eEF2K蛋白同源模建及其抑制劑小分子的虛擬篩選研究

黎玉梅　孔研　于大永　宋昱　唐川　史麗穎

中圖分類號 R914.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）16-2199-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.08

摘 要 目的：篩選潛在的真核生物延伸因子2激酶（eEF2K）抑制劑小分子，為eEF2K抑制劑的設(shè)計和研發(fā)提供參考。方法：采用同源模建技術(shù)構(gòu)建eEF2K蛋白晶體結(jié)構(gòu)模型，并進行Loop優(yōu)化和分子動力學(xué)優(yōu)化，借助SAVES在線服務(wù)器從Verify_3D、EERAT和拉氏圖等3個方面對上述模型進行評估。收集55個eEF2K抑制劑小分子，使用Insight Ⅱ軟件以其中的28個（編號為奇數(shù)，設(shè)為訓(xùn)練集）為基礎(chǔ)構(gòu)建具有活性預(yù)測能力的Hypogen藥效團模型，以另外27個（編號為偶數(shù)，設(shè)為測試集）進行驗證，通過擬合活性[即半數(shù)抑制濃度的負對數(shù)（pIC50）]預(yù)測值與真實值并借助Ligand profiler熱圖篩選最優(yōu)藥效團模型。結(jié)合上述藥效團模型和Lipinski五規(guī)則、分子對接方法進行eEF2K抑制劑小分子的虛擬篩選。結(jié)果與結(jié)論：所建eEF2K蛋白晶體結(jié)構(gòu)模型的整體質(zhì)量因素得分為93.697，其中83.33%的氨基酸Verify_3D得分≥0.2，且位于不允許區(qū)的氨基酸占氨基酸總數(shù)的1.7%，其氨基酸構(gòu)象及骨架結(jié)構(gòu)合理，模型可靠性高。共構(gòu)建了9個具有活性預(yù)測功能的Hypogen藥效團模型（02～10號），其中03號藥效團模型包含2個氫鍵受體和2個共軛芳香環(huán)，可更好地區(qū)分活性及非活性分子，其pIC50預(yù)測值與真實值擬合最好（相關(guān)系數(shù)為0.665 3），具有較好的預(yù)測能力和較高的可靠性。通過虛擬篩選最終獲得9個潛在的eEF2K抑制劑小分子（pIC50預(yù)測值為1.074～1.185，分子與蛋白相互作用的Dcoking-score得分為-9.730～-7.467），其中Pro268、Asp267、Gln171、Phe121、Glu212可能是eEF2K抑制劑與靶點蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸，作用方式包括氫鍵、鹽橋、疏水等。上述分子有望成為eEF2K抑制劑研發(fā)的先導(dǎo)化合物。

關(guān)鍵詞 真核延伸因子2激酶;抑制劑小分子;同源模建;Hypogen藥效團;分子對接;虛擬篩選

Study on Homology Modeling of eEF2K Protein and Virtual Screening of Its Inhibitors Molecules

LI Yumei1，KONG Yan2，YU Dayong1，SONG Yu1，TANG Chuan1，SHI Liying3（1. School of Life Sciences and Technology， Dalian University， Liaoning Dalian 116622， China; 2. Dept. of Oncology， Dalian Third People’s Hospital， Liaoning Dalian 116033， China; 3. Institute of Materia Medica， Dalian University， Liaoning Dalian 116622， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To screen potential eEF2K inhibitor molecules， and to provide reference for the design and R&D of eEF2K inhibitor. METHODS： The eEF2K crystal structure model was constructed by homology modeling technique. The model was optimized by Loop optimization and molecular dynamics. With the help of SAVES online server， the above models were evaluated from three aspects such as Verify_3D， EERAT and Laplace diagram. Totally 55 eEF2K inhibitor molecules were collected. Hypogen pharmacophore model with activity prediction ability was constructed based on 28 of them （odd number， as training set） by Insight Ⅱ software and validated by other 27 （even number， as test set）. The optimal pharmacophore model was screened by fitting the predicted and experimental values of activity [i.e. negative logarithm of half inhibitory concentration （pIC50）] and using Ligand profiler thermogram. The virtual screening of small molecules of eEF2K inhibitors was carried out by combining the above pharmacophore model， Lipinski’s five rules and molecular docking method. RESULTS & CONCLUSIONS： The overall quality factor score of the crystal structure model of eEF2K protein was 93.697. Among them， 83.33% of the amino acid Verify_3D score was more than or equal to 0.2， and 1.7% of the total amino acids were located in the non-permissible region. The amino acid conformation and skeleton structure of the model were reasonable and the reliability of the model was high. Totally 9 Hypogen pharmacophore models （No. 02-10） with active predictive function were constructed， among which No. 03 pharmacophore model included 2 hydrogen bond receptors and 2 conjugated aromatic rings， which could better distinguish active and inactive molecules. The predicted value of pIC50 fitted the experimental value best （the correlation coefficient was 0.665 3）， and it had good predictive ability and high reliability. Finally， 9 potential eEF2K inhibitor molecules were obtained through virtual screening （pIC50 ranged from 1.074 to 1.185， and Dcoking-score of protein-molecule interaction ranged from -9.730 to -7.467）. Pro268， Asp267， Gln171， Phe121 and Glu212 may be the key amino acids for the interaction between eEF2K inhibitors and target proteins， including hydrogen bonds， salt bridges and hydrophobicity. These 9 molecules are expected to be the lead compounds for the development of eEF2K inhibitors.

