miR-153-3p靶向TGFβ2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

石洪仁，陳禮剛

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，四川瀘州 646000)

膠質(zhì)瘤是原發(fā)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤，是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤。膠質(zhì)瘤約占腦腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%，但占所有腦惡性腫瘤的80%[1]。膠質(zhì)瘤的治療因細(xì)胞類型、惡性程度和腫瘤生長的位置而異，主要是手術(shù)、放療和化療的聯(lián)合使用。盡管治療手段不斷進(jìn)步，患者預(yù)后取得較大的改善，但整體治療仍缺少突破性進(jìn)展。因此尋找膠質(zhì)瘤的治療方法仍然是研究的熱點。miRNA是長度為21～23個堿基組成的單鏈非編碼RNA，參與細(xì)胞增殖、凋亡、脂質(zhì)代謝和細(xì)胞分化等生命進(jìn)程，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miR-153-3p靶向Snail能抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[2]，而抑制miR-153-3p的表達(dá)能促進(jìn)黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移[3]。miR-153高表達(dá)能抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲和遷移，抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[4-5]。NIU等[6]研究顯示，miR-153靶向轉(zhuǎn)化生長因子β2(transforming growth factor-beta 2, TGFβ2)抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。YAN等[7]發(fā)現(xiàn)miR-153-3p能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。但目前miR-153-3p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響尚未見報道。本文以體外培養(yǎng)的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44為實驗對象，探索miR-153-3p與TGFβ2的靶向關(guān)系以及對SHG-44細(xì)胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及實驗材料人惡性腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞購自美國菌種保藏中心(ATCC)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司；胰酶購自美國Gibco公司；miR-153-3p模擬物(mimic)和mimic陰性對照(NC)購自廣州銳博公司；Trizol試劑盒為美國英杰生命技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PrimeScript RT試劑盒購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；熒光素酶報告實驗試劑盒購自美國Promega公司；TGFβ2慢病毒載體pLent- Puro-CMV由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計合成；慢病毒包裝試劑盒購自北京英格恩生物公司；抗體TGFβ2、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase, MMP-2)、MMP-9、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cadherin)、Snail-2、波形蛋白(Vimentin)、Twist和上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)購自英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44的培養(yǎng) 細(xì)胞接種于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、50 mL/L CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%～90%時進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞接種于24孔板，當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)60%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，mimic與轉(zhuǎn)染試劑按照1∶2.5的比例重積分混合，添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，正常培養(yǎng)6 h后更換新鮮的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48～72 h后，檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測mRNA表達(dá) 將細(xì)胞分為：對照組、mimic NC組和miR-153-3p mimic組，分別做不同處理。miRNA mimic轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，使用RNA提取試劑按照步驟抽提各組SHG-44細(xì)胞總RNA，檢測RNA的濃度、純度和完整性。取1 μL樣品逆轉(zhuǎn)錄cDNA，以20 μL的體系加入相應(yīng)的引物、模板和試劑，每組設(shè)置3個復(fù)孔，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性4 s，56 ℃退火5 s，72 ℃延伸6 s，共40個循環(huán)。TGFβ2上游引物：5′-CCGCTGCACATCGTC-3′，下游引物：5′-CGTGGAAGGCGGTGATCAG-3′。以GAPDH為內(nèi)參，用公式2-ΔΔCt計算miR-153-3p和TGFβ2 mRNA的相對水平。

1.2.4熒光素酶實驗分析miR-153-3p與TGFβ2的靶向關(guān)系 利用Targetscan和miRDB預(yù)測miR-153-3p與TGFβ2 3′-UTR的結(jié)合位點，構(gòu)建miR-153-3p結(jié)合位點的TGF-4野生型質(zhì)粒和突變型熒光素酶報告載體。細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后在轉(zhuǎn)染試劑作用下，將野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒分別與miR-153-3p mimic共轉(zhuǎn)，設(shè)置3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24 h后，棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，加100 μL的裂解液，室溫下充分裂解。加LARII測螢火蟲熒光素酶的活性；加Stop&Glo試劑，檢測海腎熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶比值表示活性。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達(dá) 將細(xì)胞分為：對照組、miR-153-3p mimic組、pLV-TGFβ2組、miR-153-3p+TGFβ2組，做相應(yīng)處理。miR-153-3p mimic轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞72 h后收集細(xì)胞，用加蛋白酶抑制劑的裂解液冰上靜置30 min，4 ℃下12 000 r/min離心30 min后取上清，Bradford法測定蛋白濃度。各組樣品上樣量為30 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜；含5 g/L脫脂牛奶的封閉液室溫下封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜；TBST洗3次，每次10 min，加二抗，室溫下孵育2 h，TBST洗膜后顯影，Image J分析條帶灰度值。

