庫德畢赤酵母包埋茶多酚工藝及穩(wěn)定性研究

馬冉冉，張丹丹，徐瑩*，王君瑋，程淑敏

1(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島, 266003) 2(中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東 青島, 266000)

微膠囊化是一種廣泛用于制藥工業(yè)的技術(shù)，近年來在食品工業(yè)中也開始廣泛應(yīng)用[1]。微膠囊包封能夠賦予活性化合物一定程度的穩(wěn)定性，其壁材可充當(dāng)氧或其他分子的物理屏障，防止有害反應(yīng)，同時(shí)還可以控制芯材的釋放[2]。由于微膠囊的穩(wěn)定性和釋放性高度依賴于壁材的組成，目前已經(jīng)使用了各種載體，包括環(huán)糊精、麥芽糖糊精、改性淀粉、樹膠、蛋白質(zhì)和納米顆粒、膠束或脂質(zhì)體[3]。但考慮到以上壁材有些可能存在化學(xué)試劑殘留，價(jià)格昂貴等問題，近年來發(fā)現(xiàn)一種容易獲得、成本低廉且安全無毒的酵母細(xì)胞，可作為新型微膠囊壁材[4]。酵母細(xì)胞含豐富的營養(yǎng)成分，它的磷脂膜可以表現(xiàn)為脂質(zhì)體，細(xì)胞壁則是由β-1，3-葡聚糖網(wǎng)絡(luò)、甘露糖蛋白層和少量幾丁質(zhì)組成，該壁能為細(xì)胞提供機(jī)械強(qiáng)度，并允許分子質(zhì)量高達(dá)760 Da的分子自由擴(kuò)散，而細(xì)胞膜是滲透分子的主要滲透屏障[5]。因此芯材可能包裹在細(xì)胞壁內(nèi)部與細(xì)胞膜之間。同時(shí)酵母細(xì)胞的通透性較高，在包埋時(shí)有助于芯材的進(jìn)入，將制備的微膠囊凍干后保藏，有利于芯材穩(wěn)定的存儲(chǔ)。使用酵母細(xì)胞作為壁材的微膠囊制備方法一般需要借助于不同的滲透壓，使物質(zhì)滲透到細(xì)胞壁進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，從而可形成微膠囊。目前大部分壁材用于包裹疏水脂溶性的物質(zhì)，如白藜蘆醇[6]、馬齒莧籽油[7]、魚油[8]。PARAMERA等[4]通過熒光顯微鏡，差示掃描量熱法和傅立葉變換紅外光譜證實(shí)，酵母細(xì)胞具有包埋姜黃素的可能性。在所有制備的微膠囊中，姜黃素被整合到質(zhì)膜雙層中，但也與細(xì)胞壁網(wǎng)絡(luò)的成分相互作用。而國內(nèi)外關(guān)于包埋水溶性物質(zhì)的報(bào)道甚少。

茶多酚(tea polyphenols，TP)是從茶葉中提取的天然多酚類物質(zhì)，是一種天然的水溶性食品抗氧化劑[9]，同時(shí)具有抑菌、絡(luò)合金屬離子[10]、抗癌和降脂等多種功效。TP的脂溶性較差，在存在光照、酸性或堿性溶液、氧化劑等條件下穩(wěn)定性較差，容易被氧化，從而限制了TP的應(yīng)用。因此利用微膠囊技術(shù)將TP包裹在壁材內(nèi)可以防止氧化劑、水分以及環(huán)境中其他成分對(duì)其造成破壞[11]，近年來相關(guān)研究也日益增多。盡管目前有少量報(bào)道TP微膠囊的制備，但尚不清楚微膠囊化TP的穩(wěn)定性是否可以得到改善。有研究以納米顆粒為載體，將TP包埋于納米粒子中，發(fā)現(xiàn)一定程度上可減緩胃腸道酶、微生物、電解質(zhì)成分對(duì)TP的損害，從而達(dá)到有一定緩釋作用以及保護(hù)TP的目的[12]。有研究將多酚用于商業(yè)多孔膜上與鈾形成超分子網(wǎng)絡(luò)以用做從海水中提取鈾的高效且經(jīng)濟(jì)上可行的材料[13]。GüLSEREN等[14]使用大豆磷脂和牛奶磷脂制備脂質(zhì)體包埋TP，所制備的納米粒子提高了游離TP的穩(wěn)定性，并且包封的TP具有緩釋作用。WANG等[15]為了提高TP的穩(wěn)定性，采用噴霧干燥法，以鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素為涂料，將其微膠囊化。對(duì)所獲得的微膠囊的性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，儲(chǔ)存穩(wěn)定性和抗氧化能力得到顯著提高。從而可得，微膠囊化不失為拓寬TP在食品工業(yè)中儲(chǔ)存和應(yīng)用的好方法。

