山柰酚抵抗對乙酰氨基酚引起的肝細胞損傷研究

張偉賢 蘭天 董嘉樂

摘要目的：探究山柰酚（KA）抵抗對乙酰氨基酚（APAP）誘導的肝細胞損傷的作用。方法：CCK8法檢測KA對肝細胞活性的影響，檢測細胞LDH釋放比率確定APAP誘導肝細胞損傷模型的濃度和時間;CCK8法檢測肝細胞活性，檢測肝細胞釋放的LDH，觀察肝細胞形態(tài)評估KA對對乙酰氨基酚誘導肝細胞損傷的影響;Western Blot檢測pJNK、JNK、EndoG蛋白表達。結(jié)果：本研究采用5 mmol/L APAP誘導肝細胞24 h建立藥物肝損傷細胞模型。與APAP組比較，KA組肝細胞細胞的形態(tài)明顯改善，凋亡細胞明顯減少（P<0.01），LDH釋放比率明顯下降（P<0.001），Western Blot結(jié)果表明經(jīng)KA治療后，肝pJNK和Endo G蛋白表達明顯下調(diào)。結(jié)論：該研究表明KA通過抑制pJNK和Endo G來抵抗APAP誘導肝細胞凋亡以達到肝細胞的保護作用。

關(guān)鍵詞山柰酚;對乙酰氨基酚;凋亡;肝細胞保護

中圖分類號：R996文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.008

對乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）又名撲熱息痛，是常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物，也是引起肝功能衰竭最常見的藥物。過量的APAP在肝臟經(jīng)過細胞色素P450酶（主要是CYP2E1、CYP1A2）代謝產(chǎn)生的活性產(chǎn)物N乙酰基對苯醌亞胺（Nacetyl4benzoquinone imine，NAPQI）是損傷肝細胞的毒素[1]。NAPQI過度消耗肝臟還原型谷胱甘肽（Glutathione，rglutamyl Cysteingl+glycine，GSH），并且NAPQI與線粒體膜上蛋白質(zhì)形成加合物，破壞線粒體結(jié)構(gòu)，進而導致線粒體氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和核DNA碎片化，導致肝細胞壞死[2，3]，最終大量的肝細胞壞死造成急性肝衰竭。目前N乙酰半胱氨酸（NAcetylLcysteine，NAC）是急性肝衰竭的特定治療藥物，但治療時間窗口窄，不少患者因缺乏及早發(fā)現(xiàn)肝衰竭的診斷標志物而錯過治療的最佳時間，最后導致肝衰竭。對APAP造成肝損傷嚴重的病例，唯一的治愈性治療選擇是肝移植，而前5年存活率約為70%。因此，臨床上急需替代治療方案[45]。那么，開發(fā)早期預防和治療APAP導致肝衰竭的藥物也具有重要的臨床意義。

山柰酚（Kaempferol，KA）屬于黃酮類化合物，微溶于水，溶于熱乙醇、乙醚和堿，廣泛分布于韭菜、洋蔥、綠豆、南瓜、馬鈴薯、番茄、草莓等多種蔬菜與水果，以及連翹、迷迭香、金合歡、銀杏葉、含羞草、桂皮等傳統(tǒng)中草藥[6]，近年研究表明，KA具有抗氧化、抗炎、抗癌、解毒等多種藥理活性作用[712]，本研究旨在探究KA對APAP誘導肝細胞損傷的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株人肝源細胞株（LO2）由中山大學黃河清教授實驗室贈送。

1.1.2藥物KA，純度≥98%（南京朗澤科技有限公司，生產(chǎn)批號：520138）;APAP，純度≥99%（上海麥克林生化科技有限公司，貨號：103902）。