1.2.6體外侵襲實驗檢測miR-153-3p對SHG-44細(xì)胞侵襲能力的影響 miR-153-3p mimic轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL。無血清培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠，取100 μL至上室，37 ℃無菌培養(yǎng)箱中風(fēng)干；下室中加500 μL含100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基，取200 μL單細(xì)胞懸液至上室。正常培養(yǎng)24 h后，擦去上層基質(zhì)膠和細(xì)胞，吉姆薩染色。倒置顯微鏡下隨機選擇5個視野，計數(shù)并拍照。

1.2.7劃痕實驗檢測miR-153-3p對SHG-44細(xì)胞遷移能力的影響 miR-153-3p mimic轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)90%左右時，用滅菌的10 μL槍尖垂直于孔板底部劃平行直線。PBS洗3次，更換為無血清的培養(yǎng)基。正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)，于0、24 h時拍照，計算劃痕閉合率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 18.0分析實驗數(shù)據(jù)。多組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-153-3p mimic對SHG-44細(xì)胞中TGFβ2 mRNA水平的影響miR-153-3p mimic轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞后，miR-153-3p的水平升高，提示轉(zhuǎn)染成功；miR-153-3p mimic作用于SHG44細(xì)胞后，TGFβ2的mRNA水平降低(P<0.01，圖1)。

2.2 miR-153-3p負(fù)向調(diào)控SHG-44細(xì)胞中TGFβ2蛋白表達(dá)miR-153-3p mimic轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞后，Western blot結(jié)果顯示TGFβ2蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；miR-153-3p添加到TGFβ2高表達(dá)的SHG-44細(xì)胞后，細(xì)胞中TGFβ2的表達(dá)水平降低(P<0.01，圖2)。

圖1 實時熒光定量PCR檢測miR-153-3p和TGFβ2 mRNA的表達(dá)情況

Fig.1 The expression of miR-153-3p and TGFβ2 mRNA detected by qRT-PCR (n=3)

與對照組相比，aP<0.01。

圖2 Western blot檢測TGFβ2蛋白的表達(dá)情況

Fig.2 The expression of TGFβ2 proteins detected by Western blot (n=3)

與對照組相比，aP<0.01；與pLV-TGFβ2組相比，bP<0.01。

2.3 miR-153-3p與TGFβ2的靶向關(guān)系Targetscan和miRDB分析結(jié)果顯示，miR-153-3p與TGFβ2 3′-UTR間存在連續(xù)保守結(jié)合區(qū)域。雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示，miR-153-3p mimic與TGFβ2野生型報告載體共轉(zhuǎn)到SHG-44細(xì)胞后，熒光素酶的活性減低(P<0.01)；將TGFβ2 3′-UTR結(jié)合位點突變后與miR-153-3p mimic共轉(zhuǎn)，熒光素酶的活性沒有明顯變化(圖3)。實驗結(jié)果表明miR-153-3p與TGFβ2存在靶向關(guān)系。

2.4 miR-153-3p對SHG-44細(xì)胞侵襲能力的影響miR-153-3p mimic轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞后，侵襲細(xì)胞數(shù)目減少(P<0.01)；pLV-TGFβ2組與對照組相比，侵襲細(xì)胞數(shù)目增加(P<0.01)；miR-153-3p+TGFβ2組與pLV-TGFβ2組相比，細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)目減少(P<0.01，圖4)。

圖3 miR-153-3p與TGFβ2 3′-UTR靶向關(guān)系分析

Fig.3 Targeting relationship between miR-153-3p and TGFβ2 3′-UTR (n=3)

A：Targetscan預(yù)測miR-153-3p與TGFβ2 3′-UTR的結(jié)合情況；B：熒光素酶報告實驗分析靶向關(guān)系。與對照組相比，aP<0.01。

2.5 miR-153-3p對SHG-44細(xì)胞遷移能力的影響miR-153-3p mimic轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞后，劃痕閉合率降低(P<0.01)；pLV-TGFβ2組與對照組相比，劃痕閉合率升高(P<0.01)；miR-153-3p+TGFβ2組與pLV-TGFβ2組相比，劃痕閉合率降低(P<0.01，圖5)。

2.6 miR-153-3p對SHG-44細(xì)胞中遷移、侵襲相關(guān)蛋白的影響miR-153-3p mimic組與對照組相比，SHG-44細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)降低(P<0.01)；pLV-TGFβ2組與對照組相比，SHG-44細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)降低(P<0.01)；miR-153-3p+TGFβ2組與pLV-TGFβ2組相比，SHG-44細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)降低(P<0.01，圖6)。

圖4 體外侵襲實驗檢測miR-153-3p對SHG-44細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.4 The effect of miR-153-3p on the invasion of SHG-44 cells measured by Transwell (n=3)與對照組相比,aP<0.01;與pLV-TGFβ2組相比,bP<0.01;Bar=50μm。

圖5 劃痕實驗檢測miR-153-3p對SHG-44細(xì)胞遷移能力的影響Fig.5 The effect of miR-153-3p on the migration of SHG-44 cells measured by wound healing assay (n=3)與對照組相比,aP<0.01;與pLV-TGFβ2組相比,bP<0.01;Bar=100μm。

