miR-338-3p在惡性腫瘤中的表達(dá)異常及其表觀遺傳組蛋白的修飾位點(diǎn)

王文靜，王曉霏，劉利英，童東東，李 茜，倪 磊，郭 波

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 710061；2 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系，陜西西安 710061；3. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061)

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)約21～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA小分子，其在進(jìn)化上高度保守，廣泛存在于真核生物中，大部分經(jīng)由基因的內(nèi)含子部位剪切產(chǎn)生[1]。目前，已經(jīng)鑒定的miRNA約有上萬(wàn)種，其中人類(lèi)成熟的miRNA有1 900余種，調(diào)控著人類(lèi)基因組中20%～30%的基因[2]。miRNA主要通過(guò)抑制mRNA翻譯或促進(jìn)其降解調(diào)控基因表達(dá)，通過(guò)影響細(xì)胞周期、增殖、凋亡、侵襲或遷移能力，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)。Let-7家族在肺癌、肝癌及結(jié)腸癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)，提示其是一種抑癌基因[3]。研究發(fā)現(xiàn)Let-7可以通過(guò)靶向下調(diào)HMGA2(high mobility group A2)的表達(dá)而促進(jìn)核苷酸切除性修復(fù)，抑制腫瘤的發(fā)生[4]。因此，miRNA與腫瘤發(fā)生的關(guān)系也一直是腫瘤研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)[5-7]。

經(jīng)典的表觀遺傳(epigenetics)修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等方面，通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)在包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞生物學(xué)行為等方面發(fā)揮了重要作用[8]。miRNA作為腫瘤細(xì)胞中一類(lèi)重要的基因表達(dá)調(diào)控小分子，其在腫瘤中的差異表達(dá)和對(duì)靶基因特異性的調(diào)節(jié)機(jī)制都已被廣泛報(bào)道。既然miRNA由宿主基因剪切而來(lái)，那么其應(yīng)該也能像其他基因產(chǎn)物一樣，能夠受到表觀修飾的調(diào)節(jié)，如前面提到的DNA甲基化和組蛋白修飾等。因此，miRNA的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制也成為近來(lái)研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。本研究通過(guò)生物信息大數(shù)據(jù)庫(kù)分析了miR-338-3p在多種腫瘤中的表達(dá)譜，并以胃癌為研究對(duì)象，利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)結(jié)合PCR(ChIP-PCR)的方法探究了組蛋白修飾在miRNA表達(dá)異常中的作用，為后續(xù)對(duì)其調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材ChIP級(jí)抗體Anti-IgG、Anti-H3K27ac、Anti-H3K4m2、Anti-H3K9m2與Anti-H3K4m3均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Dynabeads?G蛋白與DynaMagTM旋轉(zhuǎn)磁力架購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；蛋白酶抑制劑與蛋白酶K購(gòu)自美國(guó)Roche公司。

1.2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)miR-338-3p在胃癌等16種不同種類(lèi)腫瘤組織中表達(dá)譜分析數(shù)據(jù)來(lái)自TCGA(The Cancer Genome Atlas)Pan-Cancer database(https://cancergenome.nih.gov)；miR-338-3p序列等信息來(lái)自miRbase(http://www.mirbase.org)；為探討miR-338-3p在胃癌中異常表達(dá)的原因，利用CRCH37(Genome Reference Consortium, http://www.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其上游啟動(dòng)子區(qū)序列與組蛋白修飾位點(diǎn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)于含雙抗(PS)和胎牛血清(FBS)(Gibco公司)的DMEM(PAA公司)培養(yǎng)基中，置于37 ℃的CO2孵育箱中，2～3 d換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)及電泳驗(yàn)證用10 cm2平皿培養(yǎng)的胃癌BGC-823細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷PBS水平搖床上輕柔洗滌3遍；270 μL甲醛室溫孵育15 min；600 μL甘氨酸輕柔混合室溫放置30 min；PBS清洗2次后棄液體，收集細(xì)胞于1.5 mL離心管，離心并棄上清；1 mL Mg-NI重懸細(xì)胞，離心并棄上清，1 mL Mg-NI-NP-40，冰上孵育10 min；12 000 r/min離心1 min，加0.5 mL Ca-NI重懸細(xì)胞后加4 μL EGTA，冰上孵育30 min；13 000 r/min離心1 min，以500 μL lysis buffer重懸(含蛋白酶抑制劑)；超聲破碎后，最高速4 ℃離心5 min，收集上清，每組留取100 μL樣品為Input組，其余樣品加抗體為實(shí)驗(yàn)組；每100～200 μL液體中加入1 μL相應(yīng)抗體，DNA混合儀旋轉(zhuǎn)4 ℃孵育過(guò)夜；加40 μL Protein G Agarose，4 ℃混勻2 h，DynaMagTM旋轉(zhuǎn)磁力架磁性固定后棄上清；依次用SB140、SB500、LiCl、TE清洗沉淀復(fù)合物2遍；加入100 μL Elution Buffer，65 ℃，10 min；離心后移上清于一新的EP管，加150 μL TE，65 ℃，10 min；加入100 μL EB和150 μL TE，65 ℃，6～8 h，解交聯(lián)；加蛋白酶K，55 ℃，30 min；加入RNaseA，37 ℃孵育1 h；酚-氯仿法抽提DNA至新EP管中，加1/10體積NaAc溶液，2倍體積無(wú)水乙醇，冰上放置30 min；12 000 r/min離心15 min，棄上清后乙醇洗滌，離心后棄上清風(fēng)干，30～50 μL TE溶解。PCR擴(kuò)增各組DNA中miR-338-3p啟動(dòng)子片段，ChIP-PCR引物序列見(jiàn)表1。將PCR反應(yīng)后產(chǎn)物與5×Loading Buffer(TaKaRa公司)以4∶1體積比混勻，移液槍加入加樣槽中，同時(shí)預(yù)留一孔加入3～5 μL DNA Marker，電泳，結(jié)束后將膠板置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

