基于GC-MS 指紋圖譜和多元統(tǒng)計(jì)學(xué)區(qū)分四川保寧醋和山西老陳醋的揮發(fā)性差異代謝產(chǎn)物

鄺格靈，李 樹，寧甜甜，趙國忠*

（省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

世界大部分國家都將醋作為酸性調(diào)味品，醋的生產(chǎn)和消費(fèi)在中國已有3 000多年的歷史，每個(gè)地區(qū)都有自己的地方醋。山西老陳醋是中國著名的傳統(tǒng)食醋之一，由高粱、豌豆、麥麩、谷糠和稻殼經(jīng)多種真菌和細(xì)菌開放式固態(tài)發(fā)酵而成，已有近3 000年的歷史，被選為國家非物質(zhì)文化遺產(chǎn)[1]。四川保寧醋，起源于1618年的閬中市，是四川最著名的麩皮醋，是以生麥麩、蒸高粱或糯米為主要原料，通過增加中國傳統(tǒng)草藥，如杜仲、砂仁、甘草等發(fā)酵而成[2]。由于原料基礎(chǔ)不同、加工工藝不同、參與發(fā)酵的優(yōu)勢微生物群落不同，造成它們在品質(zhì)風(fēng)格上存在一定差異。醋的香氣成分對醋的品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。對醋的香氣進(jìn)行表征和鑒定，將有助于解釋不同產(chǎn)品之間的差異[3]。

氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)是一種穩(wěn)健的代謝組學(xué)工具[4]，是目前應(yīng)用最廣泛的食品揮發(fā)物分析技術(shù)和方法之一[5]。主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種無監(jiān)督的多元變量統(tǒng)計(jì)分析方法，是在多元分析中使用最多的工具[6]。它使用少量的綜合變量（主成分）取代原先的復(fù)雜多變量，從而能在最大程度保留數(shù)據(jù)原有信息的情況下，降低數(shù)據(jù)復(fù)雜度，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理[7]。而正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）是一種有監(jiān)督的多元統(tǒng)計(jì)方法，用以加強(qiáng)PCA中已經(jīng)建立的觀察組之間的弱分離，從而更好地區(qū)分兩組之間的差異[8]。它不僅能實(shí)現(xiàn)樣品差異的鑒別，還能獲得樣品差異的特征標(biāo)記物，有利于對樣品不同產(chǎn)地、不同部位、不同加工方式等的快速鑒別[9]。

本研究采集四川保寧醋6 份，山西老陳醋9 份，以此為研究對象，采用GC-MS指紋圖譜對其揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，并結(jié)合PCA和OPLS-DA等多變量統(tǒng)計(jì)分析方法探討對山西老陳醋和四川保寧醋的差異貢獻(xiàn)最大的潛在標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)擬為進(jìn)一步分析不同食醋的質(zhì)量和風(fēng)格特色的形成提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)原料購自當(dāng)?shù)爻屑熬W(wǎng)上專賣店，樣品常溫保存。S1～S6為四川保寧醋，S7～S15為山西老陳醋。樣品信息見表1。

2-辛醇（色譜純） 美國Alfa Aesar公司；C6～C25正構(gòu)烷烴 美國AccuStandard公司；其他化學(xué)試劑都為國產(chǎn)分析純。

表1 樣品信息Table 1 Information about the vinegar samples used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司；75 μm CAR/PDMS萃取頭、頂空瓶 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；磁力攪拌器 德國IKA公司；ME3002E電子分析天平美國梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

用蒸餾水將樣品稀釋10 倍，吸取6 mL于15 mL頂空瓶中，加入1.5 g氯化鈉和30 μL 2-辛醇（0.125 mg/L的2-辛醇-甲醇溶液），并加轉(zhuǎn)子，聚四氟乙烯封口，于50 ℃、600 r/min磁力攪拌器水浴平衡10 min，然后插入75 μm CAR/PDMS萃取頭（使用前按說明進(jìn)行老化）頂空吸附40 min，吸附結(jié)束拔出萃取頭，迅速插入GC-MS進(jìn)樣口中，于250 ℃解吸5 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

