何首烏經枯草桿菌發(fā)酵后體外生理活性的變化

范瓊 趙敏 金明坤

摘要：【目的】分析何首烏經枯草桿菌發(fā)酵炮制后的生理活性變化，為研究何首烏的有效發(fā)酵炮制方法及開發(fā)何首烏炮制產品提供科學依據?！痉椒ā坑每莶輻U菌對何首烏生品進行發(fā)酵，考察何首烏生品和發(fā)酵品不同提取液（水和70%乙醇）的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除率、亞硝酸鹽清除能力、酪氨酸酶抑制率及血管緊張素轉換酶（ACE）抑制效果，評價何首烏發(fā)酵前后的抗氧化性、抑制黑色素和抗高血壓等體外生理活性變化情況?！窘Y果】何首烏生品和發(fā)酵品乙醇提取液的DPPH清除率分別為86.61%和96.24%，發(fā)酵品不同提取液的DPPH清除率均高于生品，且極顯著高于人工抗氧化劑丁基羥基茴香醚（BHA）和二丁基羥基甲苯（BHT）（P<0.01，下同）;何首烏生品和發(fā)酵品的亞硝酸鹽清除率隨pH降低而升高，pH為1.2時何首烏發(fā)酵品和生品乙醇提取液的亞硝酸鹽清除率分別為97.74%和92.38%，二者間差異極顯著;何首烏生品和發(fā)酵品乙醇提取液的酪氨酸酶抑制率分別為89.38%和97.04%，發(fā)酵品不同提取液的酪氨酸酶抑制率極顯著高于生品;何首烏發(fā)酵品水和乙醇提取液的ACE抑制率分別為32.41%和35.67%，極顯著高于生品（22.96%和31.43%）?！窘Y論】何首烏經枯草桿菌發(fā)酵其后體外生理活性均增強，且以有機溶劑乙醇溶液提取的生理活性效果更佳，該發(fā)酵方法是一種安全、可靠、有效的炮制方法，具有良好的應用價值和推廣前景。

關鍵詞： 何首烏;枯草桿菌;發(fā)酵;生理活性

中圖分類號： S567.239? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）01-0131-06

0 引言

【研究意義】何首烏是蓼科蓼屬多年草本植物，其主要用藥部分為塊根，被稱為中藥何首烏，是臨床常用中藥（趙明宇，2018）。何首烏主要成分包括二苯乙烯苷類、蒽醌類等（任紅微等，2018），生首烏具有解毒、截瘧、潤腸通便等功效，制首烏具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)、抗衰老、強筋骨等功效（國家藥典委員會，2010），臨床上多采用制首烏入藥。何首烏歷代炮制方法有凈制、切制、不加輔料制、加輔料蒸制、藥汁制、發(fā)酵制、微波蒸制、高壓蒸制等（張慶華和易炳學，2014），不同的炮制方法會使何首烏中化學成分發(fā)生不同變化，生理活性也會相應發(fā)生變化。發(fā)酵炮制方法是一種新型炮制方法，石聰?shù)龋?011）、杜晨暉等（2012）研究表明，用微生物炮制何首烏，條件溫和，可在破壞有毒成分的同時保持有效成分穩(wěn)定，相比其他傳統(tǒng)炮制方法更加安全可靠。因此，研究何首烏發(fā)酵炮制新方法，考察其體外生理活性變化，篩選出優(yōu)秀的發(fā)酵菌株，對開發(fā)何首烏發(fā)酵藥品、保健品及其在臨床上使用均有重要意義。【前人研究進展】目前，已有不少采用微生物進行何首烏發(fā)酵炮制的研究。杜晨暉等（2008，2012）研究表明，何首烏經米根霉發(fā)酵后，其瀉下作用有所降低，并篩選出具有專一性降解蒽醌類成分而不破壞二苯乙烯苷能力的菌株米根霉和YMS-006;石聰?shù)龋?011）研究發(fā)現(xiàn)，何首烏經微生物發(fā)酵后，通過光譜分析法得到的6個化學成分與生何首烏相比無明顯變化;Yu等（2012）比較傳統(tǒng)炮制和發(fā)酵炮制何首烏的抗氧化活性及致瀉作用，結果發(fā)現(xiàn)何首烏經炮制后抗氧化性活性均有所降低，但發(fā)酵何首烏可以最大程度保留何首烏的抗氧化活性且降低致瀉作用，米根霉是其中較理想的發(fā)酵菌株;范瓊和金明坤（2014）的研究結果表明，何首烏經乳酸桿菌發(fā)酵后總多酚和總黃酮含量均增加，抗氧化作用也明顯增強。【本研究切入點】枯草桿菌是一類對人體安全的微生物，有長期制備發(fā)酵食品的歷史，進入人體后可抑制致病原菌，提高人體細胞免疫功能，被美國食品藥品管理局（FDA）和中國農業(yè)農村部等部門批準為食品級安全菌株（王金斌等，2014）。但目前鮮見選用枯草桿菌對何首烏進行發(fā)酵炮制的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】采用枯草桿菌對何首烏進行發(fā)酵炮制，考察何首烏生品和發(fā)酵品不同提取液的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除率、亞硝酸鹽清除能力、酪氨酸酶抑制率及血管緊張素轉換酶（ACE）抑制效果，評價何首烏發(fā)酵后的抗氧化性、降低胃癌率、抑制黑色素和抗高血壓效果等體外生理活性變化情況，評估枯草桿菌發(fā)酵對何首烏的炮制效果，為研究何首烏的有效發(fā)酵炮制方法和開發(fā)何首烏炮制產品提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

