豬繁殖與呼吸綜合征類NADC30與HP-PRRSV毒株RT-PCR鑒別方法的建立與應(yīng)用

徐雷 趙軍 楊曉宇 殷鑫歡 張繼宗 朱玲

摘要：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRsv）是一種能夠引起大面積呼吸道疾病并快速傳播，導(dǎo)致母豬流產(chǎn)和仔豬死亡的RNA病毒，其特性為變異快，存在毒株間的重組。因此，病原的快速檢測和鑒定對于該病的防控十分重要。本試驗(yàn)建立了一種能夠區(qū)分類高致病豬繁殖與呼吸綜合征病毒類NADc30與HP-PRRsv毒株的檢測方法，根據(jù)nsp2基因的高變區(qū)的比對結(jié)果，選擇其保守序列，設(shè)計(jì)一對檢測引物，類NADc30擴(kuò)增片段大小為334 bp，HP-PRRsv毒株擴(kuò)增片段大小為514bp，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，最終建立了一種一對引物就可以區(qū)分檢測類NADc30與HP-PRRsv毒株的RT-PcR檢測方法。應(yīng)用本試驗(yàn)所建立的RT-PcR方法對2017年12月至2018年2月采至四川多地區(qū)的疑似PRRsv感染發(fā)病的46份肺臟進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，類NADc30檢出率為32.6%，高于HP-PRRsv毒株的檢出率（10.9%）。該方法的建立，為類NADc30和HP-PRRsv毒株的快速鑒別診斷提供了方法，具有重要意義。

關(guān)鍵詞：

豬繁殖與呼吸綜合征;類NADc30;HP-PRRsv;鑒別診斷;RT-PcR

中圖分類號：s828 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-4440（2019）01-0109-05

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus，PRRSV）屬于動脈炎病毒科，有囊膜，是單股正鏈RNA病毒，基因組約長13～15kb。自1987年被首次報(bào)道時(shí)就一直是影響?zhàn)B豬業(yè)健康發(fā)展的呼吸道疾病和繁殖障礙的傳染性疾病，1996年郭寶清等首次從流產(chǎn)胎兒中分離出PRRSV，證實(shí)中國成為了PRRSV流行區(qū)域，隨后暴發(fā)豬繁殖與呼吸綜合征，然后發(fā)展成為高致病豬繁殖與呼吸綜合征（Highly pathogenic porcine repro-ductive and respiratory svn&ome.HP-PRRS）.并且逐步向全國蔓延。在2008年，美國暴發(fā)豬呼吸道疾病，并分離出病毒命名為NADC30，2013年，在中國河南首次發(fā)現(xiàn)了類NADC30，在2017年四川大面積暴發(fā)母豬流產(chǎn)，斷奶仔豬表現(xiàn)為呼吸困難，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)病原是類NADC30。仔豬和育肥豬伴隨有間質(zhì)性肺炎，出血性肺炎等癥狀，PRRSV通常導(dǎo)致免疫功能障礙，伴隨細(xì)菌感染，可能會有胸腔積液并形成絨毛心，病死率較高，母豬表現(xiàn)為流產(chǎn)。由于PRRSV會發(fā)生自身重組和缺失，造成近年來在中國流行毒株不斷發(fā)生變異，并形成很多新基因亞型和新型毒株，加之外來毒株傳入中國，雖然根據(jù)流行病學(xué)和臨床癥狀能夠確定感染PRRSV，但是HP-PRRSV毒株的疫苗對類NADC30交叉保護(hù)效果差，因此，病毒的鑒別對該病的控制非常重要。

PCR方法是鑒定PRRSV毒株的有效方法，目前已建立了類NADC30和HP-PRRSV毒株單一的PCR檢測方法。在實(shí)際生產(chǎn)中，一旦發(fā)現(xiàn)2個(gè)毒株同時(shí)感染或者單一毒株感染時(shí)，使用單一PCR對其進(jìn)行檢測就會出現(xiàn)操作麻煩，時(shí)間長，成本增加等缺點(diǎn)。因此，建立一種一對引物即可區(qū)分HP-PRRSV毒株和類NDAC30的RT-PCR將使診斷更加方便，本研究擬通過設(shè)計(jì)一對特異性引物，能夠以類NADC30和HP-PRRSV毒株為模板，擴(kuò)增出不同條帶，能夠快速有效地對類NADC30和HP-PRRSV進(jìn)行鑒別檢測。