本研究選用實(shí)驗(yàn)室保藏的庫德畢赤酵母(PichiakudriavzeviiA16)來作為新型微膠囊壁材，探究以其為載體包埋水溶性TP的可行性。同時(shí)確定了有效包封的最佳優(yōu)化條件，并對(duì)包埋過程和釋放過程進(jìn)行了研究。最后，還探究了微膠囊的貯藏穩(wěn)定性。旨在提高TP等環(huán)境敏感性功能成分的生物穩(wěn)定性，拓展其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TP(純度98%)：索萊寶生物科技有限公司；酵母菌：庫德畢赤酵母菌(PichiakudriavzeviiA16)，本實(shí)驗(yàn)室保藏；福林酚、Na2CO3、沒食子酸、NaCl、HCl、NaOH、Fe2(SO4)3:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶:諾維信(中國)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

QYC-2102C振蕩培養(yǎng)箱，上海福馬設(shè)備有限公司；Nicolet iS10傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo Fisher公司；CX21FS1，日本Olympus公司；JEM-1200EX，日本JEOL公司；真空冷凍干燥機(jī)，美國Sim公司；UV-2102型紫外分光光度計(jì)，上海尤尼柯公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 TP的檢測方法

TP測定參照GB/T 31740.2—2015 《茶制品第2部分：茶多酚》[16]的方法，按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A-樣品測試液吸光度；V-樣品溶液體積，100 mL；d-稀釋因子；SLOPEstd-沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；m-樣品質(zhì)量,g；w-樣品干物質(zhì)含量,%。

1.3.2 茶多酚酵母微膠囊的制備

1.3.2.1 酵母細(xì)胞壁材的制備

將酵母細(xì)胞經(jīng)斜面活化24 h，然后接種至液體YEPD培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，離心得到酵母細(xì)胞，用超純水清洗3遍后離心得到酵母菌泥，備用。

將收集到的酵母細(xì)胞按固液比1∶20加入到3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) NaCl，調(diào)至pH 5.5，于54 ℃，150 r/min水浴振蕩20 h，離心(6 000 r/min，10 min)。質(zhì)壁分離完成后，水洗3次，冷凍干燥，得到酵母菌壁材。

1.3.2.2 茶多酚酵母微膠囊的制備方法

稱取預(yù)處理的酵母細(xì)胞與TP樣品，加入去離子水，恒溫振蕩，離心，收集細(xì)胞，水洗3次，再次離心收集酵母細(xì)胞，冷凍干燥，得到包埋茶多酚的酵母微膠囊產(chǎn)品即茶多酚微膠囊(microcapsules of tea polyphenols，MTPs)。

1.3.3 包埋率的計(jì)算

包埋率是指微膠囊產(chǎn)品中被包埋的芯材含量與微膠囊產(chǎn)品中總的芯材含量之比。它是衡量包埋效果的指標(biāo)。包埋率計(jì)算公式(2)如下：

包埋率/%=

(2)

1.3.4 MTPs制備工藝的研究

單因素實(shí)驗(yàn):以包埋率為指標(biāo)，研究壁芯比例、包埋溫度和包埋時(shí)間等單因素對(duì)酵母細(xì)胞包埋TP的影響。

壁芯比例:分別按壁芯比例1∶2，1∶1，2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1 (質(zhì)量比)稱取一定量預(yù)處理的酵母細(xì)胞壁材與TP樣品，加入30 mL去離子水，在28℃條件下恒溫振蕩4 h，離心(4 000 r/min，5 min)，測定包埋率。

包埋溫度:按壁芯比例8∶1(質(zhì)量比)稱取一定量預(yù)處理的酵母細(xì)胞壁材與TP樣品，加入30 mL去離子水，分別在20、28、36、44、52、60℃條件下恒溫振蕩4 h，離心(4 000 r/min，5 min)，測定包埋率。

包埋時(shí)間:按壁芯比例8∶1(質(zhì)量比)稱取一定量預(yù)處理的酵母細(xì)胞壁材與TP樣品，加入30 mL去離子水，在28℃條件下恒溫振蕩0、1、2、4、6、8 h，離心(4 000 r/min，5 min)，測定包埋率。

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn):為得到制備MTPs的最佳工藝條件，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以(A)壁芯比例(6∶1，8∶1，10∶1)、(B)振蕩時(shí)間(2、4、6 h)和(C)溫度(20、28、36 ℃)為試驗(yàn)因素及水平，以包埋率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)3因素3水平Box-Behnken實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR)