KEYWORDS? ?eEF2K; Inhibitor molecule; Homology modeling; Hypogen pharmacophore; Molecular docking; Virtual screening

真核生物延伸因子2激酶（Eukaryotic elongation factor 2 kinase，eEF2K）又稱鈣調(diào)素依賴性真核生物延伸因子2激酶（Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ），是由人類基因組eEF2K基因編碼的一種激酶[1]。該酶在多種惡性腫瘤組織中均呈高表達，如惡性膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤、乳腺癌等[2-4]。Parmer TG等[5]檢測了不同細胞周期人乳腺癌MCF-7細胞中eEF2K的活性，發(fā)現(xiàn)S期細胞中eEF2K活性明顯增強，提示其活性高低與腫瘤細胞周期密切相關(guān)。此外，eEF2K還可參與腫瘤細胞自噬[6]、凋亡[7]、血管新生[8]、侵襲與轉(zhuǎn)移[9]等過程的調(diào)控。由此可見，作為潛在的抗癌藥物作用靶點，eEF2K在腫瘤細胞生長、增殖過程中發(fā)揮著極其重要的作用，研究與開發(fā)新型的eEF2K抑制劑具有重要的臨床意義，現(xiàn)已成為當(dāng)前抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點之一。

計算機輔助藥物設(shè)計（Computer aided drug design，CADD）是以計算化學(xué)為基礎(chǔ)，通過計算機進行模擬、計算和預(yù)測藥物與受體之間的相互關(guān)系，設(shè)計并優(yōu)化藥物先導(dǎo)化合物的藥物設(shè)計方法。該法可大大提高藥物研發(fā)的成功率，減少研究的盲目性，具有成本低、周期短等優(yōu)點，是藥物研發(fā)的重要手段之一[10]?；诮Y(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計、基于片段的藥物設(shè)計和基于配體的藥物設(shè)計是CADD的主要應(yīng)用技術(shù)，其中同源模建（Homology modeling）、分子對接（Molecular docking）和虛擬篩選（Vir- tual screening）等方法對藥物的研發(fā)意義重大。鑒于此，本研究以CADD為手段，首先通過同源模建的方法構(gòu)建了eEF2K蛋白的晶體結(jié)構(gòu)模型，以文獻報道的eEF2K抑制劑分子[11-12]為基礎(chǔ)構(gòu)建了具有活性預(yù)測能力的Hypogen藥效團模型，隨后結(jié)合該藥效團模型和類藥性五規(guī)則（Lipinski 5規(guī)則）[13]、分子對接方法篩選出潛在的eEF2K抑制劑小分子，旨在為eEF2K抑制劑的優(yōu)化設(shè)計和進一步研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 資料來源

eEF2K氨基酸序列（含725個氨基酸殘基）來源于Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）;用于同源模建的模板蛋白來源于PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）。本研究所需的55個eEF2K抑制劑小分子（編號1～55，結(jié)構(gòu)見圖1）均來源于相關(guān)文獻[11-12]，將其結(jié)構(gòu)導(dǎo)入藥物設(shè)計工具Schrodinger Suite 2017軟件，利用其中的“Ligprep”工具以“OPLC_2005”力場進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化及3D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，將結(jié)果保存為“mol2”文件格式，用于后續(xù)藥效團模型和分子對接的構(gòu)建與篩選。