1.3.2 GC-MS條件

GC條件：Rtx-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持3 min，以4 ℃/min升溫至150 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min升溫至250 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為氦氣，純度99.999%，流速1 mL/min；進(jìn)行方式：手動(dòng)；進(jìn)樣模式：分流進(jìn)樣，分流比為10∶1。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；傳輸線溫度220 ℃；溶劑延遲時(shí)間1.5 min；質(zhì)量掃描范圍m/z35～500；掃描模式為全掃描。

1.4 數(shù)據(jù)處理

定性和定量分析：采用正構(gòu)烷烴的標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用Rtx-5MS計(jì)算每種物質(zhì)的相對保留指數(shù)，并對比文獻(xiàn)資料中Rtx-5MS色譜柱下每種物質(zhì)的相對保留指數(shù)，同時(shí)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST11和Wiley準(zhǔn)確鑒定15 個(gè)樣品的揮發(fā)性成分。同時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量，得到各組分的相對含量。利用SIMCA-P+14.1軟件，采用PCA方法對保寧醋和山西醋的質(zhì)量穩(wěn)定性和一致性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，同時(shí)基于OPLS-DA找出潛在標(biāo)志性差異性化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 四川保寧醋和山西老陳醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定結(jié)果

表2 樣品的揮發(fā)性成分及其相對含量Table 2 Types and relative amounts of volatile components of vinegar simples

經(jīng)SPME-GC-MS分離和鑒定，6 種四川保寧醋分別鑒定出89、86、94、90、98、102 種化合物，其中在6 種保寧醋中均檢測到的化合物有26 種，作為四川保寧醋的特征風(fēng)味物質(zhì)；9 種山西老陳醋分別鑒定出91、89、106、110、87、71、94、96、86 種化合物，9 種山西老陳醋中8 種以上檢測到的物質(zhì)有27 種，視為山西老陳醋的特征風(fēng)味物質(zhì)。將兩者各自的特征物質(zhì)結(jié)合在一起，共得到35 種物質(zhì)，包括醇、醛、酸、酯、酚、酮以及雜環(huán)化合物，見表2。序號(hào)1～8為四川保寧醋特有特征物質(zhì)，序號(hào)9～25為四川保寧醋和山西醋的共有特征物質(zhì)，序號(hào)26～35為山西醋特征物質(zhì)。以此為指標(biāo)通過PCA和OPLS-DA等多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析四川保寧醋和山西老陳醋的揮發(fā)性差異代謝產(chǎn)物。

2.2 四川保寧醋和山西老陳醋的代謝組學(xué)差異分析

2.2.1 PCA結(jié)果

圖1 2 種食醋揮發(fā)性風(fēng)味組分PCA的分?jǐn)?shù)散點(diǎn)圖Fig. 1 Score scatter plot based on PCA model for volatile flavor components in two vinegars

利用2 種食醋的香氣組分的相對含量進(jìn)行PCA，提取得到2 個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率為65.03%，基本可以表征所涉及的化學(xué)成分信息。從圖1可以看出，在95%置信區(qū)間內(nèi)，2 組樣本具有明顯的區(qū)域分布特征且表現(xiàn)出聚類趨勢，但組間樣品點(diǎn)比較散。

2.2.2 OPLS-DA結(jié)果

圖2 2 種食醋揮發(fā)性風(fēng)味組分OPLS-DA得分散點(diǎn)圖Fig. 2 Score scatter plot based on OPLS-DA model for volatile flavor components in two vinegars

