污染場地土壤生物毒性測試方法研究進展

殷 娟，范雅倫，李 倩，付融冰，陳 玲

(同濟大學環(huán)境科學與工程學院，上海 200092)

1 前 言

污染場地被視為潛在的污染源，不僅會對土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響，還可能引發(fā)地下水污染。污染場地土壤的風險評估，傳統(tǒng)方法是利用化學分析手段測定污染物的總量，再與規(guī)定的標準值進行比較，從劑量-反應(yīng)關(guān)系評估其危害。但高的總濃度并不總能轉(zhuǎn)化為高遷移性、生物利用性和毒性[1-2]，因此單純依靠化學分析手段有可能會高估場地的污染情況。同時，我國土壤環(huán)境質(zhì)量標準僅制定了有限環(huán)境項目的管控標準，難以對不同污染類型場地的污染程度做出準確評價。而生物毒性測試方法可有效彌補化學分析方法的局限性，反映污染物質(zhì)對生物體的綜合效應(yīng)，為特定場地的實際生態(tài)風險評估給予技術(shù)支撐。

2 生物毒性測試方法

2.1 陸生生物毒性測試方法

陸生生物毒性測試方法能夠直接接觸環(huán)境毒性，被視為診斷場地污染物生物可利用部分危害的有用工具[3-4]。表1歸納了目前比較常用的生物毒性測試方法，表明不同的受試生物、毒性終點對不同污染類型的土壤表現(xiàn)出不同的敏感性。具體介紹如下：

表1 陸生生物毒性測試方法Tab.1 Terrestrial biological toxicity test methods

2.1.1 高等植物法

高等植物測試方法被視為評價污染土壤質(zhì)量的重要方法，尤其當有植物毒性相關(guān)污染物存在時，植物測定就更為相關(guān)[5-6]。小麥、白菜、蘿卜、萵苣等具有較高經(jīng)濟價值的作物常被用于毒性測試，較為成熟的測試方法主要有根伸長抑制、種子萌發(fā)和植物早期生長等。根系由于直接與土壤接觸，通?？梢钥焖凫`敏地反映污染物的生態(tài)毒性，而且許多研究發(fā)現(xiàn)植物的根生長抑制通常比種子萌發(fā)更為敏感[7-8]。高等植物測試方法操作簡單、成本低，作為生產(chǎn)者其生長狀況是評價土壤質(zhì)量的重要指標。但植物生長過程容易受到其他因素的影響，且測試時間長(至少需一周左右時間)，因此不建議用于場地污染的快速診斷。

2.1.2 陸生無脊椎動物法

陸生無脊椎動物物種豐富，相對容易采樣，并且可以快速響應(yīng)土壤干擾[9]。對于土壤污染，蚯蚓因其與土壤的緊密接觸及其在陸地食物網(wǎng)中的重要性而被廣泛用作試驗物種。除蚯蚓外，其他動物物種如鞘翅目、彈尾蟲、螨蟲、等足類動物、線蟲和原生動物等在土壤生態(tài)毒性評估中也顯示出良好的潛力[10]。主要的測試終點有死亡率、生長發(fā)育相關(guān)指標(如體重損失)、繁殖及回避行為等[3，11～13]。生物標志物如超氧化物歧化酶活性、活性氧水平、脂質(zhì)過氧化水平和DNA損傷程度等也越來越多地用于生態(tài)毒理學[13-14]。在較低層次的生態(tài)風險評估中，回避試驗(測試周期 < 48h)作為早期篩選工具具有很大的潛力，因為它們敏感、成本效益高且具有生態(tài)相關(guān)性。而且Gainer等人發(fā)現(xiàn)[15]在受石油烴污染的土壤中，土壤無脊椎動物的回避行為能夠達到與敏感植物物種生長測量對污染物相似的響應(yīng)范圍。但是陸生無脊椎動物法也有一些局限性，如試驗成本較高、需要特殊儀器裝置等。

