siRNA沉默PLK1基因?qū)侨饬黾毎飳W特性影響

范兆陽　鮮文峰　劉永喜

[摘要]目的探討小分子干擾RNA（siRNA）沉默Polo樣激酶1（PLK1）基因?qū)侨饬黾毎飳W特性的影響。方法培養(yǎng)人骨肉瘤MG`-63細胞，將其隨機分為空白組、siRNA`-對照序列組和siRNA`-PLK1組。采用實時熒光定量PCR技術檢測細胞中PLK1基因表達，Western blot法檢測細胞中PLK1蛋白表達，CCK`-8法檢測細胞增殖活性，流式細胞術檢測細胞凋亡情況，Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力。結果siRNA`-PLK1組細胞中PLK1 mRNA和蛋白相對表達量均低于空白組和siRNA`-對照序列組，差異有統(tǒng)計學意義（F=129.125、62.363，P<0.01）。與空白組和siRNA`-對照序列組相比，siRNA`-PLK1組細胞培養(yǎng)48、72和96 h時的增殖活性均降低，差異有統(tǒng)計學意義（F組間=32.021，F(xiàn)時間=357.249，F(xiàn)交互=5.755，P<0.01）。與空白組和siRNA`-對照序列組相比，siRNA`-PLK1組細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義（F=69.863，P<0.01）。siRNA`-PLK1組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均低于空白組和siRNA`-對照序列組，差異有統(tǒng)計學意義（F=28.998、34.783，P<0.01）。結論特異性沉默骨肉瘤細胞中PLK1基因表達可減少細胞增殖、增加細胞凋亡，抑制細胞侵襲、遷移能力。

[關鍵詞]骨肉瘤;Polo樣激酶1;RNA，小分子干擾;細胞生物學

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of small interfering RNA （siRNA） silencing of polo`-like kinase 1 （PLK1） on the biological characteristics of osteosarcoma cells. MethodsHuman osteosarcoma MG`-63 cells were cultured and randomly divided into blank group， siRNA`-control sequence group， and siRNA`-PLK1 group. Quantitative real`-time PCR and Wes`-tern blot were used to measure the mRNA and protein expression of PLK1 in cells; CCK`-8 assay was used to measure cell proliferation acti`-vity; flow cytometry was used to measure cell apoptosis; the Transwell method was used to measure cell migration and invasion abilities. ResultsThe siRNA`-PLK1 group had significantly lower relative mRNA and protein expression of PLK1 in cells than the blank group and the siRNA`-control sequence group （F=129.125 and 62.363，P<0.01）. Compared with the blank group and the siRNA`-control sequence group， the siRNA`-PLK1 group had significant reductions in proliferation activity at 48， 72， and 96 h of culture （Fgroup=32.021，F(xiàn)time=357.249，F(xiàn)interaction=5.755，P<0.01）. Compared with the blank group and the siRNA`-control sequence group， the siRNA`-PLK1 group had a significant increase in cell apoptosis rate （F=69.863，P<0.01）. The siRNA`-PLK1 group had significantly lower numbers of migrating cells and invasive cells than the control group and the siRNA`-control sequence group （F=28.998 and 34.783，P<0.01）. ConclusionSpecific silencing of PLK1 gene expression in osteosarcoma cells can reduce cell proliferation， increase cell apoptosis， and inhibit cell invasion and migration.

[KEY WORDS]osteosarcoma; Polo`-like kinase 1; RNA， small interfering; cell biology

骨肉瘤好發(fā)于青少年人群，惡性程度高，可早期發(fā)生轉(zhuǎn)移，復發(fā)率較高，預后多不良[1]，嚴重威脅病人生存健康。近年來，雖然臨床診療水平不斷進步，但骨肉瘤病人復發(fā)率和5年生存率并未得到明顯改善[2]。有研究指出，骨肉瘤細胞增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移能力強是影響腫瘤預后的主要因素[3]。但目前影響骨肉瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的機制尚未完全清楚。Polo樣激酶1（PLK1）是PLK家族重要成員，是一種高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞分裂、DNA損傷修復中發(fā)揮重要作用[4]。有研究指出，PLK1在多種惡性腫瘤中呈高表達，參與了腫瘤發(fā)生、進展過程[5]。本研究利用小分子干擾RNA（siRNA）技術特異性沉默人骨肉瘤MG`-63細胞系中的PLK1基因，觀察其對細胞生物學特性的影響，以期為骨肉瘤機制研究及臨床診治提供基礎資料?，F(xiàn)將結果報告如下。