1.1.3試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技（中國）有限公司，貨號：21600034，Gibco）;胎牛血清（Hyclone公司，貨號：SV30087.01）;青霉素和鏈霉素溶液（Hyclone公司，貨號：SV30010）;CCK8試劑盒（艾美捷科技有限公司，貨號：KTC011001）;triton X100（上海生工生物工程有限公司，生產(chǎn)批號：9002931）;LDH試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號：A0202）;脫脂奶粉（上海生工生物工程有限公司，貨號：E306BA0007）;pJNK一抗（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BM4380）;JNK一抗（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BM4329）;EndoG一抗（Affinity Biosciences公司，貨號：DF8541）;HRP標記的山羊抗兔抗體（普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司，貨號：W4018）。3111CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）;BDS系列倒置生物顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司）;LEGEND MICRO 17R冷凍高速離心機（Thermo公司）;WD9405B水平搖床（北京市六一儀器廠）;Transblot turbo轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（BioRAD公司）;QB206多用途旋轉(zhuǎn)搖床（上海市其林貝爾儀器制造有限公司）;33000297Q化學發(fā)光儀（上海勤翔科學儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1LO2細胞培養(yǎng)含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2APAP誘導LO2細胞損傷模型建立每孔預先加入100 μL完全培養(yǎng)基，將對數(shù)生長的LO2細胞105個/mL的密度接種于96孔板，每個孔100 μL，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換新鮮無血清培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。配制0，2.5，5，10 mmol/L APAP的無血清培養(yǎng)基，分別處理12、16、24 h后分別檢測上清液和上清液等體積的1% tritonX100溶液裂解細胞，計算LDH釋放比率。

LDH釋放比率=上清液LDH（上清液LDH+細胞裂解液LDH）×100%

1.2.3CCK8檢測KA對LO2細胞活性的影響每孔預先加入100 μL完全培養(yǎng)基，將對數(shù)生長的LO2細胞105個/mL的密度接種于96孔板，每個孔100 μL，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換新鮮無血清培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。加入不同濃度的KA（0，12.5，25，50，100 μmol/L），每個濃度設(shè)置3個復孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，每孔加入90 μL無血清培養(yǎng)基和10 μL CCK8溶液，在細胞培養(yǎng)箱3 h后檢測酶標儀450 nm吸光度。

細胞存活率=A（加藥）-A（空白）（A（0加藥）-A（空白）×100%

1.2.4KA對APAP誘導LO2細胞損傷的影響實驗分為6組，分別是空白對照組，模型組（APAP：5 mmol/L）、陽性對照組（黃芩苷，Baicalin，縮寫B(tài)A：10 μmol/L）和KA低、中、高劑量3個實驗組（APAP：5 mmol/L，KA：5，10，20 μmol/L）。將對數(shù)生長的LO2細胞105個/mL的密度接種于6孔板，每個孔2 mL，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換無血清培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，確保細胞密度在70%左右，APAP和給藥干預24 h，觀察肝細胞形態(tài)學變化，檢測上清液和LO2細胞裂解液LDH，計算LDH釋放比率。

1.2.5Western Blot檢測pJNK、JNK、EndoG蛋白表達情況按照以上既定的KA對APAP誘導肝損傷的實驗方法進行實驗，在藥物干預24 h后棄掉細胞上清液，PBS輕輕洗滌細胞3次，加入100 μL細胞裂解液（RIPA：PMSF=100∶1），用細胞刷收集細胞到1.5 mLEP管，放冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清。BCA法測定蛋白濃度，配制相同各組蛋白濃度，制備Western Blot上樣樣品，每個樣品上20 μg蛋白，進行電泳。電泳結(jié)束，PVDF膜用甲醇活化5 min，浸入轉(zhuǎn)膜液中10 min，根據(jù)儀器的規(guī)范轉(zhuǎn)膜方法進行操作，250MA恒流轉(zhuǎn)膜90 min;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后PVDF膜使用1%TBST洗3次，10 min/次，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜后4 ℃孵育一抗12 h，pJNK、JNK、EndoG、GADPH抗體（抗體：一抗稀釋液=1∶1 000）孵育，TBST洗膜后二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜，最后加入化學發(fā)光液顯影。

1.3統(tǒng)計學方法實驗所得數(shù)據(jù)均用（±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計由GraphPad Prism 6軟件處理，組間比較用單因素t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1CCK8檢測KA對LO2細胞活性的影響

