RFRP-3對大鼠附睪生殖功能的影響

李鳴 石博妹 張鑫 等

摘要：【目的】探究RFRP-3對大鼠附睪生殖功能的影響，為全面了解RFRP-3調(diào)控雄性動物的生殖生理功能提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^半定量RT-PCR檢測不同發(fā)育階段（20、40、60和80日齡）SD大鼠附睪中RFRP-3及其受體GPR147的表達情況;選取60日齡雄性SD大鼠，分別對其睪丸注射0（CK）、0.1、1.0和10.0 μg/d的RFRP-3，連續(xù)注射7 d，然后通過組織石蠟切片、酶活性測定、Western blotting等分別檢測不同劑量RFRP-3對SD大鼠附睪形態(tài)學、Caspase-3活性、凋亡相關(guān)蛋白（Caspase-3和Bcl-2）和自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、LC3和Atg5）表達的影響?！窘Y(jié)果】RFRP-3和GPR147在不同發(fā)育階段SD大鼠附睪中的表達水平呈波動性變化，均以60日齡的表達水平最高;不同劑量的RFRP-3均能導致SD大鼠附睪上皮細胞發(fā)生異常，使精子數(shù)量減少。與CK相比，不同劑量的RFRP-3均能極顯著增加SD大鼠附睪Caspase-3活性（P<0.01，下同），還能顯著（P<0.05，下同）或極顯著提高附睪中活化Caspase-3與完整Caspase-3的比值，有效抑制Bcl-2的表達，且呈明顯的劑量依賴關(guān)系。RFRP-3對SD大鼠附睪內(nèi)自噬標志蛋白Beclin-1、LC3-II/LC3-I和Atg5的表達出現(xiàn)相互矛盾的結(jié)果?！窘Y(jié)論】RFRP-3在雄性大鼠附睪中有表達，但對附睪活性有直接抑制作用，具體作用原理是RFRP-3能誘導附睪中總Caspase-3裂解為活性Caspase-3并下調(diào)Bcl-2表達以觸發(fā)附睪細胞凋亡，而附睪細胞的凋亡促使附睪退化及精子數(shù)量減少。

關(guān)鍵詞： 大鼠;RFRP-3;附睪;生殖功能;凋亡相關(guān)蛋白;自噬相關(guān)蛋白

中圖分類號： S865.12? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）02-0405-07

Abstract：【Objective】 In order to provide theoretical basis for a comprehensive understanding of RFRP - 3 contro-lling on reproductive physiology function of the male animals， the study analyzed the effect of RFRP-3 on reproductive function of rats epididymis. 【Method】Semi-quantitative RT-PCR was used to study the expression of RFRP-3 and its receptor GPR147 in epididymis of different day-age（20， 40， 60 and 80 day-age） SD rats. 60 day-age male SD rats were selected and testis injection of 0（CK）， 0.1， 1.0， and 10.0 μg/d RFRP-3 were conducted on them respectively for continuous 7 d. Tissue paraffin section， enzyme activity detection and Western blotting were used to measure the epididymis morphology， Caspase-3 activity and the expression of apoptosis-related protein（Caspase-3 and Bcl-2） and autophagy-related protein（Beclin-1， LC3， Atg5） of epididymis injected with different doses of RFRP-3. 【Result】The result of Semi-quantitative RT-PCR suggested that RFRP-3 and GPR147 expressed in a fluctuating way during different development stages and had the highest expression level at 60-day-old in rat epididymis.? Different doses of RFRP-3 could all induce rat epididymal cell? abnormalities and reduce sperm counts. Compared with CK， the activities of Caspase-3 in epididymis injected with different doses of RFRP-3 were extremely increased（P<0.01， the same below）. Different doses of RFRP-3 could significantly（P<0.05， the same below） or extremely increase the ratio of cleaved Caspase-3/whole-Caspase-3，? inhibit the expression of Bcl-2 protein， and presented obvious dose-dependent feature. RFRP-3 provided conflicting results on expression of autophagy marker proteins Beclin-1， LC3-II/LC3-I and Atg5 in rat epididymis. 【Conclusion】RFRP-3 expresses in male rat epididymis，but inhibit its activity directly. RFRP-3 can promote the decomposition of whole-Caspase-3 into activated-Caspase-3 and downregulate the expression of Bcl-2 protein. RFRP-3 induces epididymis apoptosis， and then leads to epididymis degradation and sperm count decrease.

