蜜蜂蜂毒涂膜劑經(jīng)皮給藥的安全性評(píng)價(jià)

高源　朱鳳　楊志斌　張成桂　趙海榮　巫秀美　李玥　劉衡

中圖分類號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）16-2181-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.05

摘 要 目的：考察蜜蜂蜂毒（BV）涂膜劑經(jīng)皮給藥的急性毒性、長期毒性、皮膚刺激性及過敏性反應(yīng)，以評(píng)價(jià)該涂膜劑的臨床前安全性。方法：以大鼠為研究對(duì)象，按BV涂膜劑高、中、低劑量（144、96、48 mg/kg）給藥，進(jìn)行急性毒性考察;按BV涂膜劑高、中、低劑量（72、48、24 mg/kg）連續(xù)給藥28 d，進(jìn)行長期毒性考察。以家兔為研究對(duì)象，采用同體左右側(cè)自身對(duì)照法，按BV涂膜劑8 mg/kg劑量給藥，進(jìn)行完整皮膚和破損皮膚的刺激性考察。以豚鼠為研究對(duì)象，在其左側(cè)背部按BV涂膜劑15 mg/kg（第0、7、14天各1次）致敏給藥，右側(cè)背部按BV涂膜劑15 mg/kg激發(fā)給藥，進(jìn)行皮膚過敏性考察。結(jié)果：BV涂膜劑經(jīng)皮給藥急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠臟器外觀、臟器指數(shù)及體質(zhì)量均無異常變化，未見明顯全身毒性反應(yīng)。長期毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，末次給藥24 h后，除BV涂膜劑低劑量組大鼠脾臟指數(shù)，BV涂膜劑中劑量組大鼠睪丸指數(shù)以及BV涂膜劑高、中劑量組大鼠附睪指數(shù)均顯著升高，BV涂膜劑中、低劑量組大鼠血漿中PT顯著延長外（P<0.05），大鼠臟器外觀及其余臟器指數(shù)、凝血指標(biāo)、血液生化指標(biāo)均無異常變化;2周恢復(fù)期結(jié)束后，上述指標(biāo)均恢復(fù)正常。皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，部分家兔皮膚出現(xiàn)輕微紅斑或明顯的結(jié)痂現(xiàn)象，BV涂膜劑對(duì)家兔完整或破損皮膚均有輕度刺激性。皮膚過敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，部分豚鼠皮膚出現(xiàn)輕微紅斑，BV涂膜劑對(duì)豚鼠皮膚有輕度致敏性。結(jié)論：BV涂膜劑經(jīng)皮給藥未表現(xiàn)出急性毒性或長期毒性，僅對(duì)皮膚具有輕度刺激性和致敏性，表明該涂膜劑在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)安全性良好。

關(guān)鍵詞 蜜蜂蜂毒;涂膜劑;經(jīng)皮給藥;急性毒性;長期毒性;刺激性;過敏性

Safety Evaluation of Bee Venom Plastics with Transdermal Administration

GAO Yuan1，2，ZHU Feng1，2，YANG Zhibin1，2，3，ZHANG Chenggui1，2，3，ZHAO Hairong1，2，3，WU Xiumei1，2，3，LI Yue1，2，3，LIU Heng1，2，3（1. National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics， Dali University， Yunnan Dali 671000， China; 2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D， Dali University， Yunnan Dali 671000， China; 3. Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Ento- moceutics， Dali University， Yunnan Dali 671000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the acute toxicity， long-term toxicity， skin irritation and anaphylaxis of Bee venom （BV） plastics， and to evaluate its preclinical safety. METHODS： The acute toxicity of BV plastics to rats was investigated after administration of high-dose， medium-dose and low-dose （144， 96， 48 mg/kg） of BV plastics. The long-term toxicity of BV plastics was investigated by continuous administration of high-dose， medium-dose and low-dose （72， 48， 24 mg/kg） of BV plastics for 28 days. The irritation of intact and damaged skin in rabbits with 8 mg/kg BV plastics was investigated by using the self-control method of left and right homologous body. The skin anaphylaxis of guinea pig were investigated after sensitized with 15 mg/kg BV plastics on the left back （on 0， 7th， 14th day） and stimulated with 15 mg/kg BV plastics on the right back. RESULTS： During the acute toxicity experiment with BV plastic，the weight of rats and the changes of viscera were normal，and there was no relevant toxic reaction. Long-term toxicity test results showed that no significant pathological changes were observed at 24 h after the last administration; the spleen index? of rats in BV low-dose group， testicular index in middle-dose group and epididymis index in high-dose and middle-dose groups were significantly increased， while PT in plasma of rats in BV medium-dose and low-dose groups was significantly prolonged （P<0.05）. There were no abnormal changes in organ appearance， other organ index， coagulation index and blood biochemical index. All above indexes became normal at the end of 2-week recovery period. Skin irritation test showed that BV plastics could cause slight erythema and obvious scab on the skin of rabbits which along with little irritation on intact or damaged skin. Skin anaphylaxis test showed that BV plastics produced mild erythema in the skin of guinea pigs， belonging to light allergy. CONCLUSIONS： No acute or long-term toxicity is observed after transdermal administration of BV plastics， which is safe and only causes mild irritation and irritability to skin， indicating there is good safety of the plastic under experiment doses.