何首烏為廣東省德慶縣產，經中國熱帶農業(yè)科學院農產品質量安全研究所鑒定為蓼科植物何首烏的干燥根;枯草桿菌購自韓國首爾大學細菌庫。DPPH、二丁基羥基甲苯（BHT）、丁基羥基茴香醚（BHA）、蘑菇酪氨酸酶（110 units/mL）、ACE（EC 3.4.15.1）和馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）均購自美國Sigma-Aldrich公司，其他試劑均為分析純。主要儀器設備：立式壓力蒸汽滅菌鍋（韓國Inchun公司）、UV-1601型紫外可見分光光度計（日本SHIMADZU公司）、冷凍干燥機（韓國Inchun公司）、Supra 21K高速離心機（韓國Inchun公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 樣品前處理 將生何首烏洗凈切片，60 ℃烘干，粉碎后過100目篩，存放于干燥器中作為何首烏生品待用。稱取500 g何首烏生品粉末置于錐形瓶中，加入500 mL蒸餾水按1∶1（m∶v）比例制備成何首烏混懸液，在蒸汽滅菌鍋中121 ℃下滅菌10 min，冷卻后接種5.0 mL枯草桿菌，發(fā)酵72 h，發(fā)酵液用冷凍干燥機干燥，粉碎后過100目篩，存放于干燥器中作為何首烏發(fā)酵樣品待用。

1. 2. 2 何首烏提取物溶液制備 乙醇提取液：分別取何首烏生品和發(fā)酵品粉末25 g，加入250 mL 70%乙醇，在恒溫振蕩器中振蕩24 h，離心過濾，用70%乙醇將濾液補齊至250 mL，所得濾液分別為何首烏生品和發(fā)酵品的乙醇提取液。水提取液：取何首烏生品和發(fā)酵品粉末各25 g，加入250 mL蒸餾水，85 ℃水浴回流5 h，離心過濾，并用蒸餾水將濾液體積補齊至250 mL，所得濾液分別為何首烏生品和發(fā)酵品的水提取液。

1. 2. 3 DPPH自由基清除率測定 參照范瓊和金明坤（2014）的方法，分別吸取0.1 mL何首烏生品、發(fā)酵品提取液、1.0 mg/mL BHT和1.0 mg/mL BHA溶液，各加入0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）0.4 mL后混勻，再加入0.5 mL 0.15 g/L的DPPH-乙醇溶液，混勻后在室溫下反應20 min，于517 nm處測定其吸光值，以蒸餾水為參比溶液，根據公式（1）計算清除率。

DPPH自由基清除率（%）=（1- [A-BC]）×100 （1）

式中，A為DPPH溶液與提取液的吸光值，B為Tris-HCl緩沖液與提取液的吸光值，C為DPPH溶液與提取溶劑的吸光值。

1. 2. 4 何首烏提取液降解亞硝酸鹽含量測定 采用稍加改良后的Griess試劑比色法進行測定，取1.0 mL何首烏生品和發(fā)酵品提取液分別加入10 mL比色管中，再加入1 mmol/L亞硝酸鈉標準溶液2.0 mL后混勻，分別將溶液pH調至1.2、3.0和5.0后定容，在37 ℃下反應1 h，取1.0 mL反應液加入5.0 mL 2%乙酸和0.4 mL Griess試劑，搖勻，靜置15 min后，在520 nm處測定溶液吸光值。根據公式（2）計算樣品對亞硝酸鹽的清除率。