將2 mg的TP樣品、凍干的酵母細(xì)胞和MTPs粉末碾磨均勻，使其分布在200 mg的KBr中壓片。壓片后放置在傅里葉變換紅外分光鏡中測定。

1.3.6 MTPs的形態(tài)觀察

1.3.6.1 電子顯微鏡觀察

分別將質(zhì)壁分離后的酵母細(xì)胞和MTPs經(jīng)Fe2(SO4)3染色后固定，于普通電子顯微鏡(electron microscope，EM)下觀察其微觀形態(tài)。

1.3.6.2 透射電子顯微鏡觀察

對(duì)包埋前后微膠囊微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察。分別將質(zhì)壁分離后的酵母細(xì)胞和MTPs用4%(體積分?jǐn)?shù))的戊二醛固定6 h以上，經(jīng)固定與沖洗后，完成純白膠包埋，烘干。取出膠粒，經(jīng)修塊和超薄切片后在80 kV加速電壓下進(jìn)行觀察。使用Nano Measurer 1.2測量200個(gè)樣品中壁膜間隙的大小以及通過SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.7 MTPs的釋放

參照文獻(xiàn)的方法[17]，將MTPs在模擬胃腸液中的釋放來模擬體外消化過程。根據(jù)參考文獻(xiàn)[18]描述制備模擬胃液和腸液，并進(jìn)行一些修改。模擬胃液：3.2 g胃蛋白酶，7 mL HCl并調(diào)至pH(1.2±0.1)，定容至1 000 mL。模擬腸液：6.80g KH2PO4溶解于水中并定容至500 mL，190 mL 0.20 mol/L NaOH以及400 mL蒸餾水，10.00 g胰蛋白酶，調(diào)pH(7.5±0.1)并定容至1 000 mL。稱取一定量MTPs樣品于(37±0.5) ℃，150 r/min恒溫水浴振蕩，在模擬胃液、腸液中消化時(shí)間分別為10 h，每隔一段時(shí)間取樣，測定MTPs的釋放情況。

1.3.8 MTPs的貯藏穩(wěn)定性分析

1.3.8.1 光照對(duì)MTPs穩(wěn)定性的影響

將MTPs樣品分別置于光照和黑暗條件下，每隔5 d取樣，每次通過測定釋放TP的含量來計(jì)算剩余TP的含量，公式(3)如下：

(3)

1.3.8.2 相對(duì)濕度對(duì)MTPs穩(wěn)定性的影響

將MTPs樣品分別置于飽和MgCl2溶液(RH=(32.78±0.16)%)，Mg(NO3)2溶液(RH=(52.89±0.22)%)和KCl溶液(RH=(84.34±0.26)%)[19]，每隔5 d取樣，每次通過測定釋放TP的含量來計(jì)算剩余TP的含量，計(jì)算方法同公式(3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTPs包埋工藝

2.1.1 單因素研究

壁芯比例、溫度和包埋時(shí)間對(duì)包埋率的影響見圖1。隨著壁芯比例的增大，包埋率隨之增大，最后趨向于穩(wěn)定，當(dāng)壁芯比例為8∶1時(shí)，TP包埋率達(dá)到68.75%，而殷佳雅等[20]用釀酒酵母包埋茶多酚其包埋率最高能達(dá)到35.71%。說明庫德畢赤酵母是可用且效率較高的新型微膠囊壁材。隨著溫度的升高，微膠囊的包埋率先升高后降低，在28 ℃達(dá)到最大，溫度過高，分子運(yùn)動(dòng)加快，促進(jìn)TP的細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，可另一方面也會(huì)使酵母細(xì)胞膜通透性增大，導(dǎo)致TP的溶出，包埋率也會(huì)隨之降低，同時(shí)TP氧化嚴(yán)重，溶液紅度增大。在振蕩時(shí)間為4 h左右，包埋率最大，而隨后包埋率又逐漸降低，可能是因?yàn)樵诎竦倪^程中有一部分TP通過物理吸附作用吸附在了細(xì)胞壁上，隨著時(shí)間的增長，TP與細(xì)胞壁的弱相互作用[21]，導(dǎo)致一部分吸附稀疏的TP脫離酵母菌，回到溶液中。

a-不同壁芯比例的包埋率;b-不同溫度下的包埋率;c-不同振蕩時(shí)間的包埋率圖1 不同因素對(duì)包埋率的影響Fig.1 The influence of different factors on the embedding rate