Key words： rat; RFRP-3; epididymis; reproductive function; apoptosis-associated protein; autophagy-associated protein

0 引言

【研究意義】促性腺激素抑制激素（Gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH）是日本Tsutsui團隊在鵪鶉腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種C端具有RF酰胺結(jié)構(gòu)的新型神經(jīng)肽，能抑制垂體促性腺激素釋放（Tsutsui et al.，2000）。此后，在哺乳動物上也發(fā)現(xiàn)具有RF酰胺結(jié)構(gòu)的神經(jīng)肽，并將這種RF酰胺肽命名為RF相關(guān)肽（RFRP），其中RFRP-3與鳥類的GnIH生理作用一致，二者同源，G蛋白偶聯(lián)受體147（G-protein coupled receptor 147，GPR147）為RFRP-3的特異受體（Hinuma et al.，2000;Ubuka et al.，2012）。因此，從附睪水平探索RFRP-3對雄性動物生殖功能的影響，可為研究RFRP-3調(diào)控動物的生殖生理功能提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】RFRP-3是目前在下丘腦中發(fā)現(xiàn)的唯一HPG軸抑制因子，在哺乳動物中RFRP-3神經(jīng)元主要分布在下丘腦背內(nèi)側(cè)核，通過抑制促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）活性及黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）釋放，進而調(diào)控動物機體的生殖功能和性行為（Anderson et al.，2009;Ducret et al.，2009;Wu et al.，2009）。在雄性動物中，RFRP-3及其受體在豬、獼猴和敘利亞倉鼠睪丸中的表達量較高，在精原細胞、精母細胞、生精小管、支持細胞和間質(zhì)細胞中也有分布，與精子的形成密切相關(guān)（Hinuma et al.，2000;龔金秋等，2017）。發(fā)情期雌性小鼠和豬的卵巢顆粒細胞及黃體細胞中也有RFRP-3表達，提示RFRP-3與卵泡發(fā)育有關(guān)（Li et al.，2013）。附睪是雄性生殖系統(tǒng)中的重要器官，哺乳動物的精子需在附睪中經(jīng)歷一系列復雜的結(jié)構(gòu)與功能變化才能成熟并具有潛在受精能力（Martin-DeLeon，2015;Sullivan，2015;肖娟等，2018）。【本研究切入點】至今，鮮見RFRP-3與雄性動物附睪中細胞凋亡及自噬關(guān)系的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過檢測不同發(fā)育階段大鼠附睪中RFRP-3和GPR147 mRNAs的表達情況，然后通過體內(nèi)試驗檢測不同劑量RFRP-3對大鼠附睪形態(tài)學、凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達的影響，探究RFRP-3對大鼠附睪生殖功能的影響，為全面了解RFRP-3調(diào)控雄性動物的生殖生理功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

從廣西醫(yī)科大學實驗動物中心購買兩對剛性成熟的SPF級SD大鼠作為親本，在恒溫（22 ℃）干凈的條件下進行飼養(yǎng)繁殖。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Gol-den View核酸染料、DL2000 DNA Marker購自Vazyme公司，瓊脂糖凝膠購自南京生興生物技術(shù)有限公司，二甲苯、伊紅染液和蘇木素染液均購自Solarbio公司，蛋白Marker購自Thermo公司，BSA購自Sigma公司，Caspase-3活性檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，β-actin、Caspase-3、Bcl-2、Beclin-1、LC3和Atg5一抗和二抗均購自Cell Signaling Technology公司。RFRP-3、GAPDH和GPR147引物均由深圳華大基因股份有限公司合成。