亞硝酸鹽清除率（%）=（1- [A-BC]）×100? ? ? ?（2）

式中，A為提取液與Griess試劑的吸光值，B為提取液與蒸餾水的吸光值，C為蒸餾水與Griess試劑的吸光值。

1. 2. 5 何首烏提取液對酪氨酸酶抑制作用測定 參照劉杰超等（2013）的方法稍加修改后測定，取何首烏生品和發(fā)酵品提取液各500 μL置于2 mL比色管中，分別加入0.175 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 6.8）200 μL和5 mmol/L L-DOPA 200 μL，混勻后加入蘑菇酪氨酸酶液100 μL，35 ℃保溫2 min，在475 nm的吸光值下測定酶活力。將酪氨酸酶液換成蒸餾水作空白對照，根據公式（3）計算樣品提取液對酪氨酸酶的抑制率。

酪氨酸酶抑制率（%）=（1- [A-BC]）×100? ?（3）

式中，A為提取液與L-DOPA試劑反應的吸光值，B為提取液與蒸餾水反應的吸光值，C為蒸餾水代替酪氨酸酶與L-DOPA試劑反應的空白組吸光值。

1. 2. 6 何首烏提取液對ACE抑制作用測定 根據宋田源等（2017）的方法稍作修改進行測定。取何首烏生品和發(fā)酵品提取液各10 μL置于2 mL比色管內，分別加入15 mmol/L底物HHL溶液50 μL和磷酸鹽緩沖液（pH 8.3）40 μL，搖勻，37 ℃恒溫水浴預熱5 min，加入50 μL ACE酶液，混勻， 37 ℃水浴1 h后，加入1 mol/L HCl 250 μL終止反應;然后加入1.5 mL乙酸乙酯，混勻后在10000 r/min轉速下離心10 min，吸取上層乙酸乙酯1.0 mL移至另一比色管中，置于100 ℃烘箱中揮發(fā)30 min，待乙酸乙酯揮發(fā)完全，取出比色管冷卻，加入3.0 mL 1 mol/L NaCl，混勻，在228 nm處測定吸光值。ACE抑制率計算公式如下：

ACE抑制率（%）=[A-BA-C]×100 （4）

其中，A為提取劑代替提取液，與ACE和HHL完全反應的吸光值，B為提取液與ACE和HHL反應的吸光值，C為反應前失活ACE，加提取液后與HHL反應的吸光值。

1. 3 統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據均以3次重復的x±s表示，用Excel 2007進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2. 1 何首烏生品和發(fā)酵品對DPPH自由基的清除效果

從表1可看出，與人工抗氧化劑BHA和BHT的DPPH清除效果相比，何首烏發(fā)酵品的水提取液和乙醇提取液對DPPH的清除率（94.32%和96.24%）極顯著高于BHT（88.86%）和BHA（88.98%）（P<0.01，下同），生品的水提取液和乙醇提取液對DPPH的清除率（83.69%和86.61%）極顯著低于BHA和BHT;何首烏生品和發(fā)酵品兩種提取液的DPPH清除效果相比較，結果顯示，何首烏生品和發(fā)酵品的乙醇提取液DPPH清除率均極顯著高于水提取液。

2. 2 何首烏生品和發(fā)酵品對亞硝酸鹽的清除效果

亞硝酸鹽在胃中酸性條件下與胺類及氨基酸等反應生成亞硝胺和亞硝酰胺，而亞硝胺和亞硝酰胺對人體具有致癌作用（張立娟和陳睿，2013），因此，清除亞硝酸鹽是有效防止亞硝胺致癌的主要途徑（余華等，2005）。何首烏生品和發(fā)酵品的水和乙醇提取液在不同pH條件下對亞硝酸鹽的清除率如表2所示，從表2可看出，隨著pH的降低，何首烏生品和發(fā)酵品不同提取液對亞硝酸鹽的清除率均極顯著升高;在同一pH條件下，何首烏生品和發(fā)酵品乙醇提取液的亞硝酸鹽清除率均高于水提取液的亞硝酸鹽清除率;何首烏生品和發(fā)酵品對亞硝酸鹽的清除率相比較，發(fā)酵品的亞硝酸鹽清除率高于生品，當pH為1.2時，何首烏生品和發(fā)酵品水提取液的亞硝酸鹽清除率分別為53.69%和79.17%，二者差異達極顯著水平，何首烏生品和發(fā)酵品乙醇提取液的亞硝酸鹽清除率分別達92.38%和97.74%，二者差異也達極顯著水平。人體的胃酸值處于0.9～1.5，pH為1.2是模擬人體中胃酸的pH，表明何首烏提取液在人體消化過程中對亞硝鹽有一定的清除效果，且何首烏發(fā)酵品的亞硝酸鹽清除率高于何首烏生品，可降低人體胃癌發(fā)生率。