KEYWORDS? ?Bee venom; Plastics; Transdermal administration; Acute toxicity; Long-term toxicity; Irritation; Anaphylaxis

蜜蜂蜂毒（Bee venom，BV）為蜜蜂科動(dòng)物中華蜜蜂（Apiscerana Fabricius）等的工蜂尾部螫刺腺體中排出的毒液[1]，具有祛風(fēng)除濕、止痛等功效[2]。BV是一種毒性很強(qiáng)的毒素，但同時(shí)又是一種從古至今應(yīng)用廣泛的天然藥物，具有抗炎[3]、鎮(zhèn)痛[4]、抗腫瘤[5]等多種藥理活性。多項(xiàng)研究表明，其在體內(nèi)外均能明顯延長血液凝固時(shí)間，改善微循環(huán)、溶栓等，具有活血化瘀的作用[6-8]。

目前，BV已上市的劑型主要為注射液，主要用于治療風(fēng)濕性或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、周圍神經(jīng)炎及神經(jīng)痛等，在獲得顯著臨床療效的同時(shí)也有關(guān)于其注射用藥后出現(xiàn)不同程度過敏現(xiàn)象及溶血毒性的報(bào)道，嚴(yán)重者還會(huì)出現(xiàn)如過敏性休克[9-12]等，故后來逐步被蜂針療法替代。蜂針療法是一種用蜜蜂或其他蜂類的螫器官作為針具，對(duì)人體相關(guān)穴位進(jìn)行針刺的治療方法[13]。蜂針療法集針、灸、藥為一身，操作簡單，療效顯著，可有效治療強(qiáng)直性脊柱炎[13]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[14]、中風(fēng)后偏癱[15]等。但由于蜂針刺破皮膚后，毒素經(jīng)血管和淋巴管吸收，極易引起過敏反應(yīng)[16]，這也是近年來蜂針療法未能在臨床治療中廣泛應(yīng)用的主要原因。

因此，為改善蜂毒注射或蜂針療法所引起的過敏反應(yīng)，本課題組研發(fā)了BV新型制劑——涂膜劑。該涂膜劑不僅制備工藝簡單，且使用后可在用藥部位形成藥膜以保護(hù)創(chuàng)面，具有使用舒適、刺激性小等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有發(fā)展前途的劑型[17]。為驗(yàn)證BV涂膜劑的毒性反應(yīng)和過敏反應(yīng)，本課題組對(duì)其經(jīng)皮給藥的急性毒性、長期毒性、皮膚刺激性及過敏性進(jìn)行考察，為評(píng)價(jià)該制劑臨床用藥的安全性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AE240型精密電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];TL-16R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海市離心機(jī)械研究所）;CA-510型全自動(dòng)血凝分析儀（日本SYSMEX株式會(huì)社）;xfa600型全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（南昌市銘志誠商貿(mào)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

BV原料藥[藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心（云南），批號(hào)：20151020;采用高效液相色譜法測得純度大于98%];涂膜劑空白基質(zhì)由本課題組自制（稱取聚乙烯醇-124 1.0 g，加水6.25 g，稱定質(zhì)量，室溫溶脹24 h后，于85 ℃水浴加熱2 h并不斷攪拌，使之混勻溶脹成凝膠狀，然后冷卻至室溫，加水補(bǔ)足減失質(zhì)量;另稱取95%乙醇1.875 g，依次加入0.625 g甘油、0.002 5 g聚山梨酯80、0.002 5 g氮酮，攪拌均勻;將上述后一種溶液緩慢加入前一種溶液中，攪拌均勻，即得）;2，4-二硝基氯苯（DNCB，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：201208071）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量250～300 g;家兔，普通級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量1.8～2.0 kg，均由湖南萊斯克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。白色成年豚鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量250～350 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物使用合格證號(hào)：SYXK（滇）2018-0002。所有動(dòng)物均在光照明/暗12 h交替、溫度20～26 ℃、相對(duì)濕度40%～70%的條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)一定時(shí)間，自由取食專用標(biāo)準(zhǔn)飼料、純凈水;豚鼠單籠飼養(yǎng)，每天補(bǔ)充適量維生素C。本研究動(dòng)物處置方法均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求。

