Slit2促進干細胞向神經(jīng)細胞分化的作用

劉文忠　蔡靜　李軍　榮春　范磊　張海寧

[摘要]目的探究慢病毒介導分泌型糖蛋白神經(jīng)生長導向因子2（Slit2）過表達載體轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）向神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)化的作用。方法利用基因過表達技術(shù)，構(gòu)建Slit2過表達載體;慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs;利用流式細胞儀檢測BMSCs的表面蛋白，RT`-PCR和Western`-blot方法檢測空白對照組、空載體病毒組和過表達載體病毒組神經(jīng)細胞表面蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）的表達。結(jié)果第2代BMSCs表面CD44、CD29、CD34和CD45的表達率分別為60.2%、58.3%、3.4%和2.6%，慢病毒轉(zhuǎn)染效率為90%以上。空白對照組、空載體病毒組和過表達載體病毒組的GFAP、NSE mRNA和蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=9.089～13.893，P<0.05）;其中過表達載體病毒組的GFAP、NSE mRNA和蛋白相對表達量明顯高于空載體病毒組（P<0.05），空載體病毒組和空白對照組比較差異無顯著性（P>0.05）。結(jié)論Slit2過表達質(zhì)?？梢蕴岣連MSCs向神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)化的效率，為神經(jīng)損傷和脊髓損傷提供種子細胞。

[關(guān)鍵詞]神經(jīng)生長因子;骨髓;間充質(zhì)基質(zhì)細胞;神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì);磷酸丙酮酸水合酶

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the effect of lentivirus`-mediated overexpression of Slit2 on the transformation of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） into neural cells. MethodsA Slit2 overexpression vector was constructed and used to transfect BMSCs via lentivirus. Flow cytometry was used to detect surface proteins of BMSCs. RT`-PCR and Western blot were used to determine the expression of glial fibrillary acidic protein （GFAP） and neuron`-specific enolase （NSE） on the surface of neural cells in blank control group， empty lentiviral vector group， and overexpression lentiviral vector group. ResultsThe expression of CD44， CD29， CD34， and CD45 was 60.2%， 58.3%， 3.4%， and 2.6%， respectively， on the surface of the second generation BMSCs. The transfection efficiency of lentivirus was over 90%. There were significant differences in relative mRNA and protein expression of GFAP and NSE between the blank control group， the empty lentiviral vector group， and the overexpression lentiviral vector group （F=9.089-13.893，P<0.05）. The overexpression lentiviral vector group had significantly higher relative mRNA and protein expression of GFAP and NSE than the blank control group and the empty lentiviral vector group （P<0.05）， while there were no significant differences between the blank control group and the empty lentiviral vector group （P>0.05）. ConclusionThe Slit2 overexpression plasmid can promote the efficiency of the transformation of BMSCs into neural cells， which provide seed cells for nerve injury and spinal cord injury.

[KEY WORDS]nerve growth factor; bone marrow; mesenchymal stromal cells; ?glial fibrillary acidic protein; phosphopyruvate hydratase

骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）具有多向分化潛能，在特定環(huán)境下，可以分化成人體內(nèi)的各種細胞，比如軟骨細胞、骨細胞以及神經(jīng)細胞等[1`-4]。研究結(jié)果顯示，BMSCs在特定誘導條件下可以轉(zhuǎn)化成神經(jīng)細胞，進而能促進神經(jīng)損傷的修復(fù);而且BMSCs來源于病人自體，移植后可以避免排斥反應(yīng)[5];另外，BMSCs能分泌多種細胞因子，這為神經(jīng)的修復(fù)提供了一個新的思路[6]。分泌型糖蛋白神經(jīng)生長導向因子2（Slit2）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的一種軸突導向抑制因子，可控制神經(jīng)軸突分支形成以及神經(jīng)細胞遷移，能促進BMSCs向感覺神經(jīng)元分化，參與損傷神經(jīng)再生和功能修復(fù)[7`-9]。近年來，在交通事故中發(fā)生的神經(jīng)損傷和脊髓損傷比較常見，而針對神經(jīng)損傷的治療一直是臨床上的難點。本研究將Slit2過表達載體以慢病毒介導入BMSCs內(nèi)，探討慢病毒介導Slit2過表達轉(zhuǎn)染促進BMSCs向神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)化的作用，從而為臨床神經(jīng)損傷病人治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1實驗材料