1. 2 半定量RT-PCR擴增

分別選取20、40、60和80日齡的SD大鼠子代作為試驗動物，每組6只。將大鼠處死后摘取雙側(cè)附睪，按照TRIzol說明提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，檢測不同日齡SD大鼠附睪中RFRP-3和GPR-147 mRNA的表達水平。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，進行適當循環(huán)（表1）;最后72 ℃延伸10 min。取10.0 μL擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。半定量RT-PCR引物及反應條件如表1所示。

1. 3 附睪石蠟組織切片制作

選取24只60日齡雄性SD大鼠，體重350±10 g/只，隨機均分為4組，對SD大鼠睪丸進行RFRP-3注射，注射劑量分別為0（CK）、0.1、1.0和10.0 μg/d，連續(xù)注射7 d。試驗第8 d處死SD大鼠并剖解摘除附睪，將一側(cè)附睪固定在中性福爾馬林中（另一側(cè)凍存用于后續(xù)試驗），固定后進行常規(guī)脫水、透明、包埋和切片（厚度約5 μm）。經(jīng)HE染色后，將切片置于光學顯微鏡下觀察附睪中各種類型細胞的形態(tài)和數(shù)量，每個樣品制作5個切片，每個切片取2個視野在400倍鏡下進行觀察。

1. 4 Caspase-3活性測定

取注射不同劑量RFRP-3的附睪樣品約50 μg，按Caspase-3活性檢測試劑盒說明，用酶標儀（λ=405 nm）測定各組樣品的吸光度，通過計算OD試驗/ODCK的倍數(shù)確定Caspase-3活性，每組重復6次。

1. 5 凋亡和自噬相關(guān)蛋白Western blotting檢測

解凍不同劑量組的SD大鼠附睪組織樣品。取約100 μg樣品置于1.5 mL的EP管中，加入1.0 mL RIPA裂解液后勻漿裂解;裂解后4 ℃下12000 r/min離心5 min，收集沉淀;取2.0 μL蛋白樣品用分光光度計測量其濃度，其余蛋白樣品按1%比例加入FMSF后分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩８鲃┝拷M取40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、麗春紅染色、脫脂牛奶封閉后，分別孵育一抗（活化Caspase-3、完整Caspase-3、Bcl-2、Beclin-1、Atg-5和LC3抗體，稀釋比均為1∶1000）和二抗（辣根過氧化酶標記的抗羊或抗小鼠IgG，稀釋比1∶10000），加入ECL化學發(fā)光液，按時曝光，掃描膠片進行灰度分析。每組重復6次。

1. 6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，包括單因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD檢驗。

2 結(jié)果與分析

2. 1 RFRP-3和GPR147在不同日齡SD大鼠附睪中的表達情況

如圖1所示， 20、40和80日齡SD大鼠附睪內(nèi)的RFRP-3 mRNA表達水平無顯著差異（P>0.05，下同）， 60日齡SD大鼠附睪內(nèi)的RFRP-3 mRNA表達水平最高且極顯著高于其他日齡（P<0.01，下同）。GPR147在不同日齡SD大鼠附睪中的表達情況與RFRP-3一致，也表現(xiàn)為60日齡的mRNA表達水平最高，且極顯著高于20、40和80日齡，而20、40和80日齡間無顯著差異。

2. 2 RFRP-3對SD大鼠附睪組織形態(tài)的影響

與CK（圖2-A和圖2-B）相比，經(jīng)0.1和1.0 μg/d RFRP-3處理后SD大鼠附睪上皮細胞發(fā)生變性，甚至出現(xiàn)空泡化，附睪管內(nèi)精子數(shù)量減少（圖2-C、圖2-D、圖2-E和圖2-F）;經(jīng)10.0 μg/d劑量處理后SD大鼠附睪出現(xiàn)不完整的柱狀上皮，附睪管內(nèi)精子數(shù)量明顯減少（圖2-G和圖2-H）。此外，經(jīng)不同劑量的RFRP-3處理后均能引起SD大鼠附睪內(nèi)腔中多核巨細胞剝脫且呈明顯的劑量依賴關(guān)系。