為確定KA對LO2的安全濃度范圍，本實驗用CCK8檢測KA（0、12.5、25、50、100 μmol/L）在24 h對LO2細胞的毒性作用，根據(jù)細胞存活率要高于90%，因此，選擇了低、中、高3個安全濃度（5、10、20 μmol/L）進行后續(xù)實驗。見圖1。

2.2APAP誘導LO2細胞損傷模型的建立

為確定APAP誘導LO2細胞損傷模型的濃度和時間，本實驗設(shè)計了不同的APAP濃度（0、2.5、5、10 mmol/L）和不同處理時間（12 h、16 h、24 h）雙因素，以LDH釋放率來確定造模條件。結(jié)果表明，APAP濃度為5 mmol/L，時間為24 h時LHD釋放比率為40%，數(shù)值升高明顯而穩(wěn)定，以此為造模條件進行后續(xù)實驗。見圖2。

2.3KA對APAP誘導LO2細胞損傷的保護作用

LDH釋放比率實驗結(jié)果顯示，相比于空白對照組，模型組LDH釋放比率明顯升高（P<0.001）;陽性對照組對比模型組LDH釋放比率更高，3個不同濃度KA處理組的LDH釋放比率都有不同程度的下降（P<0.05，P<0.05，P<0.01），呈劑量依賴，以高劑量組的下降最明顯，表明KA對APAP誘導的肝細胞損傷有一定的保護作用。見圖3A。

形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組細胞生長良好，密度大，背景清晰，透明度大，遮光性均勻;模型組發(fā)生明顯的凋亡，細胞數(shù)量減少，細胞皺縮變圓;陽性對照組對比模型組細胞形態(tài)明顯改善，凋亡細胞數(shù)量少，大多數(shù)細胞呈梭形。相比于模型組，中劑量組和高劑量組細胞狀態(tài)有所改善，細胞數(shù)量有所增加，凋亡細胞數(shù)量減少。高劑量組細胞透明度大，背景清晰。表明KA對APAP誘導的LO2細胞損傷有一定程度的保護作用。見圖3B。

CCK8檢測結(jié)果顯示，模型組中的細胞存活率明顯降低（△△△△P<0.0001），陽性對照組中的細胞存活率對比模型組明顯提高（****P<0.0001），3個不同濃度KA（5、10、20 μmol/L）實驗組均能提高細胞的存活率（P<0.05，P<0.01，P<0.01），而且呈現(xiàn)劑量依賴性，高劑量的KA提高LO2細胞存活率的作用最大。表明KA對APAP誘導的細胞損傷具有保護作用，與細胞形態(tài)學觀察結(jié)果一致。見圖3C。

3.4KA對APAP誘導LO2細胞凋亡的保護作用

Westren Blot結(jié)果顯示，相對于空白對照組，模型組pJNK和Endo G蛋白表達量都顯著上調(diào);對比模型組，陽性對照組pJNK和Endo G蛋白表達都明顯下調(diào);與模型組比較，KA低中高組pJNK表達均有下調(diào)，高劑量最明顯，呈劑量依賴;與模型組比較，高劑量組Endo G表達明顯下調(diào)。見圖4。

4討論

攝入過量APAP是目前藥物性肝衰竭最主要的原因。不少患者因缺乏及早發(fā)現(xiàn)肝衰竭的診斷標志物而錯過治療的最佳時間，最后導致肝衰竭。對APAP造成肝損傷嚴重的病例，唯一的治愈性治療選擇是肝移植，而前5年存活率約為70%。因此，臨床上急需替代治療方案，開發(fā)早期預防和治療APAP導致肝衰竭的藥物也具有重要的臨床意義。