胎牛血清購自Gibco公司;DMEM及2.5 g/L胰酶Trypsin購自美國Invitrogen公司;Trizol購自美國Invitrogen公司;氯仿、乙醇及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國ABI Applied Biosystems公司;Real`-time PCR儀購自美國bio`-rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1人BMSCs的分離和培養(yǎng)選取20名健康志愿者，男8例，女12例，年齡為20～38歲，平均（27.48±7.83）歲。實驗方案獲得了本院倫理委員會的批準，所有志愿者均簽署知情同意書。志愿者術(shù)前查體，排除肝炎、性病、艾滋病等傳染性疾病;術(shù)中取俯臥位，暴露雙側(cè)髂后上棘，消毒，鋪巾，以利多卡因20 mL局部麻醉，利用骨穿刺針采集志愿者的新鮮骨髓，按照1∶3體積比加入含0.01 mol/L胎牛血清、100 kU/L青霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液，充分混勻后，移入25 cm2的Hank培養(yǎng)瓶中，采用差速培養(yǎng)法培養(yǎng)，3 d后去掉培養(yǎng)瓶中的油脂等雜質(zhì)，之后每3 d換1次細胞培養(yǎng)液。BMSCs細胞融合率達70%～80%后進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2BMSCs的鑒定采用流式細胞儀檢測第2代BMSCs表面蛋白CD29、CD44、CD71、CD90和CD106的表達;采用倒置光學顯微鏡觀察BMSCs的細胞形態(tài)。

1.2.3慢病毒Slit2過表達載體構(gòu)建慢病毒Slit2過表達載體由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司合成，選擇pHBLV`-U6`-ZsGreen`-PGK`-Puro作為質(zhì)?？寺≥d體。慢病毒Slit2過表達載體克隆切入點為XhoI/BamHI，編號為ENST00000005893。

1.2.4慢病毒細胞轉(zhuǎn)染和實驗分組取第3代BMSCs進行實驗。將細胞接種到6孔板，待細胞融合率為50%時進行慢病毒轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染說明書，MOI=50，慢病毒滴度為3×107。將BMSCs細胞分成3組?？瞻讓φ战M：未轉(zhuǎn)染慢病毒;空白載體慢病毒組：轉(zhuǎn)染不含Slit2過表達載體慢病毒;Slit2過表達載體慢病毒組：轉(zhuǎn)染Slit2過表達載體慢病毒。

1.2.5實時熒光定量PCR（RFPCR）檢測神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)（GFAP）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）mRNA表達3組細胞融合率達80%，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后放入15 mL離心管中，加入1 mL的Trizol RNA iso（Takara，日本），利用Trizol萃取法，提取總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄目的RNA，將得到的cDNA保存在-80 ℃冰箱中。根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明書要求，反應(yīng)體系為25 μL，內(nèi)含：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×） 12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L） 1.0 μL， PCR Reverse Primer（10 μmol/L） 1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。應(yīng)用FS 2000系統(tǒng)PCR儀器對25 μL的反應(yīng)體系進行分析，采用兩步法PCR反應(yīng)程序，反應(yīng)時間選擇120 min;其中預(yù)變性：95 ℃、30 s;Circle 1：95 ℃、30 s;Circle 2：60 ℃、30 s;溶解曲線：95 ℃、5 s， 60 ℃ 1 min;降溫： 50 ℃、30 s。記錄各樣本的CT值。內(nèi)參基因引物由上海生工公司合成。見表1。用2-△△CT法計算GAPDH、GFAP和NSE的相對表達量。

1.2.6Western`-blot檢測GFAP和NSE的相對蛋白表達水平3組細胞處理后，分別加入RIPA細胞裂解液1 mL，在冰上裂解30 min，收集入1.5 mL的離心管中，在4 ℃預(yù)冷的離心機中離心（5 000 r/min，5 min），提取上清，經(jīng)95 ℃煮沸后，收集蛋白備用。制備濃縮膠10 mL，分離膠20 mL。上樣后電泳分離，轉(zhuǎn)膜后在4 ℃冰箱中避光孵育過夜（>12 h）。GFAP和NSE小鼠抗人一抗（Abcam公司）1∶10 000稀釋后加入樣本離子膜;第2天用PBST稀釋液洗膜，重復(fù)3次，用山羊抗小鼠IgG二抗（碧云天公司）1∶1 000稀釋后孵育1.5 h，使用PBST稀釋液洗膜，重復(fù)3次，然后用DAB顯影液進行顯影。應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.3統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料結(jié)果以±s形式表示。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。

2結(jié)果

2.1人BMSCs的培養(yǎng)和鑒定

接種48 h后，原代BMSCs開始貼壁，細胞呈梭

2期劉文忠，等. Slit2促進干細胞向神經(jīng)細胞分化的作用139

形或者多角形;培養(yǎng)至第2代細胞呈旋渦狀或者輻射狀生長，細胞增殖迅速。流式細胞儀檢測顯示，第2代BMSCs表面蛋白CD44和CD29表達率分別為60.2%和58.3%，CD34和CD45表達率分別為3.4%和2.6%。