2. 3 RFRP-3對SD大鼠附睪Caspase-3活性的影響

與CK相比，不同劑量的RFRP-3均能極顯著增加SD大鼠附睪Caspase-3活性，且Caspase-3活性的增加呈劑量依賴關(guān)系（圖3）。

2. 4 RFRP-3對SD大鼠附睪凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，以完整Caspase-3、活化Caspase-3、Bcl-2和β-actin為一抗時，分別在36、17、26和45 kD附近出現(xiàn)明顯的條帶（圖4-A）。經(jīng)0.1和1.0 μg/d RFRP-3處理后SD大鼠附睪中活化Caspase-3與完整Caspase-3的比值顯著高于CK處理（P<0.05，下同），而經(jīng)10.0 μg/d RFRP-3處理后其比值極顯著高于CK處理（圖4-B），說明RFRP-3能有效提高SD大鼠附睪Caspase-3活性，且呈明顯的劑量依賴關(guān)系。此外，與CK相比，經(jīng)0.1和1.0 μg/d RFRP-3處理后SD大鼠附睪中Bcl-2的相對表達量均顯著降低，而經(jīng)10.0 μg/d RFRP-3處理后Bcl-2的相對表達量極顯著降低（圖4-C），說明RFRP-3能有效抑制SD大鼠附睪中Bcl-2的表達，且這種抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。

2. 5 RFRP-3對大鼠附睪自噬相關(guān)蛋白表達的影響

Western blotting結(jié)果顯示，以Beclin-1和Atg5為一抗時，分別在60和55 kD附近顯示出單一條帶;而以LC3為一抗時在14和16 kD附近出現(xiàn)2條免疫反應條帶（圖5-A）。與CK相比，經(jīng)0.1 μg/d RFRP-3處理后SD大鼠附睪中Beclin-1的相對表達量極顯著降低，1.0 μg/d劑量組的相對表達量顯著降低，但經(jīng)10.0 μg/d RFRP-3處理后其相對表達量極顯著升高（圖5-B），即RFRP-3對SD大鼠附睪中Beclin-1的表達呈低濃度抑制高濃度促進作用。RFRP-3對SD大鼠附睪中Atg5的表達也表現(xiàn)出低濃度抑制高濃度促進作用，經(jīng)0.1 μg/d RFRP-3處理后Atg5的相對表達量較CK極顯著降低，而在1.0 μg/d劑量組中的相對表達量顯著增加，10.0 μg/d劑量組中的相對表達量極顯著增加（圖5-C）。此外，與CK相比，經(jīng)1.0和10.0 μg/d RFRP-3處理后SD大鼠附睪中LC3-II/LC3-I顯著升高（圖5-D），說明一定濃度的RFRP-3能有效提高SD大鼠附睪LC3活性。

3 討論

至今，有關(guān)GnIH/RFRP-3的研究主要集中于其表達分布。Hinuma等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠的下丘腦、眼及睪丸組織中均有RFRP-3 mRNA表達;Zhang等（2010）研究發(fā)現(xiàn)在斑馬魚的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼、卵巢和睪丸組織中均有GnIH mRNA表達。本研究也證實，RFRP-3和GPR147在不同日齡的SD大鼠附睪中均有表達。可見，GnIH/RFRP-3不僅分布在動物的中樞系統(tǒng)，在其外周組織同樣存在廣泛分布。此外，有研究表明RFRP-3和GPR147的表達情況在睪丸不同發(fā)育階段呈波動變化（Ubuka et al.，2006;Zhao et al.，2010;Anjum et al.，2014）;本研究結(jié)果也顯示60日齡SD大鼠附睪中RFRP-3和GPR147的表達水平最高，與雄性大鼠的性成熟和精子成熟期基本吻合，故推測RFRP-3在大鼠附睪精子成熟過程中發(fā)揮重要作用。

