基于Cav—1/NF—κB通路探討調(diào)脾護(hù)心方抗動脈粥樣硬化的作用機(jī)制

林潼 石礎(chǔ)碩 孫治中 紀(jì)樹亮 溫俊茂 陳乾英 孫偉鵬 張?zhí)?周小琦 李俊哲

中圖分類號 R285.5；R-332 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）02-0165-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.05

摘 要 目的：研究調(diào)脾護(hù)心方對載脂蛋白基因敲除（ApoE-/-）小鼠動脈粥樣硬化（AS）的影響，并探討其作用機(jī)制。方法：將40只雄性ApoE-/-小鼠分為空白組、模型組、辛伐他汀組（陽性對照，5 mg/kg）以及調(diào)脾護(hù)心方低、高劑量組（50、150 mg/kg），每組8只。除空白組小鼠給予普通飼料外，其余各組小鼠均給予高脂飼料以復(fù)制AS模型。造模后，各給藥組小鼠均灌胃相應(yīng)藥物，空白組和模型組小鼠均灌胃等容生理鹽水，每天1次，連續(xù)12周。末次給藥后，采用分光光度法檢測各組小鼠血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，采用硝酸酶還原法檢測血清一氧化氮（NO）水平；采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清白細(xì)胞介素6（IL-6）、血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）水平；分離胸主動脈，以蘇木精-伊紅染色，觀察各組小鼠胸主動脈斑塊形成情況，并計算校正斑塊面積；采用蛋白質(zhì)印跡法檢測各組小鼠胸主動脈組織中核因子κB（NF-κB）p65、小窩蛋白1（Cav-1）、一氧化氮合酶（eNOS）蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C、IL-6、VCAM-1水平均顯著升高，HDL-C、NO水平均顯著下降（P<0.01）；胸主動脈斑塊明顯，校正斑塊面積顯著增大（P<0.01），該組織中NF-κB p65、Cav-1蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高，eNOS蛋白的相對表達(dá)量顯著下降（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平以及辛伐他汀組和調(diào)脾護(hù)心方高劑量組小鼠血清IL-6、VCAM-1水平均顯著下降，各給藥組小鼠血清HDL-C、NO水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；各給藥組小鼠胸主動脈斑塊減少，校正斑塊面積均顯著縮?。≒<0.05或P<0.01），該組織中NF-κB p65、Cav-1蛋白的相對表達(dá)量均顯著下降，eNOS蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：調(diào)脾護(hù)心方可調(diào)節(jié)血脂水平、降低炎癥因子水平、抑制AS斑塊的形成，其機(jī)制可能與其抑制Cav-1/NF-κB通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 調(diào)脾護(hù)心方；動脈粥樣硬化；血脂水平；炎癥因子；小窩蛋白1；核因子κB；小鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of Tiaopi huxin prescription （TPHXP） on the atherosclerosis （AS） of ApoE-/- mice， and to investigate its mechanism. METHODS： Forty male ApoE-/- mice were divided into blank group， model group， simvastatin group （positive control， 5 mg/kg） and TPHXP low-dose and high-dose groups （50， 150 mg/kg）， with 8 mice in each group. Except that blank group was given common diet， other groups were given high-lipid diet to induce AS model. After modeling， administration groups were given relevant medicine intragastrically， and blank group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 12 weeks. After last medication， the serum levels of TC， TG， LDL-C and HDL-C were determined by spectrophotometry. The serum level of NO was detected by nitrate reduction method. The serum levels of IL-6 and VCAM-1 were determined by ELISA. After separating thoracic aorta， HE staining was used to observe the formation of plaque in the thoracic aorta of mice in each group， and the corrected plaque area was calculated. Western blotting was conducted to determine the expression of NF-κB p65， Cav-1 and eNOS. RESULTS： Compared with blank group， the serum levels of TC， TG， LDL-C， IL-6 and VCAM-1 were increased significantly in model group， while the levels of HDL-C and NO were decreased significantly （P<0.01）. The plaque of thoracic aorta was obvious and the corrected plaque area were increased significantly （P<0.01）. The relative expression of NF-κB p65 and Cav-1 were increased significantly， while the relative expression of eNOS was decreased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the serum levels of TC， TG and LDL-C in administration groups， the serum levels of IL-6 and VCAM-1 in simvastatin group and TPHXP high-dose group were decreased significantly， while the serum levels of HDL-C and NO were increased significantly in administration groups （P<0.05 or P<0.01）. In administration groups， the plaques of thoracic aorta were reduced and the corrected plaque area was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）； the relative expression of NF-κB p65 and Cav-1 were decreased significantly， while the relative expression of eNOS was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TPHXP can regulate the level of blood lipid， decrease the level of inflammatory factors and inhibit the formation of AS plaque， the mechanism of which may be associated with inhibiting Cav-1/NF-κB pathway.