PCA雖然能反映出四川保寧醋和山西老陳醋的明顯差異，但其僅反映了數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，忽略了數(shù)據(jù)間的整體性特征與變化規(guī)律，不利于尋找組間差異代謝物[10]。為更好地觀察四川保寧醋和山西老陳醋揮發(fā)性成分的差異和特征，找到能夠標(biāo)記差異的信號(hào)分子，從而篩選出差異形成的潛在標(biāo)記物，采用有監(jiān)督的OPLS-DA的模式識(shí)別方法對2 種四大名醋樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行了建模分析。OPLS-DA參數(shù)R2X描述了X變量中有多少變化可以用所選的組件解釋。R2描述了模型的擬合程度。Q2表示X對Y的預(yù)測能力，R2和Q2的取值范圍為0～1，其中1表示完全適合度和預(yù)測能力[11]。由圖2可知，2 組樣本在OPLS-DA得分圖上聚類良好，顯著分離（=0.615，R2=0.903，Q2=0.822）。為0.615，表明所選組件可以對數(shù)據(jù)集中61.5%的變化進(jìn)行建模，又因?yàn)镽2和Q2參數(shù)數(shù)值接近1，所以O(shè)P LS-DA模型的可解釋度和模型擬合很好。與無監(jiān)督的PCA得分散點(diǎn)圖相比，山西老陳醋和四川保寧醋樣本有了最大程度的分離，且降低了樣品的組內(nèi)差異，這樣便于更準(zhǔn)確地尋找兩者的化學(xué)差異成分。

2.2.3 OPLS-DA模型評(píng)價(jià)

OPLS-DA是一種有監(jiān)督的多元統(tǒng)計(jì)方法，有監(jiān)督的分類模型缺點(diǎn)是可能會(huì)出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，即模型可以很好地將樣本進(jìn)行區(qū)分，但用來預(yù)測新的樣本集時(shí)卻表現(xiàn)很差。因此采用SIMCA-P軟件對建立的OPLS-DA模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)和交叉驗(yàn)證方差分析驗(yàn)證模型的可靠性。

圖3 2 種食醋樣品OPLS-DA置換檢驗(yàn)結(jié)果圖Fig. 3 OPLS-DA replacement test results for two vinegars

當(dāng)原始數(shù)據(jù)中沒有添加額外的數(shù)據(jù)或噪聲，置換檢驗(yàn)更有助于進(jìn)行模型的驗(yàn)證[12]。其通過隨機(jī)改變分類變量Y的排列順序，多次建立對應(yīng)的OPLS-DA模型以獲取隨機(jī)模型的R2和Q2值，在避免檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪^擬合以及評(píng)估模型的統(tǒng)計(jì)顯著性上具有重要作用。如圖3所示，橫坐標(biāo)表示置換檢驗(yàn)的置換保留度（置換保留度等于1處的點(diǎn)即為原模型的R2和Q2值），所有R2點(diǎn)從左到右均低于最右的原始的R2點(diǎn)，所有Q2點(diǎn)均低于右側(cè)的原始Q2點(diǎn)，且點(diǎn)的回歸線與橫坐標(biāo)交叉或者小于0，一般認(rèn)為Q2為負(fù)值，這說明統(tǒng)計(jì)模型是有效的，沒有過擬合[13]。另外，將OPLS-DA模型進(jìn)行交叉驗(yàn)證方差分析，結(jié)果顯示P值為9.15×10－4，也小于0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這進(jìn)一步表明模型穩(wěn)定可靠[14]。

2.2.4 潛在差異標(biāo)志物

為進(jìn)一步找出對結(jié)果分型起貢獻(xiàn)作用的變量，得到了OPLS-DA模型的S-plot和VIP圖如圖4、5所示。S-plot最初是由Wiklund等首次用來鑒定2 個(gè)樣本之間的化學(xué)差異，它顯示了代謝物和模型類指定之間的協(xié)方差和相關(guān)性，是將多元分類模型可視化和解釋的工具[15]。因此，S-plot圖有助于根據(jù)對模型的貢獻(xiàn)及其可靠性，能夠識(shí)別具有統(tǒng)計(jì)意義和潛在生物化學(xué)意義的代謝物[16]?！癝”兩端的點(diǎn)表示潛在的化學(xué)標(biāo)記，具有較高的置信度，即對分型貢獻(xiàn)較小的變量會(huì)聚集在原點(diǎn)附近，而對分型貢獻(xiàn)較大的變量則分散在“S”型的兩端[17]。變異權(quán)重參數(shù)值（variable importance in projection，VIP）的大小反映了每個(gè)品質(zhì)成分對模型貢獻(xiàn)率的大小，值越大貢獻(xiàn)越大[18]。以VIP值大于1為界限進(jìn)行篩選并結(jié)合S-plot圖可以看出，糠醛、乙酸乙酯、2,4-二叔丁基酚、醋酸、乙酸苯乙酯和苯乙醇這6 種風(fēng)味物質(zhì)是對2 種四大名醋差異貢獻(xiàn)最大的潛在標(biāo)志物。