1材料與方法

1.1主要材料

人骨肉瘤MG`-63細胞系購自美國ATCC公司，RPMI`-1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司，Trizol總RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術公司，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自北京方程佰金科技公司，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，PLK1及內(nèi)參引物由上海生工生物公司設計合成，siRNA`-PLK1、siRNA`-對照序列由上海吉瑪制藥技術公司設計合成，Transwell小室購自美國Millipore公司，兔抗人PLK1多克隆抗體購自美國Calbiochem公司，Annexin V`-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、流式細胞儀購自美國BD公司，凝膠電泳分析系統(tǒng)購自美國Bio`-rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組MG`-63細胞加含體積分數(shù)0.10胎牛血清的RPMI`-1640培養(yǎng)液，置于含體積分數(shù)0.05 CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%左右時傳代。取對數(shù)生長期的細胞進行轉(zhuǎn)染[6]，并將細胞分為以下3組。①空白組（A組）：不作任何處理;②siRNA`-對照序列組（B組）：轉(zhuǎn)染對照序列5′`-AAUUUGGCCGGGCCGU`-GCG`-3′;③siRNA`-PLK1組（C組）：轉(zhuǎn)染PLK1基因的siRNA序列5′`-AAGGGCGGCUUUGCCAA`-GUGC`-3′。各組轉(zhuǎn)染完成后繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24 h，完成后續(xù)實驗。

1.2.2實時熒光定量PCR技術檢測細胞中PLK1基因表達取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細胞，胰酶消化后，用裂解液裂解，按Trizol總RNA提取試劑盒說明提取總RNA，并檢測純度和濃度，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板行PCR。PLK1及內(nèi)參引物序列見表1。PCR反應條件為：95 ℃、3 min，95 ℃、40 s，58 ℃、40 s，70 ℃、40 s，循環(huán)36次。每個樣本均設6個平行復孔。用2-△△Ct法計算各組細胞中PLK1 mRNA相對表達量[7]。

1.2.3Western blot法檢測細胞中PLK1蛋白的表達取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細胞，胰酶消化后用裂解液裂解，提取細胞中總蛋白，用BCA總蛋白檢測試劑盒檢測蛋白純度和濃度。取30 μg總蛋白，行SDS`-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下用含50 g/L脫脂奶粉的TBST封閉60 min，加入一抗兔抗人PLK1多克隆抗體（稀釋比例1∶1 000），4 ℃過夜孵育，TBST洗膜3次，加入二抗，室溫下孵育120 min，TBST洗膜3次，加入ECL避光反應25 min，拍照，應用Image J圖像分析軟件對灰度值進行定量分析，獲得各組細胞中PLK1蛋白相對表達量[8]。

1.2.4CCK`-8法檢測細胞增殖活性取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細胞，消化后接種于96孔板中，將細胞密度調(diào)整為每孔2×104個，置于含體積分數(shù)0.05 CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72和96 h時，將孔板中的培養(yǎng)液去除，加入100 μL的無血清培養(yǎng)液和10 μL的CCK`-8溶液，空白組僅加入無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)37 ℃恒溫孵育120 min。用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔吸光度（A）值[9]。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細胞，胰酶消化后收集細胞，用4 ℃預冷的PBS洗滌3次，用1×緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×109/L，取100 μL細胞懸液加入流式管中，再分別加入5 μL的Annexin V`-FITC和PI，搖勻，室溫下在暗室中孵育20 min，60 min內(nèi)上機檢測[10]。

1.2.6Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力遷移能力檢測：取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細胞，消化，離心，用無血清培養(yǎng)液重懸細胞并計數(shù)，取2×104個細胞加入小室上室，將含體積分數(shù)0.20胎牛血清的RPMI`-1640培養(yǎng)液600 μL加入下室，培養(yǎng)24 h，甲醛固定，10 g/L結晶紫染色，將散落的細胞用棉簽輕輕去除，以PBS沖洗3次，拍照，于高倍鏡下隨機取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)[11`-12]。侵襲能力檢測：取50 μL的Matrigel膠平鋪于Transwell小室內(nèi)側(cè)，風干后備用;其余步驟同遷移能力檢測。

1.3統(tǒng)計學分析

使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析和LSD`-t檢驗，重復測量資料的比較采用重復測量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2期范兆陽，等. siRNA沉默PLK1基因?qū)侨饬黾毎飳W特性影響173