KEYWORDS Tiaopi huxin prescription； Atherosclerosis； Blood lipid； Inflammatory factor； Cav-1； NF-κB； Mice

動脈粥樣硬化（AS）是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類身體健康[1-2]。近年來，炎癥學(xué)說的提出和建立為AS的研究指明了方向。Ross R[3]在其損傷反應(yīng)學(xué)說的基礎(chǔ)上指出，AS實為一種炎癥性疾病，炎癥始終貫穿于該癥的發(fā)生、發(fā)展和演變過程中。目前，臨床AS常規(guī)治療藥物以他汀類為主，其能顯著降低患者心血管事件的發(fā)生率，是臨床防治這類疾病的重要藥物。然而現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，長期使用他汀類藥物可能會增加肝酶升高和肌病發(fā)生的風(fēng)險，導(dǎo)致AS患者的治療效果欠佳[4]。臨床實踐證明，中醫(yī)藥在防治AS等疾病方面具有毒副作用小、療效顯著等優(yōu)勢，同時還可顯著降低血脂水平、減少動脈斑塊、抑制AS的進(jìn)展[5]。因此，尋求防治AS的中醫(yī)藥療法、探究中醫(yī)藥抗AS機(jī)制具有重要意義。

小窩蛋白1（Cav-1）是位于小窩上的標(biāo)志蛋白，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有樞紐作用[6]。Cav-1可通過影響內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）的活性來調(diào)控機(jī)體一氧化氮（NO）的合成，從而發(fā)揮對炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用[7]。NO是血管保護(hù)的信號分子，其可通過抑制核因子κB（NF-κB）這一炎癥相關(guān)因子的活性來抑制AS的形成[8]。由此可見，AS的形成可能與Cav-1/NF-κB這一條炎癥通路的激活有關(guān)。調(diào)脾護(hù)心方是根據(jù)鄧鐵濤教授以“心脾相關(guān)”核心理論為基礎(chǔ)所創(chuàng)制的冠心病治療經(jīng)驗方，含人參、半夏、橘紅、丹參、三七、藿香等6味藥材，具調(diào)脾護(hù)心、益氣除痰之功效[9]。該方治療AS的臨床療效較好，可有效抑制AS合并糖代謝異常患者的炎癥反應(yīng)[10]；此外，本課題組前期動物實驗表明，調(diào)脾護(hù)心方可調(diào)節(jié)載脂蛋白基因敲除（ApoE-/-）小鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能，降低其血管內(nèi)皮脂肪的堆積，提高NO水平[11]。然而調(diào)脾護(hù)心方抗AS的作用機(jī)制及相關(guān)通路尚未明確。為此，本研究擬以Cav-1/NF-κB通路為突破口，初步探討調(diào)脾護(hù)心方發(fā)揮抗AS炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制，以期為該方的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Filter Max F3型全自動酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；AU5800型全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）；402T型電泳儀（美國CBS公司）；UV-6100S型分光光度計（上海元析儀器有限公司）；AL-204型電子天平（德國Sartorius公司）；GT-10型高速離心機(jī)（北京時代北利離心機(jī)有限公司）；Ⅸ71型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；WD-9413A型凝膠成像儀（廣州深華生物技術(shù)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

