程序性細胞死亡因子4基因在體干擾大鼠模型的構建

鐘 波，侯 偉，呂社民，王慧淵，耿 妍，楊旭東，薛 麗

(西安交通大學：1. 第二附屬醫(yī)院小兒內科，陜西西安 710004；2. 醫(yī)學部基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，陜西西安 710061；3. 第二附屬醫(yī)院檢驗科，陜西西安 710004)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是世界范圍內一種常見的慢性呼吸道疾病，以氣道重塑為突出的病理學特征[1]。整體而言，哮喘是一種環(huán)境因素與易感基因共同作用的疾病，所涉及的易感基因達到一百余種[2]。盡管在遺傳學病因方面的研究已經取得了明顯進展，但有關哮喘易感基因的篩選與鑒定仍需進一步研究[3]，篩選哮喘相關差異表達基因對了解其發(fā)病機制具有突出意義。因此，我們之前的研究在E3大鼠體內使用雞卵清蛋白(ovalbumin, OVA)促使產生抗原誘導肺部炎癥(antigen induced pulmonary inflammation, AIPI)模型，通過抑制性消減雜交技術構建了大鼠肺組織差異表達的cDNA文庫，篩選出1個上調表達的差異基因，名為程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4, Pdcd4)，并確定其在E3大鼠AIPI模型中的表達水平升高[4]。為進一步了解該基因的功能，本研究建立了Pdcd4基因的在體干擾大鼠模型。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑8～12周齡近交系E3大鼠32只，雌雄皆有，為西安交通大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系提供。OVA與鋁佐劑購自Sigma公司，Trizol購自 Invitrogen公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司、SYBR?Premix ExTaqTMⅡ購自TaKaRa公司，ELISA試劑盒購自Cell Signaling Technology公司，Pdcd4 shRNA質粒購自上海吉瑪基因技術有限公司(Pdcd4 shRNA序列GCGGAGATGTTAAGGGATTTG，NC-shRNA序列GTTCTCCGAACGTGTCACGT)。其他試劑均為國產分析純。

1.2 動物模型構建8～12周齡的E3大鼠32只，按體質量隨機分為4組，每組各8只。所有大鼠均在第0天腹腔注射OVA/鋁佐劑的混懸液致敏；從第14天起，對照組大鼠用PBS雙側滴鼻，其余大鼠用1 mg/mL的OVA溶液雙側滴鼻攻擊，共持續(xù)1周，構建AIPI模型；后分為3組，于第13天和第17天，各組分別鼻腔滴注50 μL(1 μg/μL)的Pdcd4 shRNA質粒溶液(Pdcd4干擾組)、50 μL NC-shRNA質粒溶液(無關質粒組)及50 μL醫(yī)用注射用水(AIPI模型組)。

第21天時麻醉大鼠，經腹主動脈取血后，獲取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)，離心后分別留取上清和細胞沉淀，取部分細胞用于細胞計數，剩余細胞用于檢測Pdcd4的mRNA表達；留取肺組織制作病理切片進行相關染色。本研究經過西安交通大學動物實驗倫理委員會的批準。模型構建的具體流程如圖1所示。

圖1 大鼠在體干擾流程示意圖

Fig.1 Schematic diagram of rat RNAiinvivo

1.3 組織化學染色常規(guī)制作肺組織HE染色切片，顯微鏡下觀察氣道周圍炎性細胞的浸潤情況。將炎性細胞浸潤情況分為4個等級：0級，無炎性細胞浸潤；1級，氣道周圍有一層炎性細胞；2級，氣道周圍有兩層炎性細胞浸潤；3級，氣道周圍有兩層以上炎性細胞浸潤。將切片上的每一個氣道計分，并把所有氣道的分值相加求平均值，以代表氣道炎癥的整體情況。

計數板上滴加20 μL BALF細胞懸液，顯微鏡下常規(guī)觀察并計BALF中總的細胞數。Wright-Giemsa染液處理BALF細胞，顯微鏡下計數，每一張玻片上連續(xù)觀察200個細胞，分別記錄淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞等的數目。