2.1.3 土壤微生物法

作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分之一，微生物常被用來評估重金屬或農(nóng)藥(如除草劑)污染土壤的毒性[16～18]。尤其是對于重金屬污染而言，土壤微生物比其他陸地生物對金屬濃度升高更敏感[19]。微生物測試方法常用的毒性指標包括土壤呼吸、土壤酶活性以及群落水平上的微生物生物量、群落結(jié)構(gòu)多樣性、活性等。相比于植物和動物，在技術(shù)層面上來說微生物方法最易實現(xiàn)對群落水平的研究。一些先進的分子生物學方法如基因芯片、高通量測序(Illumina平臺)、變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)等也逐漸應(yīng)用到生態(tài)毒理學領(lǐng)域中。如Romdhane等人[16]以細菌的群落多樣性和活性為測試終點來評價除草劑的生態(tài)毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于16S rRNA的高通量測序與代謝組學方法的結(jié)合是評估和比較天然和合成三酮對土壤細菌群落的生態(tài)毒理學影響的有力方法。與植物和動物法相比，微生物法操作簡便、試驗周期短、有良好的重現(xiàn)性，但鑒于不同土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)與數(shù)量不同，對污染物的靈敏度不盡相同，導致不同類型場地土壤的測試結(jié)果無法進行比較。

2.2 水生生物毒性測試方法

考慮到水體部分是大多數(shù)土壤污染物的最終受體，需要采用更全面的方法來評估其與陸地環(huán)境的相互作用。常用的如魚類毒性測試、發(fā)光菌毒性測試以及大型蚤(Daphniamagna)毒性測試等方法列于表2。比較發(fā)現(xiàn)，在魚類毒性試驗中，斑馬魚(Daniorerio)由于繁殖快、易于飼養(yǎng)和世代時間短等優(yōu)點，成為生態(tài)毒理學研究中的一種理想模式生物。而與成魚相比，斑馬魚胚胎具有敏感、快速、體外測試、高通量且倫理爭議少等優(yōu)點逐漸取代成魚(或幼魚)，在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。發(fā)光菌毒性測試方法由于靈敏、價格低可以用于污染土壤浸提液生態(tài)毒性的快速篩選[23]。目前國內(nèi)常用的3 種發(fā)光細菌為：明亮發(fā)光桿菌(Photosbacteriumphosphoreum)、費氏弧菌(Vibriofischeri)和青海弧菌(Vibrioqinghaiensis)。國外的發(fā)光菌毒理學研究開展得較早，成套方法一般稱為Microtox檢驗，也有特殊的專為土壤樣品而設(shè)計Microtox-STP?(固相測試)程序[24]。大型蚤(Daphniamagna)毒性試驗在土壤污染測試中，研究的指標主要有死亡率、繁殖率和運動抑制率，其中繁殖率和運動抑制率對重金屬污染土壤的浸提液表現(xiàn)出較高的敏感性[25-26]。另外，利用敏感的水生植物對水體污染情況進行監(jiān)測，也是有效反映水環(huán)境生態(tài)毒性的重要手段之一。

通過孔隙水吸收是水生生物對污染物的重要暴露途徑[27]，對土壤浸出液進行水生生物測定能夠分析化學品的遷移的可能性以及其對不同營養(yǎng)等級非目標生物的不利影響[28]。但是受試物種對浸提液pH有嚴格要求，如斑馬魚胚胎急性毒性測試要求pH在6.8～8.4，發(fā)光菌Microtox方法要求pH在6～8等。