調(diào)脾護(hù)心方顆粒[廣東省中醫(yī)院自制，批號：20160512，

規(guī)格：1 g（含人參0.19 g、半夏0.09 g、橘紅0.15 g、丹參0.19 g、三七0.19 g、藿香0.19 g）]；辛伐他汀片[Merck Sharp & Dohme（Australia）Pty. Ltd.，，批號：20160623，規(guī)格：20 mg]；白細(xì)胞介素6（IL-6）、血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（英國Abcam公司，批號分別為20161101、20160613）；人抗鼠NF-κB p65、Cav-1、eNOS抗體和兔抗鼠二抗（美國R&D Systems公司，批號分別為20170113、20161203、20160314、20160413）；

甘油醛-3-硫酸脫氫酶（GAPDH）抗體（內(nèi)參）、5%牛血清蛋白（BSA）封閉液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液（上海鈺博生物科技有限公司，批號分別為20170106、20161123、20161025）；免疫印跡化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（上海炎熙生物科技有限公司，批號：20161012）；血脂生化檢測試劑盒、NO（硝酸酶還原法）試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，批號分別為20160825、20160524）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物與飼料

SPF級雄性ApoE-/-小鼠40只，2月齡，體質(zhì)量20～25 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001]。高脂飼料（含3%膽固醇、1%膽鹽、10%豬油、5%蛋黃粉、81%基礎(chǔ)飼料）由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將所有ApoE-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為5組，即空白組、模型組、辛伐他汀組（陽性對照，5 mg/kg，根據(jù)小鼠體表面積按人用臨床劑量的10倍換算而得）以及調(diào)脾護(hù)心方低、高劑量組（50、150 mg/kg，參照前期預(yù)實驗結(jié)果，并根據(jù)小鼠體表面積按人用臨床劑量的5、15倍換算而得），每組8只?？瞻捉M小鼠給予普通飼料，其余各組小鼠均給予高脂飼料以復(fù)制AS模型。造模后，各給藥組小鼠均灌胃相應(yīng)藥物（以生理鹽水為溶劑），空白組和模型組小鼠均灌胃等容生理鹽水，每天1次，連續(xù)12周。

2.2 血脂以及血清NO、IL-6、VCAM-1水平檢測

末次給藥后，所有小鼠均禁食不禁水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥進(jìn)行麻醉，隨后頸椎脫臼處死小鼠，摘取眼球取血3 mL，靜置1 h后，以3 000 r/min離心10 min，取上層血清于-80 ℃保存，備用。采用分光光度法以全自動生化分析檢測各組小鼠血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平；采用硝酸酶還原法以分光光度計儀檢測血清NO水平；采用ELISA法以全自動酶標(biāo)儀檢測血清IL-6、VCAM-1的水平。上述實驗均嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書操作。

2.3 胸主動脈斑塊面積檢測

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法檢測各組小鼠胸主動脈斑塊面積。分離各組小鼠胸主動脈組織0.2 g，置于液氮中速凍保存，備用。將胸主動脈置于4%多聚甲醛/0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.2，下同）中固定，用石蠟包埋，常規(guī)切片（厚度約4 μm），經(jīng)HE染色后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察其胸主動脈斑塊形成情況，并采用Image J 1.41軟件測量斑塊面積（粥樣硬化斑塊陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)胞內(nèi)膜顯著增厚、內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂、脂質(zhì)浸潤明顯；經(jīng)HE染色后，斑塊呈紅色，且較其他部位明顯增厚），計算校正斑塊面積=（內(nèi)彈力膜圍繞面積-管腔面積）/內(nèi)彈力膜圍繞面積×100%。