圖6 Western blot檢測miR-153-3p對SHG-44細(xì)胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig.6 The effect of miR-153-3p on the expression of metastasis-related proteins in SHG-44 cells measured by Western blot (n=3)

與對照組相比，aP<0.01；與pLV-TGFβ2組相比，bP<0.01。

2.7 miR-153-3p對SHG-44細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的影響miR-153-3p mimic組與對照組相比，SHG-44細(xì)胞中N-cadherin、Snail-2、Vimentin和Twist的表達(dá)降低，E-cadherin的表達(dá)升高(P<0.01)；pLV-TGFβ2組與對照組相比，SHG-44細(xì)胞中N-cadherin、Snail-2、Vimentin和Twist的表達(dá)升高，E-cadherin的表達(dá)降低(P<0.01)；miR-153-3p+TGFβ2與pLV-TGFβ2組相比，SHG-44細(xì)胞中N-cadherin、Snail-2、Vimentin和Twist的表達(dá)降低，E-cadherin的表達(dá)升高(P<0.01，圖7)。

3 討 論

膠質(zhì)瘤細(xì)胞是常見的腦惡性腫瘤，侵襲能力強，復(fù)發(fā)率和死亡率高。研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ2在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)[8]，能促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移[9]。PENG等[10]研究顯示，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-141通過靶向抑制TGFβ2從而抑制細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。miR-153在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著抑制腫瘤發(fā)展的作用。據(jù)報道，miR-153能靶向TGFβ2骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[6]。本研究結(jié)果顯示，miR-153-3p mimic轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，TGFβ2 mRNA和蛋白水平均降低。雙熒光素酶實驗分析顯示miR-153-3p與TGFβ2存在靶向關(guān)系。接下來我們探討miR-153-3p對膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞侵襲和遷移的影響。

圖7 Western blot檢測miR-153-3p對SHG-44細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig.7 The effect of miR-153-3p on the expression of EMT-related proteins in SHG-44 cells measured by Western blot (n=3)

與對照組相比，aP<0.01；與pLV-TGFβ2組相比，bP<0.01。

膠質(zhì)瘤主要為侵襲性生長，手術(shù)切除難度較大，因此抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是研究的熱點。研究顯示miR-153高表達(dá)能抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[11-12]。李冠軍等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-153高表達(dá)抑制膀胱癌的侵襲和遷移。與上述結(jié)果類似，本文研究結(jié)果顯示miR-153-3p mimic轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞后，侵襲細(xì)胞數(shù)目減少，劃痕閉合率降低。TGFβ2高表達(dá)能促進(jìn)SHG-44細(xì)胞侵襲和遷移，緩解miR-153-3p對細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用。ZHANG等[14]發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中下調(diào)TGFβ2的表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲。LI等[15]發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA抑制miR-153-3p的表達(dá)后，促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子和VEGF的表達(dá)，促進(jìn)缺氧狀態(tài)下組織血管生成。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，TGFβ2通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲[16]。VEGF、MMP-2和MMP-9在膠質(zhì)瘤的侵襲過程中起促進(jìn)作用，VEGF與腫瘤血管生成密切相關(guān)，而MMPs能降低細(xì)胞之間的連接。本研究結(jié)果顯示，miR-153-3p mimic轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞后，細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)水平顯著降低。實驗結(jié)果表明，miR-153-3p靶向TGFβ2抑制SGH-44細(xì)胞侵襲和遷移。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是胚胎發(fā)育和腫瘤侵襲發(fā)生時的動態(tài)變化過程。XU等[17]的研究顯示，下調(diào)miR-153促進(jìn)人上皮癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。據(jù)報道m(xù)iR-153高表達(dá)能抑制肝癌細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin、Snail的表達(dá)，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[18]。本文結(jié)果與之類似，miR-153-3p mimic轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞后，細(xì)胞中N-cadherin、Snail-2、Vimentin和Twist的表達(dá)水平降低，E-cadherin的表達(dá)升高。結(jié)果表明miR-153-3p抑制SHG-44細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。有文獻(xiàn)報道m(xù)iR-153-3p能通過靶向Snail抑制腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在實驗中miR-153-3p是否直接靶向Snail發(fā)揮作用仍需要進(jìn)一步驗證。

miR-153-3p mimic抑制SHG-44細(xì)胞中TGFβ2 mRNA和蛋白的表達(dá)，熒光素酶實驗顯示miR-153-3p與TGFβ2的靶向關(guān)系，miR-153-3p mimic抑制SHG-44細(xì)胞侵襲和遷移、抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)；而TGFβ2高表達(dá)緩解miR-153-3p對侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。綜上所述，miR-153-3p靶向TGFβ2抑制體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。下一步將在體內(nèi)實驗中研究miR-153-3p對膠質(zhì)瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響。