2結果

2.1PLK1在各組細胞中的表達

與空白組和siRNA`-對照序列組比較，siRNA`-PLK1組細胞中PLK1 mRNA和蛋白相對表達量均降低，差異有統(tǒng)計學意義（F=129.125、62.363，P<0.01）。見表2和圖1。

2.2各組細胞增殖活性比較

與空白組和siRNA`-對照序列組比較，siRNA`-PLK1組細胞培養(yǎng)48、72和96 h時的A值均降低，差異有統(tǒng)計學意義（F組間=32.021，F(xiàn)時間=357.249，F(xiàn)交互=5.755，P<0.01）。見表3。

2.3各組細胞凋亡率比較

siRNA`-PLK1組、siRNA`-對照序列組和空白組細胞凋亡率分別為（6.7±2.2）%、（6.5±0.9）%和（14.9±1.4）%，與空白組和siRNA`-對照序列組比較，siRNA`-PLK1組細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義（F=69.863，P<0.01）。

2.4各組細胞遷移和侵襲能力比較

siRNA`-PLK1組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均低于空白組和siRNA`-對照序列組，差異有統(tǒng)計學意義（F=28.998、34.783，P<0.01）。見表4。

3討論

骨肉瘤作為嚴重威脅青少年健康的常見惡性腫瘤，具有較強的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，約20%的病人在臨床確診時已出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，約50%的病人在治療過程中發(fā)生肺轉(zhuǎn)移[13`-15]。目前，骨肉瘤病人整體治療效果仍不佳，多數(shù)病人預后不良，5年生存率尚不足30%[16]。細胞異常增殖和侵襲是骨肉瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移及治療失敗的主要原因[17`-18]。PLK1作為絲/蘇氨酸激酶家族成員，在調(diào)控細胞周期、促進有絲分裂及胞質(zhì)分裂中發(fā)揮關鍵性作用[19`-20]。研究表明，多數(shù)惡性腫瘤組織中PLK1呈高表達，且與病人預后有關[21`-23]。抑制或敲除PLK1基因可促進腫瘤細胞凋亡，增加其對化療藥物的敏感性，且不會對正常細胞產(chǎn)生影響[24]。有研究表明，PLK1抑制劑可抑制骨肉瘤細胞的增殖，且PLK1蛋白水平的高表達與病人不良預后密切相關[25]。

本研究利用siRNA技術特異性下調(diào)骨肉瘤細胞中PLK1表達，結果顯示，siRNA`-PLK1組細胞中PLK1 mRNA和蛋白相對表達量均顯著降低，表明PLK1基因表達被抑制。進一步的實驗結果顯示，siRNA`-PLK1組細胞培養(yǎng)48、72和96 h時的A值均較siRNA`-對照序列組和空白組明顯降低，說明特異性抑制PLK1基因表達可有效抑制骨肉瘤細胞增殖，這與以往的有關研究結論相一致[26]。劉曉影等[27]通過建立食管鱗癌細胞裸鼠移植瘤研究顯示，下調(diào)PLK1表達可抑制移植瘤的生長。本研究結果顯示，特異性抑制骨肉瘤細胞中PLK1基因表達后，骨肉瘤細胞凋亡率顯著增加，說明抑制PLK1基因表達可促進骨肉瘤細胞凋亡。毛永歡等[28]的研究結果亦表明，靶向沉默PLK1基因可促進胰腺癌細胞凋亡。有研究表明，PLK1基因與細胞分裂關系密切，在肝癌等實體腫瘤細胞侵襲、遷移中發(fā)揮重要作用[29]。丁克云等[30]研究表明，干擾PLK1表達可抑制惡性黑素瘤細胞的侵襲，其機制可能與誘導失巢凋亡有關。本研究結果顯示，siRNA`-PLK1組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)較siRNA`-對照序列組和空白組均減少，說明PLK1基因表達與骨肉瘤細胞遷移、侵襲能力有關，提示PLK1基因可能參與了骨肉瘤細胞侵襲、遷移過程，并在此過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，沉默PLK1基因表達可抑制骨肉瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡，并且可抑制骨肉瘤細胞遷移、侵襲能力，有望為骨肉瘤臨床診療提供新的靶位。下一步我們將從分子生物學角度更加深入探討PLK1在骨肉瘤發(fā)生及進展中的作用機制。

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