2 方法

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)要求[18]，取大鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、空白基質(zhì)組和BV涂膜劑高、中、低劑量組[144、96、48 mg/kg（以主藥BV計(jì)算）;給藥劑量根據(jù)本課題組前期研究摸索所得BV有效劑量1.67 mg/kg[19]的約90、60、30倍制定），每組12只。于實(shí)驗(yàn)前一天使用脫毛膏脫去大鼠眼角至耳朵部位兩側(cè)的皮毛，作為給藥部位。BV涂膜劑高、中、低劑量組大鼠分別涂抹質(zhì)量濃度為20 mg/mL的BV涂膜劑（將BV原料藥與涂膜劑空白基質(zhì)混勻即得，下同）3、2、1次，單次給藥體積為600 μL，兩側(cè)給藥面積均為4 cm×4 cm，末次給藥24 h后洗去殘留藥物;空白基質(zhì)組大鼠同法涂抹涂膜劑空白基質(zhì);正常對(duì)照組大鼠不作任何處理。給藥期間和給藥完畢（即洗去藥物）后，每天觀察并記錄大鼠狀態(tài)、毛發(fā)光澤、行為活動(dòng)、死亡情況等;分別于給藥前（第0天）和給藥完畢后第7、14天稱量并記錄大鼠體質(zhì)量。給藥完畢后第14天，各組大鼠進(jìn)行大體解剖學(xué)檢查，觀察心、肝、脾、肺、腎、胸腺、腎上腺、腦、睪丸、附睪等臟器的外觀變化，稱量臟器質(zhì)量并計(jì)算臟器指數(shù)[臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）]。

2.2 長期毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)長期毒性實(shí)驗(yàn)要求[20]，取大鼠64只，隨機(jī)分為空白基質(zhì)組和BV涂膜劑高、中、低劑量組（72、48、24 mg/kg;給藥劑量根據(jù)BV有效劑量的約44、22、11倍制定），每組16只。按“2.1”項(xiàng)下方法對(duì)大鼠眼角至耳朵部位進(jìn)行脫毛處理，并按同樣方法涂抹涂膜劑空白基質(zhì)或質(zhì)量濃度為20 mg/mL的BV涂膜劑300 μL，連續(xù)給藥28 d。末次給藥24 h后，各組大鼠均取10只進(jìn)行大體解剖，并觀察心、肝、脾、肺、腎、胸腺、腎上腺、腦、睪丸、附睪等臟器的外觀變化，計(jì)算臟器指數(shù);同時(shí)，采用全自動(dòng)血凝分析儀檢測大鼠活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶原時(shí)間（PT）、凝血酶時(shí)間（TT）、纖維蛋白原（FIB）、纖維蛋白降解物（FDP）和D-二聚體（D-Dimer）等凝血指標(biāo)，采用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測大鼠白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）等血液生化指標(biāo)。各組剩余的共24只大鼠在給藥結(jié)束后繼續(xù)恢復(fù)性觀察2周，在恢復(fù)期結(jié)束后全部剖殺，并同法觀察及檢測上述指標(biāo)。