2.4 胸主動脈組織中NF-κB p65、Cav-1、eNOS蛋白表達(dá)水平檢測

采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測各組小鼠胸主動脈組織中NF-κB p65、Cav-1、eNOS等蛋白的表達(dá)水平。取各組小鼠胸主動脈組織適量，研磨，以3 000 r/min離心5 min后，棄去沉淀。取上清液至聚丙烯酰胺凝膠中，恒壓電泳（電壓：90 V）3 h，轉(zhuǎn)膜，用PBS清洗4次，每次5 min，加入5%BSA封閉液適量，于37 ℃下封閉1 h，分別加入NF-κB p65、Cav-1、eNOS一抗（均為1 ∶ 1 000），于37 ℃下反應(yīng)1 h，用TBST溶液清洗3次，每次5 min；加入二抗（1 ∶ 2 000），于37 ℃下反應(yīng)1 h，用TBST溶液清洗3次，每次5 min；以ECL顯色后，置于凝膠成像儀上成像，采用Bio-1D Express 1.0圖像分析軟件檢測蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值來表示其相對表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用方差分析或t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 調(diào)脾護(hù)心方對小鼠血脂水平的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均顯著升高，HDL-C水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組和調(diào)脾護(hù)心方低、高劑量組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均顯著降低，HDL-C水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.2 調(diào)脾護(hù)心方對小鼠血清NO、IL-6、VCAM-1水平的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清NO水平顯著降低，IL-6、VCAM-1水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組和調(diào)脾護(hù)心方低、高劑量組小鼠血清NO水平均顯著升高，辛伐他汀組和調(diào)脾護(hù)心方高劑量組小鼠血清IL-6、VCAM-1水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），而調(diào)脾護(hù)心方低劑量組小鼠血清IL-6、VCAM-1水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），詳見表2。

3.3 調(diào)脾護(hù)心方對小鼠胸主動脈斑塊面積的影響

與空白組比較，模型組小鼠胸主動脈斑塊面積明顯增大，內(nèi)膜明顯增厚，且可見明顯脂質(zhì)沉積，校正斑塊面積顯著增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，辛伐他汀組和調(diào)脾護(hù)心方低、高劑量組小鼠胸主動脈脂質(zhì)沉積明顯減少，校正斑塊面積顯著縮小，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖1、表3。

3.4 調(diào)脾護(hù)心方對小鼠胸主動脈組織中NF-κB p65、Cav-1、eNOS蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠胸主動脈組織中NF-κB p65、Cav-1蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高，eNOS蛋白的相對表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，辛伐他汀組和調(diào)脾護(hù)心方低、高劑量組小鼠胸主動脈組織中NF-κB p65、Cav-1蛋白的相對表達(dá)量均顯著下降，eNOS蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表3。

4 討論

AS是指脂質(zhì)在動脈血管壁上堆積，形成粥樣硬化斑塊，從而使血管壁增厚、管腔變窄的一種慢性炎癥改變，容易導(dǎo)致心腦血管疾病的發(fā)生[12]。1999年，Ross R[3]明確提出AS是一種炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿AS的全過程。Cav-1是位于小窩上的標(biāo)志蛋白，在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起樞紐作用[6]。Cav-1通過影響eNOS的活性，來調(diào)控NO的合成，從而調(diào)節(jié)炎癥信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。NO是血管保護(hù)分子，可抑制NF-κB的活性，后者參與炎癥過程中黏附因子、炎癥因子等的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可調(diào)控VCAM-1、IL-6等的表達(dá)[9，13]。黏附因子VCAM-1在AS的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，eNOS可直接下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM-1的表達(dá)，從而減少AS斑塊的形成[14]。由此可見，若NF-κB的活性被抑制，炎癥反應(yīng)也會隨之減少，AS的進(jìn)程將得以延緩。