表1 染色質(zhì)免疫共沉淀PCR(ChIP-PCR)引物

Tab.1 Primers for chromatin immune coprecipitation-PCR

引物名稱(chēng)序列ChIP-338-Forward5′-TCCCCTAACTCCCAGTGTCT-3′ChIP-338-Reverse5′-CTTGCCTTGGCAGATTTGGG-3′ChIP-GAPDH-Forward5′-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3′ChIP-GAPDH-Reverse5′-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3′

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析miR-338-3p的表達(dá)譜來(lái)源于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中測(cè)序結(jié)果，正常組織與腫瘤組織間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各種腫瘤中miR-338-3p的表達(dá)譜分析生物信息學(xué)大數(shù)據(jù)庫(kù)(TCGA Pan-Cancer)分析顯示，miR-338-3p在多個(gè)不同種類(lèi)腫瘤中均有表達(dá)異常(圖1)，相對(duì)于正常對(duì)照，miR-338-3p表達(dá)升高的有結(jié)腸腺癌(COAD，P<0.05)、腎透明細(xì)胞癌(KIRC，P<0.05)和肝細(xì)胞肝癌(LIHC，P<0.05)；表達(dá)下調(diào)的有食道癌(ESCA，P<0.05)、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSC，P<0.05)、腎嫌色細(xì)胞癌(KICH，P<0.05)、腎乳頭狀腎細(xì)胞癌(KIRP，P<0.05)、肺鱗癌(LUSC，P<0.05)和甲狀腺癌(THCA，P<0.05)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)提示miR-338-3p在多種腫瘤中的表達(dá)異常

Fig.1 The dysregulation of miR-338-3p among various cancer types obtained from TCGA database

2.2 miR-338-3p在胃癌中表達(dá)下調(diào)在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)非配對(duì)的45例正常胃組織和366例胃癌組織數(shù)據(jù)分析顯示，miR-338-3p在胃癌組織中的表達(dá)普遍低于正常組織(圖2)。結(jié)果分析雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其原因可能與兩組樣本量差異大及個(gè)體差異性有關(guān)。

圖2 正常胃組織與胃癌組織中miR-338-3p的表達(dá)

Fig.2 The expression of miR-338-3p in normal gastric and gastric cancer tissues

2.3 miR-338-3p啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)在CRCH37數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)miR-338-3p啟動(dòng)子區(qū)潛在的組蛋白修飾位點(diǎn)的分析結(jié)果顯示，H3K27ac可能是涉及到調(diào)控miR-338-3p表達(dá)的重要位點(diǎn)(圖3)。

2.4 miR-338-3p表達(dá)下調(diào)的組蛋白修飾位點(diǎn)ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)同時(shí)獲得了包括H3K27ac等多個(gè)組蛋白修飾位點(diǎn)結(jié)合的DNA片段，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增miR-338-3p啟動(dòng)子區(qū)的基因片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H3K9m2和H3K4m3是調(diào)控miR-338-3p表達(dá)的表觀遺傳修飾因素中兩個(gè)潛在的組蛋白修飾位點(diǎn)(圖4)。

圖3 CRCH37中miR-338-3p啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

Fig.3 The predication of the histone modification sites in miR-338-3p promoter region

圖4 H3K9m2和H3K4m3是調(diào)控miR-338-3p表達(dá)的潛在修飾位點(diǎn)