2. 3 何首烏生品和發(fā)酵品對酪氨酸酶的抑制效果

人體中酪氨酸酶常見于黑色素細胞中，是生物體合成黑色素的關鍵酶，與白化病、黑色素瘤等疾病相關（張捷等，2012）。本研究考察何首烏生品和發(fā)酵品對酪氨酸酶的抑制作用，結果（表3）顯示，何首烏發(fā)酵后對酪氨酸酶的抑制率極顯著提高，何首烏發(fā)酵品水提取液和乙醇提取液對酪氨酸酶的抑制率分別為94.57%和97.04%，而何首烏生品水提取液和乙醇提取液對酪氨酸酶的抑制率分別為82.35%和89.38%。表明何首烏具有一定的抑制黑色素效果，經枯草桿菌發(fā)酵后何首烏抑制黑色素效果增強，同時，何首烏生品和發(fā)酵品乙醇提取液抑制黑色素的效果優(yōu)于水提取液，差異極顯著。

2. 4 何首烏生品和發(fā)酵品對ACE的抑制效果

抑制ACE被認為是一個控制高血壓的有效治療方法，而ACE抑制模型被證明是一個有效篩選抗高血壓藥物和功能食品的方法（趙瑜等，2017）。從表4可知，何首烏發(fā)酵品水提取液和乙醇提取液對ACE的抑制率分別為32.41%和35.67%，均高于生品（22.96%和31.43%）且差異極顯著;乙醇提取液的ACE抑制率高于水提取液，差異極顯著。表明發(fā)酵的何首烏具有開發(fā)抗血壓功能性藥品的潛力。

3 討論

雖然目前已有關于何首烏發(fā)酵炮制的研究，但何首烏發(fā)酵后的生理活性，特別是降血壓、降亞硝酸鹽和抑制黑色素等作用的研究尚無報道。本研究首次選用枯草桿菌對何首烏進行發(fā)酵，何首烏經枯草桿菌發(fā)酵后，其DPPH自由基清除率、亞硝酸鹽清除率、酪氨酸酶抑制率及ACE抑制率等生理活性指標明顯提高。選用常用無機提取溶劑水和具有代表性的有機溶劑70%乙醇對何首烏進行提取，分析比較各項生理活性指標，結果表明何首烏發(fā)酵品和生品的乙醇提取液生理活性均高于發(fā)酵品和生品的水提取液，可能與何首烏中主要抗氧化性成分總蒽醌、二苯乙烯苷、總多酚、類黃酮等更易溶解于乙醇溶劑有關（周瑩等，2014）。范瓊和金明坤（2014）研究表明，何首烏經乳酸桿菌發(fā)酵后抗氧化成分總多酚和黃酮含量增加，發(fā)酵品水提取液和乙醇提取液的DPPH清除率分別為89.95%和94.62%，對亞硝酸鹽的清除率在pH 1.2時分別為70.0%和98.2%。本研究結果與之相比，枯草桿菌發(fā)酵何首烏的抗氧化和降解亞硝酸鹽生理活性效果優(yōu)于乳酸桿菌，是值得開發(fā)和推廣的何首烏發(fā)酵菌株。王真（2011）的研究結果表明，何首烏經微生物發(fā)酵后，不會產生新的化學成分，但蒽醌類物質和二苯乙烯苷的化學成分含量會增加，使得藥理活性增強。因此可初步推斷，何首烏經枯草桿菌發(fā)酵后有效抗氧化成分增加，生理活性得到增強。

王鵬等（2013）研究表明，人體內有害自由基是導致人體衰老和多種疾病產生的重要原因。黑色素的合成也與人體內產生過量的自由基有關，自由基可參與黑色素過程中酪氨酸酶的表達水平，促成黑色素合成，對人體產生危害。很多天然產物在抑制黑色素瘤和黑色素細胞的同時均表現(xiàn)出顯著的抗氧化和清除自由基能力。因此，本研究中何首烏發(fā)酵后抗氧化、抗高血壓等生理活性的提高具有相輔相成的作用，是何首烏炮制品內眾多抗氧化化學成分結合作用的結果，但引起何首烏發(fā)酵后生理活性提高的具體原因在機理和化學成分的變化上還需進一步研究。

4 結論

何首烏經枯草桿菌發(fā)酵后其體外生理活性均增強，且以有機溶劑乙醇溶液提取的生理活性更強，該發(fā)酵方法是一種安全、可靠、有效的炮制方法，具有良好的應用價值和推廣前景。

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（責任編輯 羅 麗）