研究近幾年的熱門(mén)方向。本文探討了天然高效抗氧化劑TP對(duì)SCI的作用。TP源自綠茶，能清除自由基，具有抗炎、抗衰老、提高免疫力、防癌等一系列優(yōu)異功能，且易通過(guò)血腦屏障，清除自由基[6]。因此，我們推測(cè)它也許能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，治療神經(jīng)細(xì)胞損傷性疾病。

繼發(fā)性脊髓損傷急性期機(jī)體產(chǎn)生ROS，主要包括·O2ˉ、NO和H2O2等，損害機(jī)體引起多種途徑的細(xì)胞功能紊亂。·O2ˉ自由基能夠間接啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，破壞生物大分子如DNA、酶等。NO是體內(nèi)最活躍的自體活性物質(zhì)，過(guò)量的NO參與許多病理?yè)p傷過(guò)程，而iNOS能誘導(dǎo)產(chǎn)生NO，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。機(jī)體在氧化代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生少量的自由基，機(jī)體本身亦存在抗氧化系統(tǒng)，包括清除ROS的GSH-Px、SOD等，用以維持氧自由基的代謝平衡[8]。SOD活性愈高，機(jī)體清除氧自由基能力愈強(qiáng);與SOD密切相關(guān)的另一物質(zhì)MDA是過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，其水平越高，細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度越明顯[9]。本文研究結(jié)果顯示，SCI大鼠急性期脊髓組織抑制·O2ˉ能力下降，NO水平與iNOS蛋白含量均增加，TP給藥后，各濃度組抑制·O2ˉ能力增加，高劑量效果優(yōu)于中低劑量;NO水平降低，中高劑量?jī)?yōu)于低劑量;3個(gè)劑量TP組均能降低iNOS蛋白含量，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明TP能有效拮抗SCI急性期的氧自由基的活性。同時(shí)TP處理后，受損脊髓組織內(nèi)SOD活性升高，MDA水平下降，且3個(gè)劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示TP能提高受損脊髓組織抗氧化酶系統(tǒng)的活性。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)會(huì)出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和白細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)而誘導(dǎo)釋放IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等前炎癥因子。脊髓損傷后，產(chǎn)生的前炎癥因子可加重繼發(fā)性損傷的程度。研究認(rèn)為，SCI后急性期產(chǎn)生的IL-lβ具有啟動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和加劇炎癥反應(yīng)的作用，IL-6是參與全身炎性反應(yīng)綜合癥的眾多介質(zhì)中最有影響的促炎因子，IL-8是一種有效的炎性介質(zhì)，趨化和刺激中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，從而介導(dǎo)炎性反應(yīng)[10-11]。SCI急性期，IL-1β、IL-6與IL-8水平明顯增高，是急性時(shí)相的一種表現(xiàn)，使脊髓在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上進(jìn)一步導(dǎo)致局部缺血而加重脊髓繼發(fā)性損傷[12]。本研究發(fā)現(xiàn)TP能減少SCI大鼠血清中IL-1β、IL-6與IL-8水平，說(shuō)明TP通過(guò)抑制炎癥因子釋放，產(chǎn)生顯著抗炎作用，從而有效保護(hù)受損脊髓。

綜上所述，TP能降低受損脊髓組織活性氧簇水平，提高抗氧化酶系統(tǒng)活性，減少炎癥因子的釋放，說(shuō)明TP對(duì)繼發(fā)性SCI急性期可能具有一定的保護(hù)作用。本研究為SCI防治提供了一種可能有效的活性成分。尚需進(jìn)一步研究的是TP對(duì)SCI慢性期藥效學(xué)觀察及其抑制SCI的分子作用機(jī)制。

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