Fig.4 H3K9m2 and H3K4m3 were two potential sites of histone modification

3 討 論

目前大量研究表明miRNA在腫瘤中異常表達(dá)，能夠誘發(fā)腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展。由于其具有組織、腫瘤或病理的特異性以及較強(qiáng)的物種保守性，miRNA也常常被認(rèn)為能作為一種新型的靶點(diǎn)，用以早期篩查或?yàn)榘邢蛑委熖峁┬碌难芯坎呗?。例如研究發(fā)現(xiàn)miR-17～92家族在血液系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)上調(diào)，已被確認(rèn)為原癌性miRNA[9]；miR-106b則在多種腫瘤中表達(dá)升高,外源性miR-106b可上調(diào)Myc抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[10]；而新近報(bào)道的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)基因CLOCK是miR-141的靶基因之一，通過(guò)抑制miR-141可上調(diào)CLOCK蛋白在膽管癌中的表達(dá),從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[11]。另一方面，證實(shí)miRNA具有抑癌作用，如miR-143與miR-145在結(jié)直腸癌、肺癌及胃癌中表達(dá)均下調(diào)，提示其可能在腺癌中低表達(dá)，有抑癌基因作用[12-13]。因此，在腫瘤中尋找敏感性和保守性都較高的miRNA分子對(duì)腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、分化、發(fā)展及復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)和治療反應(yīng)評(píng)價(jià)都有非常重要的意義。本研究通過(guò)對(duì)多個(gè)生物信息學(xué)大數(shù)據(jù)庫(kù)分析，在數(shù)十種腫瘤上千個(gè)組織樣本中對(duì)miR-338-3p的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸腺癌和腎透明細(xì)胞癌等腫瘤中表達(dá)顯著上調(diào),而在食道癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤中的表達(dá)受到了明顯抑制。證實(shí)了雖然miRNA在不同物種間高度保守，但由于組織特異性或不同的遺傳背景等因素，同一個(gè)miRNA在不同腫瘤組織間甚至不同細(xì)胞類(lèi)型的同一個(gè)腫瘤間的表達(dá)都不盡相同，提示在后續(xù)研究中選擇研究對(duì)象與平臺(tái)時(shí)，必須要充分考慮其遺傳背景與表達(dá)譜差異情況。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA的表達(dá)水平受DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳層面修飾的影響,通過(guò)與表觀遺傳修飾間的相互作用共同參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。在對(duì)人卵巢癌中表達(dá)下調(diào)的miRNA進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，其中只有15%的miRNA是由于DNA拷貝缺失導(dǎo)致表達(dá)降低，另外還有約36%的miRNA是由于表觀遺傳修飾的原因而導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)[15]。因此，表觀遺傳調(diào)控是miRNA表達(dá)水平異常的重要原因之一。作為表觀遺傳修飾的一個(gè)主要方面，組蛋白修飾也在調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)過(guò)程中有重要作用。利用HDAC的抑制劑LAQ824誘導(dǎo)處理乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，22個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)，提示miRNA的表達(dá)與組蛋白乙?；较嚓P(guān)[16]。通過(guò)質(zhì)譜方法也證實(shí)了人胚胎干細(xì)胞中H3K56存在乙?；揎?，H3K56ac能夠與維持干細(xì)胞多能性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子一起結(jié)合到3個(gè)干細(xì)胞特異性的miRNAs(miR-302，miR-371和miR-498)啟動(dòng)子區(qū)，激活這些分子的表達(dá)[17]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-200a可以靶向結(jié)合并抑制HDAC4的表達(dá)，而HDAC4又能通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白H3的乙?；椒炊种苖iR-200a的表達(dá)，因此，形成了miR-200a可以自身激活的一個(gè)環(huán)路[18]。

組蛋白修飾的檢測(cè)方法目前主要有兩種：一方面，對(duì)于未知的組蛋白修飾位點(diǎn)，其分子量在經(jīng)過(guò)共價(jià)修飾之后可發(fā)生改變，通過(guò)質(zhì)譜可以鑒定出組蛋白氨基酸上發(fā)生了什么樣的共價(jià)修飾，這是檢測(cè)新的組蛋白修飾位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)方法；另一方面，對(duì)于已知的組蛋白修飾位點(diǎn)，首先可以利用針對(duì)該修飾位點(diǎn)的抗體，通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)獲得與之結(jié)合的DNA片段，接下來(lái)既可通過(guò)ChIP-on-chip檢測(cè)，也可通過(guò)設(shè)計(jì)基因特異性PCR引物，來(lái)驗(yàn)證特定基因片段是否發(fā)生了已知修飾。因此，本研究利用ChIP實(shí)驗(yàn)同時(shí)獲得了多個(gè)組蛋白修飾位點(diǎn)結(jié)合的DNA片段，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增miR-338-3p啟動(dòng)子區(qū)的基因片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H3K9m2和H3K4m3是調(diào)控miR-338-3p表達(dá)的表觀遺傳修飾因素中兩個(gè)潛在的組蛋白修飾位點(diǎn)，而其中涉及的具體修飾機(jī)制將在后續(xù)研究中做進(jìn)一步探討。

目前，對(duì)與miRNA的作用及機(jī)制研究都已相當(dāng)成熟，而miRNA上游調(diào)控機(jī)制的研究難度則要大于下游機(jī)制的研究。但由于大多數(shù)腫瘤的發(fā)生都與表觀遺傳調(diào)控有關(guān)，且表觀遺傳修飾具有可逆性，因此，非常有必要尋求一個(gè)在多種腫瘤間表達(dá)都相對(duì)保守的miRNA并了解表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，為以表觀遺傳修飾為治療靶點(diǎn)的腫瘤特異性治療研究奠定理論基礎(chǔ)。