圖4 基于OPLS-DA模型分析的S型載荷圖Fig. 4 S-plot based on OPLS-DA model an alysis

圖5 基于OPLS-DA模型分析的VIP預(yù)測值分布圖Fig. 5 Distribution of VIP forecast values based on OPLS-DA model analysis

2.2.5 差異性成分在四川保寧醋和山西老陳醋相對含量分析

對獲得的6 個(gè)差異性較大的揮發(fā)性變量在四川保寧醋和山西老陳醋的相對含量進(jìn)行熱圖分析，如圖6所示，糠醛、2,4-二叔丁基酚在四川保寧醋中的相對含量比在山西老陳醋中的相對含量高，苯乙醇在四川保寧醋中未檢測到或含量很低。而醋酸、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯在山西老陳醋中的相對含量遠(yuǎn)高于其在四川保寧醋中的相對含量。

糠醛又稱呋喃甲醛或麩醛，有助于杏仁、烤土豆、面包、燒焦味[19]，主要是由戊聚糖分解或酵母發(fā)酵所產(chǎn)生[20]。苯乙醇具有蜂蜜香和玫瑰香，是酵母菌的代謝產(chǎn)物，來源于乙醇發(fā)酵過程中苯丙氨酸的降解[21]。乙酸乙酯具有果香、酒香，是酵母細(xì)胞質(zhì)中 糖酵解產(chǎn)生的乙醇或乙酸與線粒體呼吸產(chǎn)生的乙酰輔酶A發(fā)生酯化反應(yīng)生成的[22]。乙酸苯乙酯具有蜜甜香，少量產(chǎn)生于乙醇發(fā)酵階段，大量產(chǎn)生于醋酸發(fā)酵階段，由苯乙醇在酯酶的作用下合成[23]。但目前關(guān)于2,4-二叔丁基酚的風(fēng)味及來源還不清楚，發(fā)現(xiàn)2,4-二叔丁基酚在酒、醋、茶[24]中被廣泛檢測到，尤其是藥酒、藥醋，比如懷山藥[25]、葛根酒[26]等。此外，2,4-二叔丁基酚還能在中草藥中被檢測出，比如沉香[27]、姜黃[28]、香草蘭[29]、三角梅[30]等。所以，可以猜測保寧醋中高含量的2,4-二叔丁基酚與加 入的中草藥有關(guān)。

圖6 差異代謝物的熱圖分析Fig. 6 Heatmap of differen t metabolites

3 結(jié) 論

本研究基于GC-MS指紋圖譜對6 種四川保寧醋和9 種山西老陳醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定，四川保寧醋得到26 種共有物質(zhì)，山西老陳醋得到27 種共有物質(zhì)，將兩者各自的共有物質(zhì)結(jié)合共得到35 種物質(zhì)。以這35 種物質(zhì)為研究對象，結(jié)合PCA和OPLS-DA多元數(shù)據(jù)變量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：山西老陳醋和四川保寧醋樣本在散點(diǎn)圖上分離良好；以VIP值大于1為界限進(jìn)行篩選并結(jié)合S-plot圖共得到6 種差異代謝物，分別為糠醛、乙酸乙酯、2,4-二叔丁基酚、醋酸、乙酸苯乙酯和苯乙醇；通過熱圖對差異性代謝物分析，可以發(fā)現(xiàn)糠醛、2,4-二叔丁基酚在四川保寧醋中的相對含量比在山西老陳醋中高，而醋酸、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯在山西老陳醋中的相對含量遠(yuǎn)高于其在四川保寧醋中的相對含量，另外，苯乙醇在四川保寧醋中的未檢測到或含量很低。這為食醋行業(yè)質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步研究和分析不同食醋的質(zhì)量和風(fēng)格特色的形成提供了新的思路和方法。