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    凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死綜合癥病蝦與健康蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌群比較分析

    2019-09-10 07:22:44蔣葛沈輝萬(wàn)夕和喬毅黎慧王李寶史文軍
    關(guān)鍵詞:凡納濱桿菌屬弧菌

    蔣葛 沈輝 萬(wàn)夕和 喬毅 黎慧 王李寶 史文軍

    摘要:為研究急性肝胰腺壞死綜合征(Acute hepatopancreatic necrosis syndrome,AHPNs)病原對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響,獲取更多的AHPNs防治基礎(chǔ)資料,采用PcR-RFTJP方法比較了江蘇地區(qū)患AHPNs病蝦和健康對(duì)蝦腸道微生物群落。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同生長(zhǎng)階段病蝦腸道中均只有弧菌屬細(xì)菌;對(duì)照的健康對(duì)蝦中,幼蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌為假單胞菌屬、食酸菌屬和固氮螺菌屬細(xì)菌;養(yǎng)殖中期對(duì)蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌為發(fā)光桿菌屬、弧菌屬和希瓦氏菌屬細(xì)菌;養(yǎng)殖后期對(duì)蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌為弧菌屬、紅桿菌屬、萊茵海默氏菌屬細(xì)菌。研究結(jié)果表明,凡納濱對(duì)蝦患AHPNs后腸道微生物群落明顯不同于健康對(duì)蝦,腸道菌群多樣性遭到破壞,弧菌為腸道內(nèi)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌,不同生長(zhǎng)階段健康對(duì)蝦的腸道優(yōu)勢(shì)菌存在差異。本研究探究了AhPNs病原對(duì)于凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響,并為認(rèn)識(shí)和防控AHPNs提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:對(duì)蝦急性肝胰腺壞死綜合癥:凡納濱對(duì)蝦:腸道微生態(tài)

    中圖分類(lèi)號(hào):s945.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1000-4440(2019)01-0142-07

    急性肝胰腺壞死綜合征(Acute hepatopancreaticnecrosis syndrome,AHPNS)是近年來(lái)影響凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的一種重要疾病。2009年該病在中國(guó)海南省發(fā)生,越南、馬來(lái)西亞、泰國(guó)、菲律賓相繼暴發(fā)該病。2011年以來(lái),AHPNS在中國(guó)廣東、廣西、福建、江蘇等對(duì)蝦主產(chǎn)區(qū)蔓延,造成凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)量銳減:泰國(guó)、越南、墨西哥等凡納濱對(duì)蝦主產(chǎn)國(guó)的對(duì)蝦產(chǎn)量也因該病的發(fā)生而受到嚴(yán)重影響。

    凡納濱對(duì)蝦發(fā)生AHPNS后體色發(fā)白,蝦殼變軟,攝食明顯減少,活力減弱,行動(dòng)遲緩。對(duì)蝦感染前期肝胰腺顏色暗淡蒼白或糜爛發(fā)紅,異常肥大:感染后期肝胰腺明顯萎縮,空腸空胃。苗種感染10d就可發(fā)病死亡,發(fā)病3 d內(nèi)死亡率可達(dá)100%。有研究結(jié)果顯示,一類(lèi)攜帶有特定致病基因PirA和PirB的弧菌屬細(xì)菌是該病發(fā)生的病原,其中主要是副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus)。病原弧菌含有的PiM和PirB基因會(huì)產(chǎn)生一種獨(dú)特的二元毒素,使靶細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變,導(dǎo)致感染對(duì)象死亡。Pi-ra和PirB位于一段69 kb大小的隱藏質(zhì)粒“pVAl”上,該質(zhì)粒含有轉(zhuǎn)座子基因,能發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移,被認(rèn)為是AHPNS近年來(lái)傳播較快的主要原因。目前,尚未見(jiàn)AHPNS有效治愈的報(bào)道。

    腸道菌群在維持對(duì)蝦健康中發(fā)揮著重要作用,對(duì)對(duì)蝦的生長(zhǎng)與免疫具有重要影響。對(duì)蝦腸道菌群不僅可以分泌蝦體所需的營(yíng)養(yǎng)素,而且可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)排斥抵抗病原微生物的侵襲,通過(guò)分析腸道菌群,可了解凡納濱對(duì)蝦的健康狀況。目前相關(guān)研究?jī)H限于正常對(duì)蝦腸道菌群,且僅見(jiàn)于飼料添加劑、微生態(tài)制劑對(duì)腸道菌群的影響方面,關(guān)于特定病原對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響報(bào)道較少。本研究通過(guò)健康對(duì)蝦與AHPNS病蝦的腸道細(xì)菌群落比較,研究AHPNS病蝦的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化,可以從腸道微生態(tài)調(diào)控的角度為該病的防控提供基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1試驗(yàn)材料

    1.1.1試驗(yàn)對(duì)蝦3份疑似AHPNS病蝦樣品(BSl~BS3)來(lái)源于江蘇省如東市3處出現(xiàn)大規(guī)模-對(duì)蝦暴死的養(yǎng)殖場(chǎng),表現(xiàn)為肝胰腺萎縮,空腸空胃,瀕死癥狀。對(duì)照樣品來(lái)自相同養(yǎng)殖場(chǎng)同批正常對(duì)蝦(表1),樣品采集后冷藏,24h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。每份樣品取6只對(duì)蝦個(gè)體,測(cè)量體長(zhǎng)并計(jì)算均值:無(wú)菌操作分離對(duì)蝦腸道,清除內(nèi)容物,取6只對(duì)蝦的腸道混合為一個(gè)樣品,滅菌生理鹽水沖洗內(nèi)表面后置于離心管中,研磨成勻漿,80℃冷凍備用。