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)表1結(jié)果利用Design Export(8.0.6版)軟件，可得二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=68.48+3.89×A+0.22×B-0.82×C+0.048×A×B+0.36×A×C+0.21×B×C-4.38×A2-1.49×B2-2.81×C2

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results of response surface methodology experiment

注：“**”表示差異極顯著(P<0.01)；“*”表示差異顯著(P<0.05)。

經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化得到酵母菌包埋TP的最佳工藝條件為：壁芯比例為8.88 ∶1，溫度27.08℃，時(shí)間為4.15 h，此時(shí)包埋率可達(dá)到69.39%。考慮實(shí)際操作的方便性和可行性，將理論值修訂為：壁芯比例為9∶1， 溫度28 ℃，時(shí)間為4 h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)測包埋率為(68.12±0.35)%，與理論值較接近，說明優(yōu)化得到的工藝條件與實(shí)際情況擬合度較好，驗(yàn)證了模型的可靠性。

2.2 傅里葉變換紅外光譜

圖2是MTPs、酵母菌壁材、TP以及TP與酵母菌物理混合物的傅里葉紅外光譜圖。從圖中可以看出TP在3 342 cm-1處左右有個(gè)大且寬的特征吸收峰，是O-H的伸縮振動(dòng)；1 692 cm-1是羰基C=O的伸縮振動(dòng)；在1 610、1 517、1 463 cm-13個(gè)“指峰”是苯環(huán)骨架C=C伸縮振動(dòng)，1 314 cm-1是多種烷烴-CH2的疊加峰，在1 000～1 300 cm-1是C-O-C，C-OH，C-C3的振動(dòng)，650～900 cm-1是芳香取代基的面外變形振動(dòng)吸收峰。在酵母菌的光譜圖中，1 657cm-1處的吸收峰為酰胺Ⅰ帶，是C=O的伸縮振動(dòng)，1 548 cm-1的吸收峰是酰胺Ⅱ帶，是N-H的彎曲振動(dòng)和C-N的伸縮振動(dòng)，1 244 cm-1是酰胺Ⅲ帶，是C-N的伸縮振動(dòng)和N-H的彎曲振動(dòng)引起的。

1 064 cm-1處的吸收峰是由酵母中的RNA、DNA或細(xì)胞壁中存在的碳水化合物或醇中的C-O伸縮振動(dòng)引起的。圖3的結(jié)果顯示，MTPs與酵母菌壁材的圖譜高度一致，無明顯差異，并且沒有出現(xiàn)TP的特征峰，可能是TP與蛋白質(zhì)主鏈的肽基-NH-CO，側(cè)鏈上的OH、NH2以及COOH以氫鍵的形式多點(diǎn)結(jié)合[22]，發(fā)生了相互作用，而TP與酵母菌的簡單混合物中確實(shí)保留了TP的特征峰，因此可以看出TP確實(shí)包埋在了酵母菌內(nèi)部，而并非只是二者的簡單混合[23]。

圖2 TP、酵母細(xì)胞、微膠囊的傅里葉紅外光譜圖Fig.2 FTIR of TP, yeast cells and MTPs

2.3 MTPs的形態(tài)觀察

2.3.1 電子顯微鏡觀察

使用電子顯微鏡觀察Fe3+染色后的酵母壁材與MTPs，如圖3-a、圖3-b所示。Fe3+與TP鄰二羥基結(jié)合，形成絡(luò)合物從而使之呈現(xiàn)深藍(lán)色[24]。由圖3-a與圖3-b對(duì)比可明顯觀察到酵母細(xì)胞發(fā)生了明顯的質(zhì)壁分離，同時(shí)能看出在酵母細(xì)胞壁膜間隙顏色變深，即TP與Fe3+反應(yīng)生成深藍(lán)色絡(luò)合物，因此可以得出TP已進(jìn)入酵母細(xì)胞壁內(nèi)，同時(shí)包埋過程也未明顯改變酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

a-酵母壁材組(×2 000);b-MTPs組(×2 000)圖3 電子顯微鏡觀察酵母壁材和MTPsFig.3 EM of Pichia kudriavzevii A16 wall material and MTPs

2.3.2 透射電子顯微鏡觀察

對(duì)未包埋TP的酵母壁材(圖4-a，圖4-b)和MTPs(圖4-c，圖4-d)進(jìn)行透射電鏡觀察。

a-酵母壁材組(×30 000);b-酵母壁材組(×5 000);c-MTPs組(×30 000);d-MTPs組(×5 000)圖4 透射電鏡觀察酵母壁材和MTPsFig.4 TEM of Pichia kudriavzevii A16 wall materials and MTPs