2.2慢病毒介導Slit2過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs

結(jié)果顯示，慢病毒的轉(zhuǎn)染效率較高，為90%以上，可以在最大程度上發(fā)揮Slit2的過表達作用。

2.3各組GFAP、NSE mRNA和蛋白表達比較

空白對照組、空載體病毒組和過表達載體病毒組的GRAP、NSE mRNA水平和蛋白表達量比較差異有統(tǒng)計學意義（F=9.089～13.893，P<0.05），其中空載體病毒組和空白對照組比較差異無顯著性（P>0.05）;過表達載體病毒組和空載體病毒組相比較，差異均有統(tǒng)計學意義（q=2.001～3.897，P<0.05）。見表2。

3討論

近年來，隨著交通事故的多發(fā)，在交通事故中發(fā)生的神經(jīng)損傷和脊髓損傷比較常見[10`-12]，而針對神經(jīng)損傷的治療一直是臨床上的難點[13]。BMSCs具有多分化潛能，最近有研究表明，BMSCs可以分化成神經(jīng)細胞[14`-18]。在神經(jīng)導向因子Slit2的刺激下，BMSCs可轉(zhuǎn)化成神經(jīng)細胞，但是效率不高[19`-20]。本研究利用基因過表達技術(shù)，構(gòu)建Slit2的過表達載體，再利用高轉(zhuǎn)染效率的慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，探討B(tài)MSCs向神經(jīng)細胞高效率轉(zhuǎn)化的實驗方法，為臨床上神經(jīng)損傷和脊髓損傷提供種子細胞。

Slit2是神經(jīng)發(fā)育過程中引起神經(jīng)細胞生長的神經(jīng)導向因子[21]。有研究結(jié)果表明，Slit2通過濃度梯度來介導神經(jīng)細胞的遷移和生長，對神經(jīng)細胞的生長起排斥性導向作用，同時還可促進感覺神經(jīng)細胞的神經(jīng)纖維分支形成[22`-24]。提示神經(jīng)生長因子可以促進神經(jīng)元譜系細胞的分化[25]。本研究應(yīng)用基因過表達技術(shù)構(gòu)建Slit2過表達載體，應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，結(jié)果顯示，慢病毒的轉(zhuǎn)染效率較高，為90%以上，可以最大程度發(fā)揮Slit2的過表達作用。

GFAP和NSE均是神經(jīng)細胞的標識蛋白，其中GFAP是星形膠質(zhì)細胞活化的標志物，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細胞，參與細胞骨架的構(gòu)成并維持其張力強度[26`-27]。血清NSE是神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞所特有的一種酸性蛋白酶[28]。本研究選用以上兩種神經(jīng)細胞的特異性標志物，采用RT`-PCR和Western`-blot的實驗方法，從基因和蛋白兩個層面上檢測空白對照組、空載體病毒組和過表達載體病毒組的GRAP和NSE的表達水平，結(jié)果顯示，過表達載體病毒組GRAP和NSE基因和蛋白的表達水平均明顯高于空載體病毒組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義。從而可以證明從基因水平上將Slit2的過表達載體通過慢病毒介導的方法轉(zhuǎn)染BMSCs，可以提高BMSCs向神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)化效率，故而神經(jīng)細胞的標記物GFAP和NES的表達量明顯增高。

綜上所述，Slit2過表達質(zhì)粒可以提高BMSCs向神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)化的效率，為臨床上神經(jīng)損傷和脊髓損傷治療提供種子細胞。

[參考文獻]

[1]吳剛，童培建. 補腎活血湯含藥血清干預(yù)體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨分化及補腎活血湯聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞治療大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的實驗研究[J]. ?中醫(yī)正骨， ?2018，30（1）：6`-11.

[2]亓俊華，吳梅，徐祥，等. TNF`-α對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞免疫抑制作用影響[J]. ?青島大學醫(yī)學院學報， 2015，51（2）：169`-171，174.

[3]趙芳英，高秀秋，劉姊鳳. Wnt3a對人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響及機制研究[J]. ?中國醫(yī)科大學學報， 2018，47（7）：617`-621.

[4]盧志偉，王磊，張利英，等. 黃芪多糖對電離輻射骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)分化潛能的影響[J]. ?中國藥理學通報， 2017，33（7）：950`-955.

[5]杜佳蕾，張曦元，萬娜，等. 體外誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)干細胞分化的研究進展[J]. ?中西醫(yī)結(jié)合心血管病電子雜志， 2017，5（27）：32`-33.

[6]彭韜，高水超，周媛，等. 骨髓間充質(zhì)干細胞治療感音神經(jīng)性耳聾相關(guān)實驗技術(shù)體系建設(shè)概要[J]. ?中華耳科學雜志， 2017，15（3）：350`-356.

[7]周玉云，王曉鶴，黃曉慧，等. 缺氧、缺血誘導培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞及對Slit2表達的影響[J]. ?生物醫(yī)學工程與臨床， 2017，21（2）：189`-194.

