基于SSR分子標記的廣西德?？h和隆林縣野生古茶樹聚類分析

彭靖茹 李朝昌 檀業(yè)維 溫立香 張芬 葉靖平

摘要：【目的】對廣西德?？h和隆林縣野生古茶樹及其他省份名優(yōu)栽培種茶樹進行聚類分析，為野生古茶樹種質資源保護、良種選育及創(chuàng)新利用提供理論參考?！痉椒ā坷煤Y選出的15對SSR引物對9份廣西德?？h和隆林縣的野生古茶樹種質和15份名優(yōu)栽培種茶樹種質進行聚類分析，并計算遺傳相似系數(shù)?！窘Y果】篩選出的15對引物從德保04和德保05未擴增出任何條帶，但從其余22份茶樹樣品中共擴增出183條譜帶，其中CS1引物擴增出多態(tài)性譜帶最多，為19條，最少為CS13引物，僅7條，平均每對引物擴增出多態(tài)譜帶12.26條，多態(tài)率為96.17%。22份茶樹種質資源可聚為兩大類群，其中德保縣和隆林縣的野生古茶樹聚在Ⅰ類群，栽培種茶樹聚在Ⅱ類群。根據(jù)遺傳相似系數(shù)，也可獲得上述相同的分類結果。茶樹品種間的遺傳相似系數(shù)為0.48～0.84，平均遺傳相似系數(shù)為0.67，其中，野生古茶樹種質資源間的遺傳相似系數(shù)為0.68～0.84;栽培種茶樹間的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.84;野生古茶樹與栽培種茶樹的遺傳相似系數(shù)為0.48～0.77。僅德保06與其他野生古茶樹（隆林42和德保01）遺傳相似系數(shù)小于0.70;栽培種茶樹與野生古茶樹相比，僅黃觀音與野生古茶樹（德保01和德保G02）遺傳相似系數(shù)大于0.70?！窘Y論】廣西德保縣和隆林縣的野生古茶樹種質起源相近，與我國其他各省份的名優(yōu)栽培種茶樹親緣關系較遠，存在相遠近親和相近遠親共存現(xiàn)象，進一步證實廣西德保縣野生古茶樹為五柱茶系的厚軸茶，推測桂西北山區(qū)廣泛分布山茶屬原始種系。