1.4 RT-qPCR檢測Pdcd4基因mRNA表達常規(guī)用Trizol提取BALF細胞中總RNA，按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書操作，反轉錄生成cDNA。RT-qPCR檢測Pdcd4在體RNA干擾的效率，反應體系：20倍稀釋的cDNA 4 μL、SYBR?Premix ExTaqTMⅡ 4 μL、Pdcd4上下游引物各0.5 μL，混勻、瞬時離心。反應條件：95 ℃ 1 min；40個循環(huán)，95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。GAPDH為內參，各引物信息見表1。計算并比較基因相對表達水平。

表1 基因引物信息

Tab.1 Information of gene primers

基因名稱序列(5′～3′)Pdcd4AACTATGATGATGACCAGGAGAACGCTAAGGACACTGCCAACACGAPDHCGGCAAGTTCAACGGCACAGGAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC

1.5 常規(guī)ELISA檢測大鼠血清中的OVA特異性IgG將5 μg/mL的OVA溶液加入96孔板，4 ℃過夜。洗脫緩沖液進行洗脫后，每孔加入100 μL封閉液，37 ℃孵育1 h。洗脫緩沖液洗板3次。用1×PBS將血清稀釋100倍，每孔加入50 μL血清樣品，37 ℃孵育1 h。洗脫后用封閉液將1 μg/μL馬辣根過氧化物酶標記的小鼠抗大鼠λ/κ鏈抗體稀釋3 000倍，取50 μL加入各孔，37 ℃孵育1 h。洗脫后加入顯色劑TMB 100 μL，室溫避光孵育20 min。加入100 μL終止液，室溫避光10 min內全波長酶標儀450 nm波長下讀取吸光度(A)值。

同樣用ELISA法檢測大鼠血清中的總IgE，包被抗體為50 μL 2 μg/mL的小鼠抗大鼠IgE重鏈抗體，用1×PBS將血清稀釋1 000倍，其余步驟同OVA特異性IgG檢測。

1.6 血清一氧化氮的測定在鎘粒中加入5 mmol/L CuSO4使鎘?；罨?.2 mol/L的甘氨酸緩沖液(pH 7.5)洗滌3次。在100 μL BALF上清中加入400 mg鉻粒，37 ℃下震蕩30 min，瞬時離心后吸取上清100 μL，加入等量Griess試劑，震蕩混勻，室溫孵育1 h，545 nm波長下測定A值。將100、50、25、12.5、6.25 μmol/L的NaNO2各吸取100 μL，加入等量Griess試劑混勻，室溫孵育1 h，545 nm波長下測定A值，擬合出標準曲線。根據標準曲線方程計算出待測樣品中一氧化氮的含量。

2 結 果

2.1 肺組織切片的HE染色與病理學計數結果與對照組相比，AIPI模型組、無關質粒組及Pdcd4干擾組大鼠的HE染色顯示，肺組織切片中可見支氣管周圍及肺泡中有大量炎癥細胞浸潤。對支氣管周圍滲出的細胞進行統(tǒng)計學分析發(fā)現，后3組的病理學計數值均較對照組明顯升高(圖2)，表明成功誘導肺部炎癥模型。但是，Pdcd4干擾組與無關質粒組的病理學計數沒有差異，提示Pdcd4的在體干擾對于肺組織炎癥滲出沒有明顯影響。

2.2 BALF細胞中Pdcd4的mRNA表達變化RT-qPCR檢測結果顯示，Pdcd4 shRNA干擾組大鼠BALF細胞中Pdcd4的mRNA表達明顯下調(圖3)，提示大鼠Pdcd4基因干擾模型的構建是成功的。

圖2 AIPI大鼠肺組織的病理學改變

Fig.2 Pathological changes of AIPI rat lung tissues

圖3 各組大鼠BALF細胞中Pdcd4 mRNA的表達變化

Fig.3 Pdcd4 mRNA expression of BALF cells of rats in groups

2.3 BALF細胞計數結果分別計數各組BALF中總細胞、淋巴細胞、巨噬細胞及嗜酸性粒細胞數，結果顯示，Pdcd4干擾組與無關質粒組的嗜酸性粒細胞數有明顯差異，表明Pdcd4干擾可以減少肺泡嗜酸性粒細胞的浸潤。但兩組的總細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等計數沒有明顯差異(圖4)。