表2 水生生物毒性測試方法Tab.2 Aquatic biological toxicity test methods

3 生物毒性測試方法選擇

生物毒性測試方法能檢測有關(guān)污染化學品的信息以及可能危害環(huán)境的物質(zhì)的生物可利用性。但是毒性測試方法對不同污染類型的場地土壤敏感性各異，僅利用單一的毒性測試方法無法準確而全面地反映污染場地的生態(tài)毒性效應(yīng)，成組的生物毒性測試方法可更加準確地揭示土壤的生態(tài)毒性。污染場地土壤通常是復雜的混合物，通過使用一系列包含不同功能水平、暴露途徑和測試終點的一組測試物種，可以正確評估其毒性，基本要求是有效性(污染場地條件的相關(guān)性)和生物測定的靈敏度[27]。生物毒性測試的條件和受試物種可借鑒國際上的標準方法?？紤]到場地土壤污染物的復雜性和現(xiàn)場環(huán)境條件的多變性，標準方法不可能適用于所有地區(qū)，受試物種、試驗方法、時間等需根據(jù)實際情況進行適當調(diào)整。如在選擇受試生物時，既要考慮國際上公認的模式生物，同時也應(yīng)該結(jié)合當?shù)氐膭又参锏膶嶋H情況，選擇更為常見、重要且敏感性好的物種。苗秀蓮等人[33]探究了我國5個優(yōu)勢跳蟲物種在瓊脂培養(yǎng)基條件下對鎳(Ni2+)的毒性響應(yīng)。Santorufo等人[4]利用彈尾蟲物種(O.pseudostachianus)作為受試生物，研究其對土壤毒性評估的作用。相比于標準物種跳蟲(F.candida)，該物種是歐洲本土物種，且廣泛分布于意大利，對當?shù)丨h(huán)境更具有代表性。

孫鐵珩等人[34]指出土壤生態(tài)毒理診斷的方法體系應(yīng)建立在土壤的不同功能和特殊用途的基礎(chǔ)上。國際標準化組織(ISO)17616中也提到在診斷不同類型的土壤(如農(nóng)業(yè)土壤與自然棲息地)毒性時，要選擇不同的生物毒性測試方法[35]。2018年6月我國頒布了農(nóng)用地(GB15618-2018)和建設(shè)用地(GB36600-2018)土壤環(huán)境質(zhì)量標準[36-37]。針對農(nóng)用土壤而言，建議結(jié)合高等植物、動物、微生物毒性測試來綜合評價土壤質(zhì)量；而對于建設(shè)用地，建議重點對動物毒性進行測定，而植物和微生物毒性可選擇性測定。污染物通過地表徑流、淋溶等途徑進入到地表水和地下水中，從而引起地表水體和地下水體污染，土壤污染被認為是對附近水生生態(tài)系統(tǒng)的主要威脅[38]。因此針對污染場地的生物毒性測試一般應(yīng)將陸生與水生生態(tài)毒性相結(jié)合。無論是農(nóng)用土壤還是建設(shè)用地，水生生物毒性測試都是必不可少的。

在眾多的生物學指標中挑選出快速、敏感的測試終點來評估場地土壤污染物的生態(tài)毒性一直是領(lǐng)域內(nèi)專家的重點研究方向。除了靈敏性之外，目前人們越來越關(guān)注“生物指標的早期預(yù)警性”，希望通過“組學”手段來發(fā)展新型的生物標志物。另有研究發(fā)現(xiàn)存在一些特異性生物標志物能夠指示某種特定類型的污染。如金屬硫蛋白(Metallothionein)參與調(diào)節(jié)痕量金屬的代謝并防止重金屬毒性和氧化應(yīng)激[39]。在過去幾年中，已經(jīng)提出使用金屬硫蛋白作為環(huán)境金屬污染的生物標志物，使用包括脊椎動物和無脊椎動物在內(nèi)的不同生物[40-41]。

4 結(jié) 論

4.1 利用生物毒性測試方法結(jié)合化學分析能夠較全面地評價土壤質(zhì)量。而每種生物毒性測試方法都有適用范圍，在對不同污染類型的場地進行風險評價時，需綜合考慮其靈敏度、生態(tài)相關(guān)性、方法的重現(xiàn)性、土壤利用類型等選擇合適的受試生物和測試終點。

4.2 陸生生物毒性測試方法適用于對實際原土的風險評價，反映土壤的棲息地功能。其中高等植物法操作簡單、結(jié)果準確可信、成本低。動物測試一般以存活、繁殖、畸形、行為反應(yīng)等為毒性終點。微生物法試驗周期短、重現(xiàn)性好，利用高通量測序、DGGE等較先進的技術(shù)分析群落結(jié)構(gòu)多樣性，能有效地評估污染土壤的毒性。

4.3 水生生物毒性測試方法利用水生生物(如魚類、發(fā)光菌、大型蚤等)來診斷土壤浸提液的生態(tài)毒性，常被用來評價土壤的滯留功能。其中斑馬魚(Daniorerio)是毒理學的理想模式生物，通過對斑馬魚的毒性測試能為人體健康風險評價提供一定參考。