1材料與方法

1.1病毒和病料

類NADC30（NADC30-1ike virus）、HP-PRRSV、豬瘟病毒（Classical swine fever，CSFV）、細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、日本乙型腦炎病毒（Jap-anese encephalitis virus，JEV）、輪狀病毒（Rotavirus，RV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissiblegastroenteritis virus，TGEV）均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心保存。病料（肺）采自四川眉山、遂寧、宜賓、瀘州、自貢等各市規(guī)?；B(yǎng)豬場。

1.2主要試劑

2xTaq PCR Master Mix、DNA Marker DL2000購自北京天根生化科技有限公司：RNAiso Plus、Prime-Script RT Kit購自大連寶生物工程有限公司。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的類NADC30毒株基因組序列（JN654459.1、KF724397.1、KF724398.1等）和HP-PRRSV株基因組序列（EUl06888.1、EU236259.1、EU236259.1等），通過MEGA對比，選取nsp2的保守序列，運(yùn)用Primier premier5.0設(shè)計(jì)引物，并采用NCBI網(wǎng)站上的blast方法，進(jìn)行比對其特異性，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

用所建立的RT-PCR鑒別方法對同一陽性模板進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示模板6次擴(kuò)增出來的目的條帶完全相同（圖5），證明該方法具有很好的重復(fù)性。

2.5臨床應(yīng)用

采用本試驗(yàn)建立的方法對采自四川眉山、遂寧、宜賓、瀘州、自貢等地的46份流產(chǎn)胎兒肺臟進(jìn)行檢測。顯示檢出類NADC30陽性15份，陽性率32.6%。檢出HP-PRRSV陽性5份，陽性率10.9%。與孫英峰等。建立的能夠區(qū)分HP-PRRSV、類NADC30的PCR檢測方法相比較，類NADC30檢測的一致性為93.3%（14/15），HP-PRRSV檢測的一致性為100%（5/5）。

3討論

PRRSV作為能夠引起呼吸和繁殖方面疾病的病毒，可通過呼吸道傳播，豬的規(guī)?；B(yǎng)殖模式為PRRS大規(guī)模爆發(fā)提供了潛在條件，一旦暴發(fā)，傳播迅速，導(dǎo)致大量仔豬死亡，會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV滅活疫苗存在安全性和免疫效果差的問題，且不能引起細(xì)胞免疫，為避免PRRS發(fā)生，規(guī)?；i場普遍使用PRRSV弱毒疫苗對豬群進(jìn)行防控，但是目前PRRSV弱毒活疫苗存在安全性問題，弱毒活疫苗對PRRSV有較好的防控效果，但是存在毒力返強(qiáng)，導(dǎo)致豬場發(fā)病;雖然同源毒株制成的疫苗可以形成交叉保護(hù)，但是不同毒株所制成的疫苗則不行：親緣性高的毒株容易在豬體內(nèi)進(jìn)行基因重組，形成重組毒株。中國西南地區(qū)流行的主要是HP-PRRSV，但是在2017年下半年，HP-PRRSV檢出率低，但是出現(xiàn)持續(xù)性暴發(fā)母豬流產(chǎn)，保育豬存在呼吸道疾病等問題，但是沒有檢測出圓環(huán)病毒和偽狂犬病毒。HP-PRRSV和類NADC30混合感染時(shí)，單一的PCR方法鑒別HP-PRRSV與類NADC30，耗時(shí)，操作步驟多，成本增加。

由于國內(nèi)流行毒株的重組或缺失變異以及毒株的多樣性，導(dǎo)致呼吸道疾病多樣化，一旦發(fā)病，防控困難，將會給養(yǎng)殖場帶來極大的損失。因此，對當(dāng)前的豬繁殖與呼吸綜合征進(jìn)行臨床監(jiān)測和分子流行病學(xué)調(diào)查十分必要，及時(shí)了解當(dāng)前流行的毒株，以進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，這樣才能夠?qū)σ咔檫M(jìn)行及時(shí)的防控。本研究根據(jù)最近四川部分地區(qū)的流行毒株建立類NADC30和HP-PRRSV毒株的RT-PCR鑒別方法，可以快速有效鑒別類NADC30和HP-PRRSV，其方便、靈敏、準(zhǔn)確、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，對于臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。