他汀類藥物是防治AS性心腦血管疾病的主要藥物，可調(diào)節(jié)血脂水平，延緩AS進(jìn)程，但長期使用可能會導(dǎo)致肝損害及橫紋肌溶解等不良反應(yīng)的發(fā)生[4，15]。其中，辛伐他汀能調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂，防治AS，是目前冠心病二級預(yù)防的推薦藥物之一[16]，故本研究將其作為陽性對照藥物。隨著中醫(yī)學(xué)對AS病因病機(jī)、證候分布特征、治療等認(rèn)識的不斷深入，中西醫(yī)結(jié)合防治AS逐漸成為臨床關(guān)注的熱點問題。臨床研究表明，中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)血脂水平、緩解AS患者臨床癥狀、改善其生活質(zhì)量等方面發(fā)揮著積極的作用[17]。AS屬于中醫(yī)學(xué)“痰濁”“血瘀”范疇，由內(nèi)外合邪而成，心、脾、腎功能虛損于內(nèi)，外加飲食不節(jié)、情志不舒，則氣滯血瘀，脾虛津液不能輸布，聚而生痰[18]。國醫(yī)大師鄧鐵濤教授基于“心脾相關(guān)”理論，把握冠心病“脾虛生痰，因痰致瘀”的基本病機(jī)，創(chuàng)制了調(diào)脾護(hù)心方，該方治療心系疾病時重視脾胃，強(qiáng)調(diào)調(diào)脾護(hù)心之法[9]。方中人參補(bǔ)氣健脾，養(yǎng)心通脈；丹參清熱除煩，寧心安神，二者共為君藥。半夏燥濕化痰，祛痰開竅；橘紅行氣調(diào)脾，燥濕化痰，二者共同增強(qiáng)人參益氣除痰之效，均為臣藥。藿香理氣醒脾和胃，與補(bǔ)脾養(yǎng)心之藥合用，使得補(bǔ)而不滯；三七行氣活血，祛瘀通脈，二者共為佐藥。諸藥合用，共奏健脾補(bǔ)氣、養(yǎng)心安神之功[9]。同時現(xiàn)代藥理研究證實，該方可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善血液流變、糾正自由基代謝紊亂，有助于提高AS患者的生活質(zhì)量[10]。曾有實驗研究證實，調(diào)脾護(hù)心方可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運，減少血管內(nèi)AS斑塊的形成，發(fā)揮抗AS的作用[19]。為此，本研究以ApoE-/-小鼠為研究對象，對該方抗AS的可能機(jī)制進(jìn)行了初步探討（綜合考慮前期實驗結(jié)果[11]和現(xiàn)有成本，本研究暫未設(shè)立調(diào)脾護(hù)心方中劑量組）。

本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠血脂（TC、TG、LDL-C）及炎癥因子（IL-6、VCAM-1）水平均顯著升高，HDL-C、NO水平均顯著降低，胸主動脈脂質(zhì)沉積明顯，校正斑塊面積顯著增大，其組織中NF-κB p65、Cav-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高，eNOS表達(dá)水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示小鼠具有明顯的AS癥狀及炎癥反應(yīng)，造模成功。而低、高劑量調(diào)脾護(hù)心方可顯著降低AS模型小鼠血清TC、TG、LDL-C水平，顯著升高HDL-C水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示其具有血脂調(diào)節(jié)作用。此外，低、高劑量調(diào)脾護(hù)心方亦可縮小胸主動脈斑塊面積，上調(diào)NO、eNOS蛋白的表達(dá)，抑制NF-κB p65、Cav-1蛋白的表達(dá)，降低其下游炎癥因子IL-6、VCAM-1的水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示其可通過下調(diào)Cav-1的表達(dá)、提高eNOS水平、增加NO的釋放來發(fā)揮對血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用；同時，該方可阻斷NF-κB信號通路，減少其下游炎癥因子（如IL-6、VCAM-1）的表達(dá)，抑制AS的炎癥反應(yīng)，減少斑塊的形成，進(jìn)而抑制AS的發(fā)生和進(jìn)展。

綜上所述，調(diào)脾護(hù)心方可調(diào)節(jié)血脂水平、降低炎癥因子水平、抑制AS斑塊形成，這種作用可能與其抑制Cav-1/NF-κB通路有關(guān)。但其具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及作用靶點仍有待后續(xù)研究深入探討。

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（收稿日期：2018-05-08 修回日期：2018-10-29）

（編輯：張元媛）