2 方法

2.1 同源模建

2.1.1 模型構(gòu)建與優(yōu)化 利用美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的“BLAST”程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）進行模板搜索，采用生物分子模擬軟件Insight Ⅱ的“Align sequence to templates”模塊進行序列比對，根據(jù)比對結(jié)果進行適當(dāng)?shù)暮Y除修飾，以提高目標蛋白與模板蛋白的同源性，選擇比對結(jié)果最好（即同源性和相似性最高）[14]的作為模板蛋白。以Insight Ⅱ軟件中的“Modeller 9.2”程序進行同源模建，構(gòu)建eEF2K蛋白的三維結(jié)構(gòu)，將運算參數(shù)中的“Number of models”設(shè)置為“10”（即構(gòu)建10個蛋白模型，下同），“Optimization level”選擇“High”（即高優(yōu)化水平，下同），其余參數(shù)均選擇“缺省值”。以輸出模型的“PDF total energy”和“DOPE score”選擇最優(yōu)模型，兩者得分越低，表明模型在同源約束條件下優(yōu)化得越好、模型質(zhì)量越可靠[13]。利用Insight Ⅱ軟件“Loop refinement”模塊和“Standard dynamics cascade”模塊分別進行Loop優(yōu)化和分子動力學(xué)優(yōu)化，以消除原子間的不合理接觸。結(jié)合前期預(yù)試驗，將Loop優(yōu)化參數(shù)“Number of models”設(shè)為“10”，“Optimization level”設(shè)為“High”。分子動力學(xué)優(yōu)化時，首先賦予eEF2K蛋白“CHARMM”力場，溶劑模型選擇“隱形溶劑模型（GBSW）”;隨后使用“最陡下降法（Steepest descent method）”優(yōu)化，設(shè)置“收斂RMS參數(shù)（RMS gradient）”為“0.05（kcal/mol）·?”（1 kcal=4.186 kJ，1?=0.1 nm）、“最大迭代步數(shù)（Max iterations）”為“10 000”;最后使用“共軛梯度法”，設(shè)置“收斂RMS參數(shù)”為“0.001（kcal/mol）·?”、最大迭代步數(shù)為“100 000”，對模型的分子構(gòu)象進行進一步優(yōu)化。

2.1.2 模型評估 借助SAVES在線服務(wù)器（http：//servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/），從Verify_3D、ERRAT和拉氏圖（Ramachandran Plot）等3個方面對eEF2K蛋白模型進行評估。其中，Verify_3D用以評估模型和氨基酸一級結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，當(dāng)80%以上的氨基酸得分≥0.2即表示氨基酸側(cè)鏈構(gòu)象合理[15]。ERRAT用以計算在空間距離0.35 nm內(nèi)，不同原子類型間非鍵相互作用側(cè)鏈（包括C—C、C—N、C—O、N—N、N—O、O—O）的數(shù)量，并計算整體質(zhì)量因素（Overall quality factor）得分，若該得分>85則表明模型可靠性高[16]。拉氏圖是通過蛋白中非鍵合原子間最小接觸距離來評價兩個相鄰肽單位骨架構(gòu)象的合理性，并以此表示蛋白中允許和不允許的構(gòu)象，位于不允許區(qū)的氨基酸數(shù)應(yīng)小于氨基酸總數(shù)的5%[16]。

2.2 Hypogen藥效團模型構(gòu)建

將圖1中編號為奇數(shù)的eEF2K抑制劑小分子作為訓(xùn)練集（共28個），編號為偶數(shù)的作為測試集（共27個）。利用Insight Ⅱ軟件中“3D QSAR pharmacphore generation”模塊以訓(xùn)練集分子為基礎(chǔ)構(gòu)建具有活性預(yù)測能力的Hypogen藥效團模型，擬合活性以半數(shù)抑制濃度（IC50）的負對數(shù)（pIC50）表示。設(shè)置“Minimum interfeature distance”為“1.5”、“Conformation generation”為“Best”、“Energy threshold”為“10”，其余參數(shù)為默認值，表征各分子的構(gòu)象空間，保留能量值<10 kcal/mol的分子構(gòu)象[17]，構(gòu)建Hypogen藥效團模型。所建模型通過測試集分子進行驗證，以篩選出可靠性及預(yù)測能力較好（即預(yù)測值與真實值擬合度較好，真實值來源于文獻[11-12]）的藥效團模型，模型驗證利用Insight Ⅱ軟件中的“Ligand profiler”程序進行，“Conformation generation”設(shè)為“Best”、“Energy threshold”設(shè)為“10”、“Maximum omitted features”設(shè)為“-1”以允許小分子與Hypogen藥效團特征元素部分匹配，其余參數(shù)為默認值，以Ligand profiler熱圖確定最優(yōu)藥效團模型（即可區(qū)分活性分子和非活性分子的模型）用于eEF2K抑制劑的虛擬篩選。