    1.1.2主要試劑Taq DNA聚合酶、dNTPs、DLl00DNA marker、PMDl9-T克隆試劑盒和限制性?xún)?nèi)切酶為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。DNA提取試劑盒(3S DNA Isolation Kit V2.2)、DNA膠回收試劑盒為上海博彩生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

    研究發(fā)現(xiàn),AHPNS病蝦的腸道菌群結(jié)構(gòu)單一,弧菌屬細(xì)菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。有研究結(jié)果表明,白斑綜合征病毒(WhKe叩ot syndrome virus,WSSV)僅僅使得腸道菌群中各種屬細(xì)菌的數(shù)目和比例發(fā)生了改變,腸道菌群多樣性并未發(fā)生明顯變化,而AHPNS病原菌相較于WSSV,對(duì)于對(duì)蝦腸道菌群的影響更大,其造成腸道菌群結(jié)構(gòu)崩潰,印證了AHPNS引發(fā)高死亡率的特點(diǎn)。PiWAB基因編碼的二元蛋白毒素可插入感染對(duì)象的細(xì)胞膜上形成穿??锥?,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的改變,使靶細(xì)胞損傷甚至死亡。本研究中病蝦腸道近乎透明,腸道細(xì)窄,韌性消失,無(wú)內(nèi)容物。AHPNS病原菌的毒力極強(qiáng),進(jìn)入對(duì)蝦腸道后,分泌毒素,對(duì)蝦腸道細(xì)胞不斷壞死脫落,腸道細(xì)菌可能隨著壞死的腸黏膜和糞便一起排出體外,病蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)被完全破壞。腸道菌群對(duì)于對(duì)蝦的生長(zhǎng)和抗病具有重要作用,堪稱(chēng)是對(duì)蝦的另類(lèi)“器官”,若腸道菌群結(jié)構(gòu)被完全破壞,則對(duì)蝦的消化和抗病能力受到顯著影響。

    蝦類(lèi)腸道菌群結(jié)構(gòu)與其所處的生長(zhǎng)階段、生長(zhǎng)環(huán)境以及健康狀況有關(guān)。吳金鳳等研究發(fā)現(xiàn)發(fā)病對(duì)蝦腸道菌群多樣性顯著降低,孫振麗等通過(guò)高通量測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群與池塘底泥及水體菌群關(guān)系密切。水生動(dòng)物通過(guò)攝食將環(huán)境微生物和藻類(lèi)攝入腸道,某些細(xì)菌被排出體外,部分細(xì)菌定殖于腸道。對(duì)蝦養(yǎng)殖水體以及自然水體中的主要優(yōu)勢(shì)菌群為a-變形細(xì)菌綱和y-變形細(xì)菌綱細(xì)菌,凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群為變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)細(xì)菌,主要包含弧菌屬、假單胞菌屬、發(fā)光桿菌屬等細(xì)菌。本研究中健康對(duì)蝦ZCl、ZC2樣品為20日齡和50日齡的對(duì)蝦群體,腸道菌群受水體菌群影響,優(yōu)勢(shì)菌為弧菌屬、發(fā)光桿菌屬、紅桿菌屬細(xì)菌,歸屬于a-變形細(xì)菌綱和y-變形細(xì)菌綱。對(duì)蝦腸道菌群的組成是動(dòng)態(tài)變化的,不同生長(zhǎng)階段對(duì)蝦腸道菌群的組成也有較大的區(qū)別。蝦卵、糠蝦與幼蝦階段的蝦體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群為紅環(huán)菌科、柄桿菌目、伯克氏菌目、黃桿菌目、腸桿菌科、假單胞菌科細(xì)菌,弧菌屬細(xì)菌為劣勢(shì)菌。這與本研究的研究結(jié)果相近,ZC3樣品為幼蝦,腸道中優(yōu)勢(shì)菌為假單胞菌屬、食酸菌屬、短波單胞菌屬和固氮螺菌屬細(xì)菌。在分類(lèi)地位上,食酸菌屬歸屬于伯克氏菌目,固氮螺菌屬歸屬于紅環(huán)菌科,短波單胞菌屬則歸屬柄桿菌目。浮霉菌屬細(xì)菌是腸道優(yōu)勢(shì)菌群,吳定心首次發(fā)現(xiàn)浮霉菌綱(Planctomycetacia)細(xì)菌為凡納濱對(duì)蝦腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌,并認(rèn)為厭氧氨氧化細(xì)菌來(lái)自該綱,對(duì)氮循環(huán)起到一定作用?;【鷮倥c發(fā)光桿菌屬是條件致病菌,當(dāng)凡納濱對(duì)蝦受到氨氮等環(huán)境因子以及其他病原脅迫時(shí),可能發(fā)生繼發(fā)性感染,發(fā)生多種病原毒力疊加。

    本研究采用PCR-RFLP法研究了急性肝胰腺壞死綜合癥對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),健康凡納濱對(duì)蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌為弧菌屬、紅桿菌屬、萊茵海默氏菌屬、發(fā)光桿菌屬、弧菌屬等細(xì)菌,而凡納濱對(duì)蝦發(fā)生AHPNs后腸道菌群結(jié)構(gòu)單一,腸道中弧菌屬細(xì)菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。

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