由圖4-a可以看出，細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間界限明顯，說明酵母菌經(jīng)過NaCl處理后發(fā)生了質(zhì)壁分離；與圖4-a相比，圖4-c能明顯看出MTPs細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間的空隙減小，同時(shí)通過Nano Measurer 1.2測量了200個(gè)酵母細(xì)胞中壁膜間隙的大小以及SPSS軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出，包埋前后間隙大小分別為(0.17± 0.03)、(0.11± 0.03)μm，說明TP主要被包埋在酵母菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，與紅外圖譜結(jié)果相一致。由圖4-c和圖4-d可以看出，包埋TP后并沒有明顯改變酵母菌的結(jié)構(gòu)，酵母菌起到了封裝TP的載體作用。

2.4 胃腸液模擬釋放

MTPs在體外模擬條件下的釋放曲線見圖5。由圖可知，在最初的1 h內(nèi)，在胃液中釋放的比較快，在3 h趨于穩(wěn)定，這也符合人體胃液消化的基本規(guī)律。在腸液中0～6 h TP的釋放率一直呈上升趨勢(shì)，并且在模擬腸液中的釋放率要高于在胃液中的釋放率。腸液pH值環(huán)境和酶的作用會(huì)改變MTPs結(jié)構(gòu)，使TP更容易釋放。TAMIZHARASI等[25]也有相似的研究結(jié)果。6 h后釋放量相對(duì)平緩，釋放率最高能達(dá)到47.11%。累計(jì)在胃液與腸液中的釋放率能達(dá)到78.12%。

圖5 MTPs在模擬胃腸液中的釋放Fig.5 Release of MTPs in simulated gastric and intestinal fluids

2.5 MTPs的貯藏穩(wěn)定性

2.5.1 光照對(duì)MTPs穩(wěn)定性的影響

圖6表明了光照條件對(duì)MTPs貯藏穩(wěn)定性的影響。

圖6 光照條件下TP及MTPs的保留率Fig.6 Retention rate of TP and MTPs under light or dark conditions

從圖6中可以看出，避光儲(chǔ)存條件能明顯提高TP以及MTPs的穩(wěn)定性。同時(shí)酵母細(xì)胞一定程度上保護(hù)了TP不受光照的影響，在有光照條件下，貯藏35 d后，TP的保留率僅為79.33%，而MTPs的保留率為90.15%，這說明MTPs在一定程度上能保護(hù)TP，降低光照對(duì)TP的降解作用。曹龍奎等[26]也研究過微膠囊化玉米黃色素具有一定的光保護(hù)作用，明顯提高玉米黃色素的保留率。

2.5.2 相對(duì)濕度對(duì)MTPs穩(wěn)定性的影響

相對(duì)濕度對(duì)MTPs穩(wěn)定性的影響如圖7所示。在35 d后，MTPs在不同濕度下的保留率仍均在90%左右，明顯高于相同質(zhì)量的TP的保留率，說明MTPs壁材料能在一定程度上保護(hù)TP減少其損失。且隨著相對(duì)濕度越大，TP以及MTPs的保留率都會(huì)隨之降低，35 d左右，MTPs在RH=(32.78±0.16)%下的保留率最高，能達(dá)到91.47%，相對(duì)于相同條件下的TP的保留率提高了約(13.40±0.89)%。王華[27]在研究VA微膠囊的貯存穩(wěn)定性時(shí)表明，在低RH條件下穩(wěn)定性比較好。因此適當(dāng)降低濕度，保持干燥環(huán)境可以一定程度上保護(hù)TP，提高其保留率。

圖7 不同相對(duì)濕度下TP及MTPs的保留率Fig.7 Retention rate of TP and MTPs under different RH

3 結(jié)論

庫德畢赤酵母(PichiakudriavzeviiA16)作為壁材，能有效地包埋TP，起到了封裝TP的載體作用，在最優(yōu)條件下即壁芯比例9 ∶1，包埋時(shí)間為4 h，以及包埋溫度28℃，MTPs的包埋率為(68.12±0.35)%。MTPs能有效地減緩光照和濕度對(duì)TP的不利影響。胃腸液模擬消化實(shí)驗(yàn)表明MTPs總釋放率高于文獻(xiàn)報(bào)道的釋放率。本文探究了庫德畢赤酵母PichiakudriavzeviiA16作為新型微膠囊壁材包埋水溶性TP的可行性，為酵母的多重利用提供理論依據(jù)，同時(shí)也為解決生產(chǎn)中TP等環(huán)境敏感性成分的穩(wěn)定性問題提供了重要參考。