2.3 eEF2K抑制劑虛擬篩選

2.3.1 Hypogen藥效團篩選 從ZINC數(shù)據(jù)庫（http：//zinc.docking.org/）搜索用于虛擬篩選的小分子，并利用Lipinski 5規(guī)則進行初步篩選。篩選標準[13]：①化合物分子量<500 Da;②化合物結(jié)構(gòu)中氫鍵給體（包括羥基、氨基等）的數(shù)量不超過5個;③化合物結(jié)構(gòu)中氫鍵受體的數(shù)量不超過10個;④化合物脂水分配系數(shù)的對數(shù)值（lgP）為-5～-2;⑤化合物中可旋轉(zhuǎn)的化學(xué)鍵數(shù)不超過10個。隨后使用Insight Ⅱ軟件中“Ligand pharmacophore mapping”程序?qū)Α?.2”項下所獲Hypogen藥效團模型進行進一步篩選，并對篩選所得小分子進行活性預(yù)測。程序中“Maximum omitted features”設(shè)置為“0”、“Conformation generation”設(shè)為“Best”、“Energy threshold”設(shè)為“10”，其余參數(shù)為默認值，保留小分子所有特征與藥效團匹配其能量值均小于10 kcal/mol的構(gòu)象。

2.3.2 分子對接篩選 用于分子對接目標蛋白為同源模建所構(gòu)建的eEF2K蛋白，使用Schrodinger Suite 2017軟件中“Ligand docking”模塊對由Hypogen藥效團初步篩選所得小分子進一步篩選。通過該軟件的“Sitmap”程序?qū)δ繕说鞍鬃罹邼摿Φ幕钚晕稽c進行精確對接，以“Docking-score”得分函數(shù)值評價小分子與eEF2K蛋白的相互作用，該函數(shù)綜合考慮了氫鍵、疏水、范德華力等相互作用，其絕對值越大表明小分子與目標蛋白的對接復(fù)合物越穩(wěn)定、匹配結(jié)合作用越好[18]。

3 結(jié)果

3.1 同源模建和模型評估

3.1.1 同源模建結(jié)果 通過BLAST程序搜索得與eEF2K蛋白同源性較高的蛋白晶體5KS5、3PDT、3LKM、3LMH，其相關(guān)參數(shù)見表1（蛋白名稱后的“A”表示該晶體有一條A鏈，下同）。其中，“最大分”和“總分”均為蛋白晶體結(jié)構(gòu)評價值，兩者值越高表明晶體結(jié)構(gòu)越優(yōu);“覆蓋率”為序列覆蓋率，其值越大表明晶體結(jié)構(gòu)越優(yōu);“E”值為相似性分值遠離理論值可能性的概率，該值越低表明序列相似性越高;“I”值表示序列經(jīng)BLAST比對的同源性，其值越高表明晶體同源性越好[19]。以上述4個蛋白作為預(yù)選模板蛋白的序列比對結(jié)果見表2。經(jīng)篩除修飾后，3PDT的同源性和相似性最高，故將其作為模板蛋白進行同源模建。選取構(gòu)建的10個蛋白模型中的最優(yōu)模型（PDF total energy為1 316.46、DOPE score為-688.31）進行后續(xù)研究。

3.1.2 模型評估 Verify_3D評估結(jié)果顯示，eEF2K蛋白模型中，有83.33%的氨基酸得分≥0.2，表明模型中氨基酸側(cè)鏈構(gòu)象合理;ERRAT評估結(jié)果顯示，本模型的整體質(zhì)量因素得分為93.697，表明模型可靠性好;拉氏圖評估結(jié)果如圖2（圖中，“ ”表示位于不允許區(qū)的氨基酸）所示，本模型共分為4個區(qū)域，其中位于不允許區(qū)的氨基酸占氨基酸總數(shù)的1.7%（12/689），小于5%，表明模型骨架結(jié)構(gòu)合理。

3.2 Hypogen藥效團模型構(gòu)建結(jié)果

本研究共構(gòu)建了9個Hypogen藥效團模型（序號：02～10），進一步通過測試集分子進行模型驗證，其Ligand profiler熱圖見圖3（圖中，熱值數(shù)值越大表明對應(yīng)小分子的預(yù)測活性越高。其中，“-”表示非活性分子，“*”表示中等活性分子，“+”表示活性較高分子）。

由圖3可見，03號Hypogen藥效團模型能更好地區(qū)分活性分子和非活性分子，其預(yù)測值與真實值見表3，線性關(guān)系見圖4。由表3、圖4可見，該藥效團模型預(yù)測值與真實值相差較小，兩者相關(guān)系數(shù)（R2）為0.665 3，提示該藥效團模型具有較好的預(yù)測能力和可靠性。