GnIH/RFRP-3可直接作用于性腺，且與動物性腺組織形態(tài)學的變化有密切關(guān)系。Ubuka等（2006）通過滲透泵將GnIH持續(xù)作用于性成熟的雄性鵪鶉，2周后發(fā)現(xiàn)GnIH呈劑量依賴性地抑制血清中的LH和睪酮分泌，同時誘導雄性鵪鶉睪丸生殖細胞凋亡，在形態(tài)學上縮小了生精小管直徑，抑制精子產(chǎn)生。Singh和Krishna（2010）在小鼠中也獲得類似的研究結(jié)論，即RFRP-3能增加異常竇腔卵泡的數(shù)量，但減少卵巢中黃體的數(shù)量。由于RFRP-3和GPR147 mRNA在大鼠附睪中均有表達，故推測RFRP-3可直接作用于大鼠附睪。根據(jù)本研究的石蠟切片觀察結(jié)果可知，不同劑量組中RFRP-3均可導致SD大鼠附睪管中的精子數(shù)量減少，與GnIH在雄性鵪鶉上的作用效果（Ubuka et al.，2006）一致，但精子數(shù)量減少的具體機理有待進一步探究。其次，經(jīng)RFRP-3處理后的SD大鼠附睪在組織形態(tài)上也發(fā)生病理變化，表現(xiàn)為0.1和1.0 μg/d劑量組SD大鼠附睪上皮細胞發(fā)生變性，甚至出現(xiàn)空泡化，10.0 μg/d劑量組的附睪出現(xiàn)不完整的柱狀上皮。此外，有研究表明RFRP-3能導致雄性小鼠生殖細胞增殖和存活標記物減少，且睪丸中凋亡標志物的產(chǎn)生增加（Anjum et al.，2014）。說明RFRP-3促使大鼠附睪退化及精子數(shù)量減少是通過誘導附睪細胞凋亡來實現(xiàn)，即RFRP-3對附睪活性具有直接的抑制作用。

本研究結(jié)果表明，RFRP-3能有效提高SD大鼠附睪Caspase-3活性，且呈明顯的劑量依賴關(guān)系，提示RFRP-3呈劑量依賴性地上調(diào)大鼠附睪細胞的凋亡水平。Caspase-3和Bcl-2的表達呈劑量依賴性下降趨勢，而活性Caspase-3的表達隨劑量的增加而增加，說明RFRP-3能誘導附睪中的Caspase-3裂解為活性Caspase-3并下調(diào)Bcl-2以觸發(fā)附睪細胞凋亡。這與Ubuka等（2006）、Anjum等（2014）的研究結(jié)果一致，表明RFRP-3導致雄性哺乳動物中的性腺和副生殖器退化與睪丸和附睪細胞凋亡有關(guān)。細胞凋亡和自噬間相互干擾控制，共同決定著細胞的命運。自噬的功能作用一方面可通過增強Caspase-3活性而加速細胞凋亡，另一方面又能延遲Caspase-3活化作為細胞延長生命的機制（Nikoletopoulou et al.，2013;Kasprowska-Li?kiewicz，2017）。本研究結(jié)果顯示，在10.0 μg/d劑量組中RFRP-3處理引起SD大鼠附睪中LC3-II/LC3-I顯著升高且附睪中Beclin-1和Atg5的表達增加，而在0.1 μg/d劑量組中Beclin-1和Atg5的表達呈下調(diào)趨勢，提示不同劑量RFRP-3引起附睪自噬標志蛋白表達出現(xiàn)相互矛盾的結(jié)果。因此，推測RFRP-3誘導的自噬可增強或抵抗細胞凋亡。

4 結(jié)論

RFRP-3在雄性大鼠附睪中有表達，但對附睪活性有直接抑制作用，具體作用原理是RFRP-3能誘導附睪中的Caspase-3裂解為活性Caspase-3并下調(diào)Bcl-2表達以觸發(fā)附睪細胞凋亡，而附睪細胞的凋亡促使附睪退化及精子數(shù)量減少。

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（責任編輯 蘭宗寶）