2.3 皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)要求[21]，取家兔8只，隨機(jī)分為完整皮膚組和破損皮膚組，每組4只。破損皮膚組家兔于首次給藥前，使用無菌注射器針頭劃傷給藥部位（即左右背部皮膚脫毛區(qū)）的表皮，以不傷真皮、有輕度滲血為度。兩組家兔均采用同體左右側(cè)自身對(duì)照法給藥，右側(cè)去毛部位涂抹質(zhì)量濃度為15.6 mg/mL的BV涂膜劑0.5 mL（相當(dāng)于主藥BV 8 mg/kg;劑量根據(jù)大鼠有效劑量的約5倍換算制定），左側(cè)去毛部位則涂抹相同體積的涂膜劑空白基質(zhì)作為對(duì)照，給藥面積均為3 cm×3 cm。連續(xù)給藥7 d，每天1次，末次給藥24 h后洗去殘留藥物。分別于洗去藥物后第1、24、48、72 h時(shí)，觀察并記錄給藥部位有無紅斑和水腫等情況，按照皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[22]進(jìn)行評(píng)分：皮膚出現(xiàn)紅斑或焦痂時(shí)按無、極輕微、清晰、中度、重度各記0、1、2、3、4分;出現(xiàn)水腫時(shí)按無、輕度、清晰、中度、重度各記0、1、2、3、4分。按公式計(jì)算刺激性反應(yīng)平均得分[（各時(shí)間點(diǎn)紅斑形成總評(píng)分+各時(shí)間點(diǎn)水腫形成總評(píng)分）/受試動(dòng)物總數(shù)]。按平均得分判定皮膚刺激性[22]：0～0.49分為無刺激性，0.50～2.99分為輕度刺激性，3.00～5.99分為中度刺激性，6.00～8.00分為強(qiáng)刺激性。同時(shí)，記錄家兔體質(zhì)量變化、死亡情況，觀察其口腔黏膜、眼瞼及眼球是否出現(xiàn)異常情況，以及是否出現(xiàn)咳嗽、噴嚏、流涎、流鼻涕、流淚等行為或體征異常。

2.4 皮膚過敏性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)皮膚過敏性實(shí)驗(yàn)要求[21]，取豚鼠24只，隨機(jī)分為空白基質(zhì)組、陽性對(duì)照組（DNCB）和BV涂膜劑組，每組8只。豚鼠背部兩側(cè)去毛，面積均為3 cm×3 cm，左側(cè)用于致敏給藥，右側(cè)用于激發(fā)給藥。分別在各組豚鼠左側(cè)脫毛區(qū)涂抹涂膜劑空白基質(zhì)、DNCB的1%丙酮溶液0.2 mL和質(zhì)量濃度為100 mg/mL的BV涂膜劑0.12 mL（相當(dāng)于主藥BV 15 mg/kg;劑量根據(jù)大鼠有效劑量的約10倍換算制定），6 h后洗去殘留藥物，并于第7、14天時(shí)以同樣的方法重復(fù)上述給藥過程進(jìn)行致敏。于末次致敏給藥后第14天時(shí)，在右側(cè)脫毛區(qū)按上述方法給藥1次進(jìn)行激發(fā)。激發(fā)給藥6 h后洗去殘留藥物，于洗去藥物后即刻（0 h）和第24、48、72 h時(shí)分別觀察皮膚過敏反應(yīng)。按皮膚過敏反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[22]進(jìn)行評(píng)分：皮膚出現(xiàn)紅斑或水腫時(shí)按無、輕度、中度、重度各記0、1、2、3 分，出現(xiàn)水腫性紅斑時(shí)記4分。按公式計(jì)算皮膚過敏反應(yīng)平均得分[（紅斑形成總分+水腫形成總分）/受試動(dòng)物總數(shù)]和過敏發(fā)生率[出現(xiàn)皮膚紅斑或（/和）水腫的動(dòng)物例數(shù)（不論程度輕重）/受試動(dòng)物總數(shù)×100%]。按過敏發(fā)生率判定皮膚致敏性[23]：過敏發(fā)生率為 0～8%、9%～28%、29%～64%、85%～80%、81%～100%分別表示較弱、輕度、中度、重度、極度致敏性。同時(shí)，觀察豚鼠是否出現(xiàn)哮喘、站立不穩(wěn)或休克等嚴(yán)重的全身變態(tài)反應(yīng)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2007軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于正態(tài)分布的計(jì)量資料進(jìn)行方差分析，若方差齊，則采用Dunnet’s檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較;對(duì)于非正態(tài)分布的計(jì)量資料和經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后方差仍不齊的計(jì)量資料，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)如秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析;對(duì)于計(jì)數(shù)資料，采用χ 2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。PT、APTT、TT水平采用中位數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±D）表示，臟器指數(shù)及FIB、FDP、D-Dimer水平采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 大鼠一般情況及全身毒性反應(yīng)發(fā)生情況 給藥后，BV涂膜劑各劑量組大鼠的活動(dòng)程度降低，給藥部位在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)不同程度的腫大，BV涂膜劑高劑量組個(gè)別大鼠出現(xiàn)輕微的腹式呼吸;洗去藥物后，大鼠給藥部位腫脹程度有所減輕，且約在6 h后完全消失，48 h后腹式呼吸完全消失，基本恢復(fù)正常狀態(tài)。正常對(duì)照組和空白基質(zhì)組大鼠在此過程中均未觀察到異?，F(xiàn)象。給藥完畢后觀察14 d，結(jié)果全部大鼠均存活，BV涂膜劑各劑量組大鼠體質(zhì)量變化與空白基質(zhì)組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果見表1。