03號Hypogen藥效團模型由4個部分構(gòu)成，包括2個氫鍵受體（A1、A2）和2個共軛芳香環(huán)（B1、B2），詳見圖5。

3.3 eEF2K抑制劑虛擬篩選結(jié)果

本研究從ZINC數(shù)據(jù)庫中共篩選到符合Lipinski 5規(guī)則的小分子共10萬個，選取經(jīng)03號Hypogen藥效團模型篩選出的pIC50預(yù)測值由大到小排序前500位的小分子進行分子對接，其中Docking-score得分排序前9位的小分子化合物（序號1～9）見表4（表中，“-”表示無相應(yīng)的作用方式）。由表4可見，Pro268、Asp267、Gln171、Phe121、Glu212（同一作用方式出現(xiàn)頻次較高）可能為eEF2K抑制劑小分子與靶點蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸。

以1號小分子為例，其與eEF2K的相互作用方式見圖6。由圖6可見，該小分子可與氨基酸Lys153、Thr266、Glu212、Ile215形成氫鍵，與氨基酸Tyr219、Tyr214、Met95、Ile215具有疏水作用，與氨基酸Tyr219具有Pi-cation作用。

4 討論

由于腫瘤細胞具有無限增殖的特點，需要消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，因此腫瘤細胞常處于缺乏營養(yǎng)和缺氧等條件下，此時其細胞中eEF2K的活性會增強，使得真核生物延伸因子2（Eukaryotic elongation factor 2，eEF2）的活性受到抑制，從而阻止了細胞蛋白合成過程中多肽鏈的延伸，降低了細胞對營養(yǎng)物質(zhì)及能量的消耗，協(xié)助腫瘤細胞抵抗不良環(huán)境，有助于其增殖[20]。由此可見，eEF2K可作為腫瘤治療的潛在靶點之一，但針對該靶點的抗腫瘤藥物研發(fā)尚處于初期。相較于傳統(tǒng)藥物研發(fā)方法，CADD技術(shù)能夠顯著提高藥物設(shè)計速度，降低藥物研發(fā)成本，縮短研發(fā)周期[10]。其中，虛擬篩選技術(shù)可在生物活性篩選前借助計算機技術(shù)對化合物分子進行提前篩選，以降低實際篩選化合物的數(shù)量。目前，常見的藥效團篩選方法包括基本分子共同特征藥效團模型和基于受體-配體復(fù)合物的藥效團模型等。筆者認為相較于上述兩種藥效團模型，Hypogen藥效團模型可針對具有明確活性的特定化合物分子構(gòu)建出具有活性預(yù)測能力的模型，對優(yōu)化小分子構(gòu)象具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究首次針對eEF2K蛋白，利用同源模建技術(shù)構(gòu)建蛋白模型，并從Verify_3D、ERRAT和拉式圖等3個方面對模型進行評估。本研究結(jié)果顯示，模型中有83.33%的氨基酸Verify_3D得分≥0.2，整體質(zhì)量因素評分為93.697，位于不允許區(qū)的氨基酸數(shù)占1.7%，提示本研究所建模型的氨基酸構(gòu)象及骨架結(jié)構(gòu)合理，且可靠性高。同時，本研究以eEF2K抑制劑小分子（訓(xùn)練集）為基礎(chǔ)，構(gòu)建了9個（02～10號）具有活性預(yù)測能力的Hypogen藥效團模型，并以測試集小分子進行模型驗證。結(jié)果顯示，03號藥效團模型包括2個氫鍵受體（A1、A2）和2個共軛芳香環(huán)（B1、B2），其pIC50的預(yù)測值與真實值擬合較好，R 2為0.665 3，具有較好的預(yù)測能力和可靠性。本研究進一步通過03號藥效團和分子對接方法對符合Lipinski 5規(guī)則的10萬個小分子進行虛擬篩選，共得到9個抑制劑小分子，其中Pro268、Asp267、Gln171、Phe121、Glu212可能是eEF2K抑制劑與靶點蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸;這9個小分子可作為eEF2K抑制劑研發(fā)的先導(dǎo)化合物。

綜上所述，本研究構(gòu)建了可靠的eEF2K蛋白模型，該模型可用于eEF2K蛋白分子對接、虛擬篩選等分子模擬方面的研究。本課題組后續(xù)將對本研究所得的9個小分子進行結(jié)構(gòu)修飾，并對其eEF2K活性抑制作用進行驗證和量效關(guān)系研究，以期獲得高活性的eEF2K抑制劑。

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（收稿日期：2018-12-27 修回日期：2019-06-11）

（編輯：張元媛）