關鍵詞： 野生古茶樹;SSR分子標記;聚類分析;遺傳相似系數(shù);廣西

中圖分類號： S571.102.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）01-0001-07

0 引言

【研究意義】野生古茶樹蘊藏各種優(yōu)良性狀的遺傳基因，對茶樹的分類、演化、變異、育種及生產(chǎn)等均具有較高的研究利用價值。廣西適宜茶樹生長，野生古茶樹種質資源非常豐富，尤其以百色地區(qū)、十萬大山和六萬大山最豐富（陳亮和虞富蓮，1996;諸葛天秋等，2016）。因此，收集廣西野生古茶樹種質資源并分析其遺傳多樣性，對其資源保護、新品種育種及開發(fā)利用均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，已有較多有關廣西野生古茶樹種質資源的研究報道。左志明等（1994）對桂西山區(qū)的野生古茶樹進行考察，結果發(fā)現(xiàn)，百色、隆林、那坡、德保等縣（市）的野生古茶樹多為喬木或小喬木樹形，且果大皮厚，中軸粗大，種隔明顯，為山茶屬茶組植物早期分化的原始種系，具有較高的學術研究價值。賴兆榮等（2015）從廣西崇左扶綏縣姑遼收集野生古茶樹種質資源，并利用其成功選育了多酚含量達特異資源指標且制茶品質較好的優(yōu)異單株。劉彤等（2015）利用10條ISSR引物對柳州九萬山的野生古茶樹種質資源進行親緣關系和遺傳多樣性研究，結果表明，其遺傳多樣性較豐富，但大部分單株親緣關系較近。陳瑩玉等（2016）采用RAPD分子標記分析廣西金秀縣4個地方的8個野生古茶樹資源與其他省份茶樹栽培品種的親緣關系，結果表明，廣西金秀縣的野生古茶樹資源具有原始特性，且遺傳多樣性較豐富。藍燕等（2017）、韋柳花等（2017）對廣西野生古茶樹葉片解剖結構觀察、適制性、化學成分、形態(tài)特征等進行研究，挖掘出一些優(yōu)質或特異的野生古茶樹種質資源。李朝昌和蔣漓生（2018a）對廣西16個市（縣）33個點的野生古茶樹進行系統(tǒng)、全面地調查，共收集了150份野生古茶樹資源，其內含物差異較明顯，部分種質達到茶樹優(yōu)異種質資源標準?！颈狙芯壳腥朦c】廣西隆林縣和德?？h的野生古茶樹資源主要分布于云貴高原的邊緣地帶，野生古茶樹種質資源非常豐富，但該地地理位置偏僻，其野生古茶樹資源未能充分開發(fā)利用。雖然藍燕等（2017）、李朝昌和蔣漓生（2018a）對廣西百色德?？h和隆林縣的野生古茶樹資源進行收集、性狀觀察、生化分析等，但未見從DNA水平上開展其遺傳多態(tài)性及親緣關系研究的報道?！緮M解決的關鍵問題】利用SSR分子標記對廣西德?？h和隆林縣的野生古茶樹種質資源和其他省份名優(yōu)栽培種茶樹進行聚類分析，并從DNA水平進行種質鑒別，為廣西野生古茶樹種質資源保護、良種選育及創(chuàng)新利用提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試茶樹種質資源為廣西百色市德?？h東凌鄉(xiāng)新屯村和隆林縣德峨鄉(xiāng)東南村的野生古茶樹及廣西亞熱帶作物研究所茶葉種質資源圃的名優(yōu)栽培種茶樹，具體信息見表1。主要試劑：HYQspinTM CT Plant DNA Kit試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;2×Taq? PCR Master Mix和DNA Marker購自TaKaRa公司;30%丙烯酰胺（29∶1）購自北京索萊寶科技有限公司;硝酸銀和其他試劑購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司。主要儀器設備：PCR擴增儀（ABI 9600，美國）、核酸蛋白質含量測定儀（BIO-RAD，美國）、DYY-6C電泳儀（北京六一儀器廠）和DYCZ-30C雙板夾芯式垂直電泳槽（北京六一儀器廠）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 樣品采集 分別采集茶樹的新鮮葉片樣品置于帶干冰的保溫箱進行保存及運輸，在實驗室加液氮研磨處理，并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 DNA提取 采用HYQspinTM CT Plant DNA Kit試劑盒提取茶樹新鮮葉片DNA，并以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量、核酸蛋白質含量測定儀測定其純度。

1. 2. 3 引物篩選及合成 參照姚明哲（2009）報道的40對SSR引物，從中篩選出15對在栽培種茶樹多態(tài)性擴增效果較好的引物（表2），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1. 2. 4 PCR擴增及產(chǎn)物檢測

PCR反應體系20.0 μL：2×PCR Mix 10.0 μL，30 μg/μL DNA模板1.0 μL，10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。PCR擴增在ABI9600基因擴增儀上進行。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 45 s，各引物退火溫度（表2）退火45 s，72 ℃ 45 s，進行35個循環(huán);72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取2.0 μL PCR產(chǎn)物在8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行檢測（恒電壓200 V，電泳時間60 min）。電泳結束后，非變性聚丙烯酰胺凝膠用硝酸銀進行染色顯影，具體方法：非變性聚丙烯酰胺凝膠先用ddH2O沖洗3次，每次洗1 min，然后置于0.5%～1.5%硝酸銀中染色10～15 min，再用ddH2O沖洗3次，每次洗1 min，最后，在顯影液中輕搖至顯帶清晰后放入ddH2O終止顯影。

1. 3 統(tǒng)計分析

每對SSR引物檢測到的各多態(tài)性條帶均為一個等位基因。觀察并統(tǒng)計擴增出的等位基因條帶，將相同位置上有清晰條帶賦值為“1”，無帶時賦值為“0”，缺失時賦值為“9”，從而建立矩陣。利用NTSYSpc 2.10進行UPGMA聚類分析，并構建Neighbor-joining（NJ）系統(tǒng)發(fā)育進化樹，計算Jaccard遺傳相似系數(shù)。

2 結果與分析

2. 1 DNA提取及電泳檢測結果

用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測24份茶樹新鮮葉片DNA，上樣量為2.0 μL，結果（圖1）顯示其DNA主帶清晰，整齊無彌散，且點樣孔無其他雜質。提取的茶樹新鮮葉片DNA OD260/OD280為1.8～2.0。

2. 2 茶樹種質資源SSR多態(tài)性分析結果

采用篩選出的15對SSR引物對24份茶樹樣品進行PCR擴增，結果發(fā)現(xiàn)，從野生古茶樹種質德保04和德保05中未擴增出任何條帶，其余22份茶樹樣品的擴增產(chǎn)物大小為20～500 bp，與預期結果相符。引物CS7和CS15擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果如圖2和圖3所示。