3.1.2 臟器外觀變化及臟器指數(shù) 與正常對(duì)照組比較，空白基質(zhì)組和BV涂膜劑各劑量組大鼠的各臟器外觀均無明顯異常病變;與空白基質(zhì)組比較，BV涂膜劑各劑量組大鼠的各臟器指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果見表2。

3.2 大鼠長期毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 臟器外觀變化及臟器指數(shù) 在末次給藥24 h后及恢復(fù)期結(jié)束后，經(jīng)解剖觀察可見，BV涂膜劑各劑量組大鼠臟器均未見明顯病變。在末次給藥24 h后，與空白基質(zhì)組比較，BV涂膜劑低劑量組大鼠的脾臟指數(shù)，BV涂膜劑中劑量組大鼠的睪丸指數(shù)，BV涂膜劑高、中劑量組大鼠的附睪指數(shù)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;BV涂膜劑各劑量組大鼠的胸腺指數(shù)雖有升高的趨勢，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;其他臟器指數(shù)未出現(xiàn)明顯變化，結(jié)果見表3?；謴?fù)性觀察2周后，BV涂膜劑各劑量組大鼠臟器指數(shù)與空白基質(zhì)組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果見表4。

3.2.2 凝血指標(biāo) 末次給藥24 h后，與空白基質(zhì)組比較，BV涂膜劑中、低劑量組大鼠血漿中PT顯著延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余指標(biāo)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果見表5。2周恢復(fù)期結(jié)束后，與空白基質(zhì)組比較，BV涂膜劑各劑量組大鼠的各指標(biāo)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果見表6（注：表5、表6中PT、APTT、TT水平用M±D表示;FIB、FDP、D-Dimer水平用x±s表示）。

3.2.3 血液生化指標(biāo) 末次給藥24 h后及2周恢復(fù)期結(jié)束后，與空白基質(zhì)組比較，BV涂膜劑各劑量組大鼠血液生化指標(biāo)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果見表7、表8。

3.3 家兔皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

給藥期間，各組家兔均存活，體質(zhì)量平穩(wěn)增長;結(jié)膜、口腔黏膜和氣道黏膜未見有分泌物、充血、紫紺、黃疸等現(xiàn)象;未見眼瞼下垂，眼球突出、震顫和混濁現(xiàn)象;未見咳嗽、噴嚏、流涎、流鼻涕、流淚等現(xiàn)象，呼吸平穩(wěn);行為、動(dòng)作和肌肉張力等均未見異常表現(xiàn)，飲食、大小便也未見異常。

給藥3 d后，完整皮膚組部分家兔BV涂膜劑側(cè)出現(xiàn)輕微紅斑，皮膚破損組部分家兔BV涂膜劑側(cè)出現(xiàn)明顯的結(jié)痂現(xiàn)象，兩組家兔BV涂膜劑側(cè)均未見紅腫現(xiàn)象，提示BV涂膜劑對(duì)家兔的完整皮膚和破損皮膚均有輕度刺激性，結(jié)果見表9、表10。在去除藥物后1、24、48、72 h時(shí)，兩組家兔涂膜劑側(cè)皮膚的紅斑情況較連續(xù)給藥結(jié)束時(shí)明顯減輕，僅1只家兔皮膚恢復(fù)較慢，并伴有色素沉著、皮膚粗糙及出血點(diǎn)等情況。

3.4 豚鼠皮膚過敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

給藥期間，3組豚鼠均未出現(xiàn)哮喘、站立不穩(wěn)或休克等嚴(yán)重的全身變態(tài)反應(yīng)?？瞻谆|(zhì)組豚鼠給藥部位皮膚均未見紅斑及水腫現(xiàn)象;陽性對(duì)照組豚鼠給藥部位皮膚均出現(xiàn)明顯紅斑或水腫;BV涂膜劑組有3只豚鼠皮膚即刻產(chǎn)生輕微紅斑，其中2只豚鼠的紅斑在24 h內(nèi)消失，1只豚鼠的紅斑在72 h仍未消失，但均未發(fā)生水腫現(xiàn)象，提示BV涂膜劑對(duì)皮膚具有輕度致敏性，結(jié)果見表11。