人肝源細胞（LO2細胞）是篩選保肝藥物的常用細胞[13]。本實驗建立穩(wěn)定的APAP誘導LO2細胞損傷的模型，探究不同APAP濃度（0、2.5、5、10 mmol/L）和誘導時間（12、16、24 h）對LO2細胞的損傷程度，發(fā)現(xiàn)APAP（5 mmol/L），誘導24 h，LO2細胞LDH釋放比率提高到40%，提高值明顯且穩(wěn)定，所以確定5 mmol/L，24 h作為造模條件。CCK8法（Cell Counting Kit8，細胞增殖毒性檢測試試劑盒）是可以直接進行細胞增殖和毒性分析的一種方法，該方法廣泛應(yīng)用于藥物篩選，細胞增殖測定以及細胞毒性測試等。本實驗使用CCK8法檢測了KA對LO2細胞活性以確定KA干預LO2的安全濃度范圍，實驗結(jié)果表明，KA在12.5～25 μmol/L的24 h細胞活力在90%以上，因此確定了KA低、中、高3個濃度（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）作為后續(xù)實驗研究。

LDH可做為肝細胞損傷的標志物，當LO2細胞損傷時會釋放LDH到細胞外，此時檢測上清液和細胞內(nèi)的LDH，計算出LDH釋放比率，可評估LO2細胞的損傷程度[14]。本研究顯示，對比模型組，3個KA干預組的LDH比率明顯降低（P<0.05、P<0.01、P<0.001），且具有劑量依賴性。觀察各組細胞形態(tài)，空白對照組細胞生長良好，密度大，背景清晰，透明度大，遮光性均勻;模型組發(fā)生明顯的凋亡，細胞數(shù)量減少，細胞皺縮變圓;不同濃度KA對LO2細胞有不同程度的保護作用，對中劑量組和高劑量組的保護作用明顯，細胞數(shù)量有所增加，凋亡細胞數(shù)量減少，高劑量組細胞透明度大，背景清晰;CCK8檢測結(jié)果顯示，模型組中的細胞存活率明顯降低（P<0.0001），陽性對照組中的細胞存活率對比模型組明顯提高（P<0.0001），KA低中高3個劑量組（5、10、20 μmol/L）均能提高細胞的存活率（P<0.05，P<0.01，P<0.01），高劑量組藥效為最佳。以上結(jié)果表明KA能抑制APAP誘導的LO2損傷和凋亡。

持續(xù)的JNK激活循環(huán)在APAP誘導的急性肝損傷和細胞凋亡中有著十分重要的作用。過量的APAP在肝臟經(jīng)過細胞色素P450酶（CYP2E1、CYP1A2等）代謝產(chǎn)生的活性產(chǎn)物NAPQI，NAPQI過度消耗肝細胞中線粒體還原型谷胱甘肽（GSH），隨后NAPQI會與線粒體膜上的蛋白共價結(jié)合形成NAPQI加合物，導致線粒體功能中度障礙和ROS釋放[12]。JNK是一種與應(yīng)激有關(guān)的促分裂原活化蛋白激酶，由活性氧（ROS）激活。其中JNK激活（即JNK磷酸化為pJNK）的幅度和持續(xù)時間是造成APAP急性肝損傷的主要因素[11]。JNK激活會加重線粒體障礙，進一步釋放ROS，形成JNK激活循環(huán)導致線粒體持續(xù)損傷。線粒體功能障礙導致ATP下降，最終引發(fā)肝細胞死亡;發(fā)生功能障礙的線粒體釋放核酸內(nèi)切酶（EndoG）到細胞質(zhì)中，EndoG轉(zhuǎn)位到細胞核中使DNA斷裂誘發(fā)細胞凋亡[15]。Western Blot結(jié)果顯示，KA能抑制pJNK和下調(diào)EndoG蛋白表達，提示KA通過抑制JNK激活改善線粒體功能而達到肝細胞的保護作用。

綜上所述，KA通過抑制JNK磷酸化，降低肝細胞氧化應(yīng)激，保護線粒體功能，抵抗DNA斷裂誘發(fā)細胞凋亡，從而達到保護過量APAP導致的肝細胞損傷;其作用效果可以利用體內(nèi)實驗作進一步驗證。KA可作為開發(fā)治療APAP導致肝損傷的潛在藥物。

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（2018-12-10收稿責任編輯：徐穎）