由表3可知，15對SSR引物共擴增出183條譜帶，其中CS1引物擴增出多態(tài)性譜帶最多，為19條，最少為CS13引物，僅7條，平均每對引物擴增出多態(tài)譜帶12.26條，多態(tài)率為96.17%?？梢?，SSR分子標記在茶樹種質資源中具有較高的多態(tài)性，適用于茶樹種質資源遺傳多樣性分析。

2. 3 聚類分析結果

由于篩選出的15對SSR引物從德保04和德保05未擴增出任何條帶，因此，只能對其余22份茶樹種質資源進行遺傳相似系數(shù)計算和聚類分析，結果如圖4和表4所示。22份茶樹種質資源可聚為兩大類群，其中德?？h和隆林縣的野生古茶樹聚在Ⅰ類群，栽培種茶樹聚在Ⅱ類群。根據(jù)遺傳相似系數(shù)，也可獲得上述相同的分類結果。22份茶樹種質資源間的遺傳相似系數(shù)為0.48～0.84，平均遺傳相似系數(shù)為0.67，其中，野生古茶樹種質資源間的遺傳相似系數(shù)為0.68～0.84，以隆林01與隆林42的遺傳相似系數(shù)最高，為0.84，說明二者的親緣關系最近;其次是德保01與德保G02，為0.83;以德保06與德保01的遺傳相似系數(shù)最低，為0.68，說明二者的親緣關系最遠;僅德保06種質與其他野生古茶樹（隆林42和德保01）遺傳相似系數(shù)小于0.70。栽培種茶樹的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.84，其中黃觀音與白葉一號的遺傳相似系數(shù)最高，為0.84，表明二者的親緣關系最近;其次是黃觀音與黃金芽，為0.82，紫鵑與云大2的遺傳相似系數(shù)最低，僅為0.62，表明二者的親緣關系最遠。野生古茶樹與栽培種茶樹的遺傳相似系數(shù)為0.48～0.77，其中以德保G02與黃觀音的遺傳相似系數(shù)最高，為0.77，表明二者的親緣關系最近;隆林06與福鼎大毫的遺傳相似系數(shù)最低，為0.48，說明二者的親緣關系最遠。栽培種茶樹與野生古茶樹相比，僅黃觀音、德保01和德保G02的遺傳相似系數(shù)大于0.70，其余栽培種茶樹與野生古茶樹的遺傳相似系數(shù)均小于0.7，表明野生古茶樹與我國其他省份名優(yōu)栽培種的遺傳距離較遠，可用于茶樹遠源雜交選育優(yōu)良品種。

3 討論

本研究的聚類分析結果顯示，22份茶樹種質資源可聚為兩大類群，其中廣西德?？h和隆林縣的野生古茶樹聚在Ⅰ類群，栽培種茶樹聚在Ⅱ類群，根據(jù)遺傳相似系數(shù)，也可獲得相同的分類結果，表明廣西德保縣和隆林縣的野生古茶樹種質進化起源相近。此外，在9份野生古茶樹樣品中，篩選出的15對引物從德保04和德保05未擴增出任何條帶，致使這2份樣品無法進行聚類分析及遺傳相似性分析，說明這15對引物不適用于全部野生古茶樹的遺傳相關性分析，但非常適用于栽培種茶樹的遺傳相關性分析，間接證明野生古茶樹與栽培種茶樹間的遺傳信息差異明顯。綜上所述，廣西德?？h和隆林縣的野生古茶樹種質起源相近，與栽培種茶樹親緣關系較遠。

本研究供試野生古茶樹來源于德保縣東凌鎮(zhèn)、隆林縣德峨鄉(xiāng)，兩地相距較遠（約300 km），但聚類分析結果顯示，隆林縣的隆林049先與德保縣的德保01和德保G02聚為一小類，而不是與隆林縣的其他野生古茶樹先聚類，表明隆林049與其地理距離遠的隆林縣野生古茶樹種質遺傳距離最小;遺傳相似系數(shù)分析結果顯示，德保的德保06與德保01遺傳相似系數(shù)最小為0.68，表明德保06與其地理距離近的德保縣野生古茶樹遺傳距離較遠。綜上所述，野生古茶樹遺傳距離與地理距離不是單純的“遠對遠”、“近對近”對應關系，既存在地理距離近且遺傳距離近（稱“相近且近親”）的同種聚集現(xiàn)象，也存在地理距離遠且遺傳距離近（稱“相遠且近親”）的同種分散現(xiàn)象、地理距離近且遺傳距離遠（稱“相近且遠親”）的異種共存現(xiàn)象等情況。因此，將德?？h和隆林縣野生古茶樹同時存在的2種非對應情況簡稱為相遠近親和相近遠親共存現(xiàn)象。