4 討論

皮膚是人體的天然屏障，也是人體主要的排泄器官，對(duì)人體具有重要的保護(hù)作用。皮膚是藥物吸收的重要系統(tǒng)之一，當(dāng)藥物經(jīng)皮膚進(jìn)入血液循環(huán)時(shí)，可避免消化道內(nèi)消化酶的破壞及肝臟的首關(guān)效應(yīng)，在不會(huì)引起胃腸道反應(yīng)的同時(shí)，還能直接作用于靶部位發(fā)揮療效[24]。涂膜劑是藥物與成膜材料制成的供外用涂抹，可形成薄膜的局部液體制劑[25]，相較于注射劑和傳統(tǒng)中藥膏劑、巴布劑等，其具有體積小、使用方便等優(yōu)勢。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，BV在體內(nèi)外均具有抗血栓活性[26]，且在溶栓[27]和治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[16]、中風(fēng)[25]等方面效果顯著。為減輕蜂毒注射液等制劑的不良反應(yīng)、改善患者順應(yīng)性，本課題組基于傳統(tǒng)蜂針療法理念研制BV涂膜劑，旨在使其具備以下優(yōu)勢：（1）避免藥物在胃腸道及肝的首關(guān)效應(yīng);（2）維持恒定的血藥濃度或藥理效應(yīng)，增強(qiáng)治療效果;（3）減少副作用，降低毒性，患者若有不適感隨時(shí)可將膜撕去，且短期內(nèi)即可恢復(fù)正常;（4）延長作用時(shí)間，減少用藥次數(shù);（5）患者可自主用藥，增加用藥順應(yīng)性。

基于此，本研究采用BV涂膜劑經(jīng)皮給藥，對(duì)其安全性進(jìn)行考察。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予BV涂膜劑后，大鼠體質(zhì)量及臟器均無異常變化，且未出現(xiàn)相關(guān)毒性反應(yīng)。長期毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)給藥28 d，與空白基質(zhì)組比較，除BV涂膜劑低劑量組大鼠脾臟指數(shù)，中劑量組大鼠睪丸指數(shù)以及高、中劑量組大鼠附睪指數(shù)顯著增加外（P<0.05），其余臟器指數(shù)未見顯著差異。同時(shí)，為了解毒性反應(yīng)的可逆程度和可能出現(xiàn)的延遲性毒性反應(yīng)，在長期給藥完畢后2周恢復(fù)期間觀察發(fā)現(xiàn)，大鼠各臟器指數(shù)均恢復(fù)正常，且未見明顯的外觀異常變化。此外，大鼠凝血指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，與空白基質(zhì)組比較，BV涂膜劑高、中劑量組大鼠血漿PT顯著延長（P<0.05），提示其正常凝血功能受影響，但給藥完畢后觀察2周后上述凝血指標(biāo)即恢復(fù)正常;其余凝血指標(biāo)及血液生化指標(biāo)均未見異常變化。該結(jié)果也提示BV涂膜劑可能具有抗凝作用，可為新型抗凝藥物的研發(fā)提供新思路。急性毒性實(shí)驗(yàn)和長期毒性實(shí)驗(yàn)均表明BV涂膜劑經(jīng)皮給藥基本無毒。皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BV涂膜劑經(jīng)皮給藥雖可引起家兔完整皮膚和破損皮膚出現(xiàn)輕微的紅斑，但只有輕度的皮膚刺激性，且隨時(shí)間延長該刺激性逐漸減弱。皮膚過敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BV涂膜劑激發(fā)出了豚鼠過敏反應(yīng)，過敏發(fā)生率為12.5%，表明其對(duì)豚鼠皮膚有弱致敏性。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，各組無一動(dòng)物死亡，表明BV涂膜劑以上述劑量經(jīng)皮給藥基本無毒，安全范圍大，為臨床開發(fā)BV新劑型及臨床安全用藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，BV涂膜劑經(jīng)皮給藥在一定劑量范圍內(nèi)無毒性，其產(chǎn)生的皮膚過敏性和刺激性反應(yīng)均較弱，且容易恢復(fù)，基本符合臨床前安全性要求。

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（收稿日期：2019-02-21 修回日期：2019-07-05）

（編輯：段思怡）