[8]蔣萊，張津?qū)帲裨?，? 神經(jīng)遷移蛋白Slit2與骨髓間充質(zhì)干細胞及血管再生的關(guān)系[J]. ?中國組織工程研究， 2014，18（37）：6034`-6039.

[9]柴源，蔣萊，周玉云，等. 神經(jīng)導向因子Slit2修飾骨髓間充質(zhì)干

140青島大學學報（醫(yī)學版）55卷

細胞的表達研究[J]. ?中風與神經(jīng)疾病雜志， 2015，32（12）：1084`-1088.

[10]李華南，張海明，顧兵，等. 針刺促進脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的機制及相關(guān)信號通路的作用[J]. ?中國康復(fù)理論與實踐， 2017，23（6）：641`-644.

[11]李曉寧，梁雪松，遲蕾，等. 夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍對大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)細胞凋亡表達的實驗研究[J]. ?中醫(yī)藥信息， 2017，34（1）：92`-95.

[12]郝麗霞，張琰，劉帥，等. 低頻電刺激結(jié)合康復(fù)訓練治療脊髓損傷神經(jīng)源性膀胱患者療效觀察[J]. ?中國臨床研究， 2017，30（1）：116`-119.

[13]張朋，陳勇忠，王金星，等. 鹽酸氨溴索聯(lián)合大劑量甲基強的松龍沖擊治療促進胸腰椎骨折合并脊髓損傷術(shù)后神經(jīng)功能恢復(fù)作用的初步探討[J]. ?中國臨床藥理學與治療學， 2017，22（8）：937`-942.

[14]劉嘉婧，曹寧，翟晶磊，等. 骨髓間充質(zhì)干細胞對岡田酸致神經(jīng)細胞損傷的修復(fù)作用[J]. ?解放軍醫(yī)學雜志， 2017，42（5）：377`-382.

[15]盧志偉，王磊，張利英，等. 黃芪多糖對電離輻射骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)分化潛能的影響[J]. ?中國藥理學通報， 2017，33（7）：950`-955.

[16]張廣宇，賈延劼，王軍，等. 氯化鋰通過調(diào)節(jié)自噬通路促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化[J]. ?中國病理生理雜志， 2017，33（12）：2128`-2133.

[17]畢佳佳，王磊，李靜，等. 神經(jīng)細胞黏附分子對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞黏附、遷移及細胞形態(tài)的影響[J]. ?基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床， 2017，37（8）：1082`-1087.

[18]黃鑫，劉宇，盧宏. 化學方法體外誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成神經(jīng)樣細胞分化[J]. ?生物技術(shù)通訊， 2017，28（6）：793`-797.

[19]馮燁軍，陳明. 骨髓間充質(zhì)干細胞在神經(jīng)修復(fù)中的研究進展[J]. ?神經(jīng)損傷與功能重建， 2016，11（5）：426`-428.

[20]王靜，趙紹云，李明哲， 等. Let`-7c慢病毒載體對骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化為神經(jīng)細胞的影響[J]. ?中國組織工程研究， 2016，20（1）：20`-25.

[21]葛士坤，王晴楠，張凱照，等. BALB/c小鼠SLIT2和ROBO4基因組織特異性表達與分布的研究[J]. ?中國獸醫(yī)科學， 2018（1）：87`-92.

[22]孫文波，張立民，康立娜，等. HIF`-1α在七氟醚預(yù)處理減輕大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡中的作用：與Slit2Robo信號通路的關(guān)系[J]. ?中華麻醉學雜志， 2015，35（5）：550`-554.

[23]肖衛(wèi)東，易成臘，陳安民，等. 神經(jīng)生長導向因子Slit2在成年大鼠急性脊髓損傷后的表達[J]. ?中華實驗外科雜志， 2006，23（8）：987`-989.

[24]黃素素，張云云，孫波，等. 大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪后Slit2、Robo1的表達研究[J]. ?中風與神經(jīng)疾病雜志， 2012，29（1）：4`-8.

[25]葛曉娜，王銳，付錦. Slit2在部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究[J]. ?腦與神經(jīng)疾病雜志， 2017，25（5）：317`-319.

[26]王健萍. 不同病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞凋亡及其GFAP和VEGF的動態(tài)表達[J]. ?疾病監(jiān)測與控制， 2017，11（7）：522`-523.

[27]陳京，余偉華，李付貴. 神經(jīng)干細胞神經(jīng)分化示蹤中GFAP啟動子驅(qū)動熒光報告系統(tǒng)的價值[J]. ?中國組織工程研究， 2017，21（21）：3370`-3375.

[28]羅輝，李東金，肖喻，等. 帶狀皰疹病人血清NSE水平及與疼痛的相關(guān)性研究[J]. ?中國疼痛醫(yī)學雜志， 2017，23（7）：538`-540.