厚軸茶是茶組植物較原始的種之一。廣西德?？h的野生古茶樹子房3～5室，經(jīng)鑒定是五柱茶系的厚軸茶（張宏達，1984年），其咖啡堿含量非常低，為0.34%（藍燕等，2017），根據(jù)農業(yè)農村部標準NY/T 2031—2011《農作物優(yōu)異種質資源評價規(guī)范 茶樹》描述屬于茶樹特異種質資源，是選育低咖啡堿茶樹的良好親本材料。廣西隆林縣的野生古茶樹為特大葉的喬木型茶樹，子房5室，咖啡堿含量2.7%～3.0%，不屬于低咖啡堿特異種質資源（李朝昌和蔣漓生，2018b），但是否屬于厚軸茶種質資源，還需進一步對其果實、花、葉等方面進行觀測研究。厚軸茶主要分布于云南的文山、紅河及貴州等地區(qū)（張文駒等，2018），基本是按采集地進行區(qū)分，但各地厚軸茶種質資源間的差異鮮見報道，尤其是DNA水平間的遺傳差異未見報道。由于桂西北山區(qū)與云南、貴州等厚軸茶分布地區(qū)相鄰，地理距離相近、環(huán)境氣候相似，且前人（張宏達，1984）已將廣西德?？h的野生古茶樹鑒定為五柱茶系的厚軸茶，本研究也從DNA水平證實廣西德?？h和隆林縣野生古茶樹存在“相遠近親和相近遠親共存現(xiàn)象”。因此，推測桂西北山區(qū)廣泛分布山茶屬原始種系。

茶樹種質資源的傳統(tǒng)鑒別方法主要是根據(jù)新梢、定型葉、營養(yǎng)芽物候期、花、果實等性狀進行判定。本研究采集的茶樹栽培種主要引種于湖南、福建、云南、浙江等地選育的優(yōu)良品種，在當?shù)貜V泛種植。由于廣西亞熱帶作物研究所茶葉種質資源圃位于南寧市，其氣溫相對較高，部分品種茶樹的特殊性狀發(fā)生明顯變化，如白葉一號是浙江省選育出的優(yōu)良品種，是制作安吉白茶的主要茶樹品種，在當?shù)卦绱河捎谀廴~葉綠素缺失而呈玉白色，最白為一芽二葉時期（賴建紅等，2016），但該品種引種至廣西南寧市后，長達4年的種植期間均未發(fā)現(xiàn)白葉現(xiàn)象?？梢姡糠植铇淦贩N在環(huán)境氣候等相差較大的不同地區(qū)生長，其葉形、葉色等重要性狀表現(xiàn)會發(fā)生改變。因此，采用傳統(tǒng)鑒別方法，即根據(jù)茶樹嫩芽、葉白化的重要性狀表現(xiàn)作為依據(jù)，將無法正確做出判斷。但通過分子標記技術可較準確鑒別是否同一品種及品種間的遺傳差異，為茶樹良種推廣和提高茶樹選育種效率提供技術保障。張羽等（2017）利用SCoT、EST-SSR和SRAP分子標記對湘波綠、金牡丹、金觀音等50多種茶樹種質資源進行親緣關系研究，其中SCoT聚類分析結果顯示，湘波綠與金牡丹親緣關系較近，與本研究聚類分析結果相近。 由于不同的分子標記所揭示的基因組位點信息不同，因此，聚類分析結果也存在一定的差異。在品種鑒別時，應采用多種分子標記方法，結果更準確。本研究只使用了15對SSR引物開展研究，有2份樣品尚未能有效完成其遺傳多態(tài)性分析，因此，后續(xù)工作將繼續(xù)篩選更多數(shù)量、合適的引物進行茶樹分子標記研究。

4 結論

廣西德?？h和隆林縣的野生古茶樹種質起源相近，與我國其他各省的名優(yōu)栽培種茶樹親緣關系較遠，存在相遠近親和相近遠親共存現(xiàn)象，進一步證實廣西德?？h野生古茶樹為五柱茶系的厚軸茶，推測桂西北山區(qū)可能有分布較廣的山茶屬原始種系。

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（責任編輯 陳 燕）