2.4 血清中一氧化氮、總IgE、OVA特異性IgG的檢測結果Pdcd4在體干擾后，大鼠血清一氧化氮、總IgE、OVA特異性IgG等指標均沒有明顯變化(圖5)。

3 討 論

RNA干擾是一種由小分子雙鏈RNA引起的轉錄后基因沉默現象，作用于轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平，抑制目的基因的表達[5]。RNA干擾技術現已在基礎研究領域廣泛應用[6]。本研究通過將Pdcd4的干擾質粒滴入AIPI大鼠鼻腔，下調大鼠體內Pdcd4的表達，構建了大鼠Pdcd4基因的在體干擾模型，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎。

圖4 各組大鼠BALF細胞計數的結果分析

*P<0.05。

圖5 血清一氧化氮(A)、總IgE(B)、OVA特異性IgG(C)的檢測結果

*P<0.05。

大鼠Pdcd4基因定位于1號染色體，小鼠定位于19號染色體，人類染色體定位于10號染色體，DNA全長為26.9 kb，含13個外顯子，cDNA全長約3.5 kb，其中編碼區(qū)約1.4 kb，其蛋白質分子質量51.6 ku，共含469個氨基酸[6-7]。該基因最初是在凋亡發(fā)生時篩選出的上調基因，其表達產物通過抑制相關基因的轉錄和翻譯，調節(jié)不同的信號轉導途徑，作用于細胞周期，從而對細胞的程序性死亡發(fā)揮重要調節(jié)作用，抑制腫瘤生成[8-9]。

近年來發(fā)現Pdcd4也參與了炎癥的發(fā)生發(fā)展過程。ASUDA等[10]發(fā)現LPS抑制小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞中Pdcd4 mRNA與蛋白質的表達。同時，研究表明Pdcd4不僅受炎癥因子的調節(jié)，同時其本身也可以調節(jié)炎癥因子的產生。通過siRNA技術下調RAW264.7細胞中Pdcd的表達，可以明顯加強LPS誘導的TNF-α蛋白的產生，提高IFN-γ、CCL1、CCL20和IL-10等分子在mRNA的表達，表明Pdcd4可以抑制以上這些炎性介質的產生。有研究發(fā)現，Pdcd4基因敲除小鼠的淋巴細胞可以產生促進腫瘤生長，但可抑制炎癥反應的因子，導致小鼠淋巴瘤發(fā)病率明顯升高，但對炎癥性疾病如自身免疫性腦脊髓炎和糖尿病則出現明顯的抵抗[11]。

有文獻報道，Pdcd基因啟動子的多態(tài)性與兒童哮喘的嚴重程度存在相關性[12]，進一步表明深入了解Pdcd4對于哮喘發(fā)病機制的研究意義。哮喘氣道炎癥的關鍵效應細胞之一為嗜酸性粒細胞，該細胞可以合成并分泌堿基蛋白、嗜酸性粒細胞過氧化酶等物質，對氣道上皮組織和肺組織產生損傷，進而使機體表現出氣道高反應性；另外，嗜酸性粒細胞可以影響哮喘氣道神經的反應性，從而使該細胞在哮喘氣道炎癥反應中發(fā)揮重要作用[13]。本研究結果表明，Pdcd4的在體干擾可以減少AIPI大鼠肺泡嗜酸性粒細胞的浸潤，提示Pdcd4可能通過這一途徑影響哮喘的發(fā)生和發(fā)展，但其進一步可能產生的效應及具體的機制需要后續(xù)進行深入研究。